Aus der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

Das Renin-Angiotensin-System
in menschlicher Haut

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von
Tanja Wollschläger

aus Berlin

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. B. M. Henz
2. Priv.-Doz. Dr. med. B. Hermes
3. Priv.-Doz. Dr. med. M. Böhm

Einreichungsdatum: 29.September 2005

Datum der Promotion:7. April 2006

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Das Renin-Angiotensin-System
    • 1.1.1  Historisches
    • 1.1.2 Die Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems
      • 1.1.2.1 Angiotensinogen
        • 1.1.2.1.1 Angiotensinogen-Gene
        • 1.1.2.1.2 Proteinstruktur des Angiotensinogens
        • 1.1.2.1.3 Biosynthese des Angiotensinogens
        • 1.1.2.1.4 Regulation der Angiotensinogen-Freisetzung
  • 1.2 Renin (EC 3.4.23.15)
    • 1.2.1  Renin-Gene
      • 1.2.1.1 Proteinstruktur des Renins
      • 1.2.1.2 Biosynthese von Renin
      • 1.2.1.3 Regulation der Renin-Freisetzung
        • 1.2.1.3.1 Intrarenale Mechanismen
        • 1.2.1.3.2 Sympathische Mechanismen
        • 1.2.1.3.3 Humorale Mechanismen
  • 1.3 Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) (EC 3.4.15.1)
    • 1.3.1  ACE-Gene
    • 1.3.2 Proteinstruktur des ACE
    • 1.3.3 Lokalisation von ACE
    • 1.3.4 ACE 2
    • 1.3.5 Metabolisierung von Angiotensinpeptiden
    • 1.3.6 Angiotensin-Rezeptoren
      • 1.3.6.1 Verteilung der Angiotensin-Rezeptoren im Gewebe
      • 1.3.6.2 AT₁-Rezeptoren
        • 1.3.6.2.1 Signaltransduktion des AT₁-Rezeptors
        • 1.3.6.2.2 Funktionelle Bedeutung des AT₁-Rezeptors
      • 1.3.6.3 AT₂-Rezeptoren
        • 1.3.6.3.1 Signaltransduktion des AT₂-Rezeptors
        • 1.3.6.3.2 Funktionelle Bedeutung des AT₂-Rezeptors
  • 1.4 Die Haut
    • 1.4.1  Funktionelle Morphologie
    • 1.4.2 Epidermis (Oberhaut)
    • 1.4.3 Dermis (Korium, Lederhaut)
    • 1.4.4 Subkutis (Unterhautfettgewebe)
  • 1.5 Kutane Zellen
    • 1.5.1  Keratinozyten
    • 1.5.2 Melanozyten
    • 1.5.3 Dermale Fibroblasten
    • 1.5.4 Mikrovaskuläre Endothelzellen (MVECs)
  • 1.6 In dieser Arbeit untersuchte Dermatosen
    • 1.6.1  Psoriasis vulgaris
    • 1.6.2 Neoplasien
      • 1.6.2.1 Basaliom
      • 1.6.2.2 Spinaliom (Plattenepithelkarzinom, spinozelluläres Karzinom)
  • 1.7 Das Renin-Angiotensin-System in der Haut
• 2 Fragestellung und Zielsetzung
• 3 Material und Methoden
  • 3.1  Material
    • 3.1.1  Hautbiopsien
    • 3.1.2 Antikörper
  • 3.2 Methoden
    • 3.2.1  Zellkulturen
      • 3.2.1.1 Feeder Layer Zellen
      • 3.2.1.2 Keratinozyten
      • 3.2.1.3 Melanozyten
      • 3.2.1.4 Dermale Fibroblasten
      • 3.2.1.5 Dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (MVECs)
    • 3.2.2 Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)
      • 3.2.2.1 Prinzip der RT-PCR
      • 3.2.2.2 Primer bei der RT-PCR
      • 3.2.2.3 Durchführung der RT-PCR
    • 3.2.3 Angiotensin II enzymatisches immunometrisches Assay (EIA)
      • 3.2.3.1 Vorbereitung der Keratinozyten-Kulturen
      • 3.2.3.2 Extraktion des Angiotensin II aus Zellhomogenaten
      • 3.2.3.3 Vorbereitung der EIA Reagenzien
      • 3.2.3.4 Inkubation und Waschen der Platten
    • 3.2.4 Einbettung von Hautbiopsien
    • 3.2.5 Herstellung von Gefrierschnitten
    • 3.2.6 Alkalische Phosphatase – Anti - Alkalische Phosphatase (APAAP)
      • 3.2.6.1 Prinzip der APAAP – Technik
    • 3.2.7 Versuchsablauf
      • 3.2.7.1 Vorbereitung
      • 3.2.7.2 Inkubation mit dem Primär-Antikörper
      • 3.2.7.3 Spülung der Gewebeschnitte in TBS
      • 3.2.7.4 Zwischeninkubation bei polyklonalen Antikörpern
      • 3.2.7.5 Inkubation mit dem Brückenantikörper
      • 3.2.7.6 Inkubation mit dem APAAP-Komplex
      • 3.2.7.7 Wiederholte Inkubation mit Brückenantikörper und APAAP-Komplex
      • 3.2.7.8 Färbung in hexazotierter Astraneufuchsin-Entwicklungslösung
      • 3.2.7.9 Gegenfärbung mit Mayer`s saurem Hämalaun
      • 3.2.7.10 Eindecken
    • 3.2.8 Stammlösungen
    • 3.2.9 Titerbestimmungen
• 4 Auswertung
  • 4.1  Nachweis der RAS-Komponenten mittels RT-PCR
    • 4.1.1  Angiotensinogen, Renin und Angiotensin-Converting-Enzym
      • 4.1.1.1 Angiotensinogen
      • 4.1.1.2 Renin
      • 4.1.1.3 Angiotensin-Converting-Enzym
    • 4.1.2 Angiotensin-Rezeptoren
      • 4.1.2.1 AT₁-Rezeptor
      • 4.1.2.2 AT₂-Rezeptor
  • 4.2 Angiotensin II Synthese durch Keratinozyten
  • 4.3 Nachweis der RAS-Komponenten mittels immunhistochemischer Färbungen
    • 4.3.1  Angiotensinogen, Renin und Angiotensin-Converting-Enzym
      • 4.3.1.1 Angiotensinogen
      • 4.3.1.2 Renin
      • 4.3.1.3 Angiotensin-Converting-Enzym
    • 4.3.2 Angiotensin-Rezeptoren
      • 4.3.2.1 AT₁-Rezeptor
      • 4.3.2.2 AT₂-Rezeptor
  • 4.4  RAS-Komponenten in pathologisch veränderter Haut
    • 4.4.1  Psoriasis vulgaris
      • 4.4.1.1 Angiotensinogen
      • 4.4.1.2 Renin
      • 4.4.1.3 Angiotensin-Converting-Enzym
  • 4.5  Tumorerkrankungen der Haut - Basaliom
    • 4.5.1  Angiotensinogen
    • 4.5.2 Renin
    • 4.5.3 Angiotensin-Converting-Enzym
  • 4.6 Tumorerkrankungen der Haut - Spinaliom
    • 4.6.1  Angiotensinogen
    • 4.6.2 Renin
    • 4.6.3 Angiotensin-Converting-Enzym
• 5 Diskussion
  • 5.1  Nachweis der RAS-Komponenten
  • 5.2  Angiotensin II Synthese durch Keratinozyten
  • 5.3  Mögliche physiologische Bedeutung des kutanen RAS
  • 5.4  Mögliche pathophysiologische Bedeutung des kutanen RAS
  • 5.5  Expression der RAS-Komponenten bei Psoriasis vulgaris
  • 5.6  Expression der RAS-Komponenten beim Basaliom
  • 5.7  Expression der RAS-Komponenten beim Spinaliom
• 6 Zusammenfassung
• Erklärung
• Literaturliste
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Beeinflussung des Plasma-Angiotensinogenspiegels
• Tabelle 2: Beeinflussung des Plasma-Reninspiegels
• Tabelle 3: Verteilung der Angiotensin-Rezeptoren beim Menschen
• Tabelle 4: Herstellernachweis der verwendeten Materialien
• Tabelle 5: Benutzte Antikörper und ihre Subklassen, Spezifitäten und Hersteller
• Tabelle 6: Benutzte Primer mit Sequenz, Länge und Zyklenzahl
• Tabelle 7: Endverdünnung der Primärantikörper
• Tabelle 8: Synthese von Ang II in Keratinozyten; angegeben sind jeweils drei unabhängige Messwerte, der Mittelwert sowie die Standardabweichung; Einheit: pg/ml

Bilder

• Abbildung 1: Das Renin Angiotensin System
• Abbildung 2: Morphologie der Haut aus www.essentialdayspa.com/Skin_Anathomy_and_Physiology.htm, gezeichnet von dem Künstler F. Netter
• Abbildung 3: Beispiel Plattenformat
• Abbildung 4: Schematische Darstellung der APAAP Technik
• Abbildung 5: Schematisches Diagramm der amplifizierten APPAP Technik
• Abbildung 6: Angiotensinogen mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)
• Abbildung 7: Renin mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)
• Abbildung 8: ACE mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)
• Abbildung 9: AT₁ mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)
• Abbildung 10: AT₂ mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)
• Abbildung 11: Synthese von Ang II in Keratinozyten
• Abbildung 12: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt acht untersuchten.
• Abbildung 13: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 25µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt acht untersuchten Präparaten.
• Abbildung 14: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt acht untersuchten. S=Schweißdrüsen, G=Gefäßwand.
• Abbildung 15: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ACE; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt acht untersuchten.
• Abbildung 16: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem polyklonalen Antikörper gegen den humanen AT₁ Rezeptor; scale bar 20µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt fünf untersuchten Präparaten.
• Abbildung 17: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem polyklonalen Antikörper gegen den humanen AT₂ Rezeptor; scale bar 20µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt fünf untersuchten. G=Gefäßwand.
• Abbildung 18: Immunhistochemische Färbung von psoriatisch veränderter Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt sieben untersuchten Präparaten. P=Papillenspitze.
• Abbildung 19: Immunhistochemische Färbung von psoriatisch veränderter Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt sieben untersuchten Präparaten.
• Abbildung 20: Immunhistochemische Färbung von psoriatisch veränderter Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 50µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt sieben untersuchten.
• Abbildung 21: Immunhistochemische Färbung von psoriatisch veränderter Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ACE; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt sieben untersuchten Präparaten.
• Abbildung 22: Immunhistochemische Färbung eines Basalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt elf untersuchten Präparaten. R=Randbetonung.
• Abbildung 23: Immunhistochemische Färbung eines Basalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt elf untersuchten.
• Abbildung 24: Immunhistochemische Färbung eines Basalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ACE; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt elf untersuchten Präparaten.
• Abbildung 25: Immunhistochemische Färbung eines Spinalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt neun untersuchten Präparaten.
• Abbildung 26: Immunhistochemische Färbung eines Spinalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 200µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt neun untersuchten Präparaten.
• Abbildung 27: Immunhistochemische Färbung eines Spinalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ACE; scale bar 200µm (a) bzw. scale bar 100µm (b). Die Abb. zeigen ein repräsentatives von insgesamt neun untersuchten Präparaten. G=Gefäßwand.