3 Material und Methoden

3.1  Material

↓36

Tabelle 4: Herstellernachweis der verwendeten Materialien

Verwendete Materialien

Hersteller

AB-Serum

Behring, Marburg, Deutschland

Abzug (Hyperclean)

Shandon, England

ACE-Hemmer

Sigma, Deisenhofen, Deutschland

Aceton

Merck, Darmstadt, Deutschland

Adenine: 1,8*10-4 M

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Agarosegel: Agarose Electrophoresis Grade

Gibco BRL Life Technolgy, Eggenstein, Deutschland

Aluminiumkaliumsulfat-Dodecahydrat

Merck, Darmstadt, Deutschland

2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol

Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, Deutschland

3-Aminopropyltrietoxy-silane

Sigma, Deideshofen, Deutschland

APAAP mouse monoklonal

DAKO, Glostrup, Dänemark

Aqua destillata

Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

Brutschrank: CO2-Auto-Zero

Heraeus Holding GmbH, Osterode/Harz, Deutschland

cDNA-Synthesis Kit

Roche Diagnostik GmbH, Mannheim, Deutschland

Centrifuge 5402, 14.000U/min

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Chloralhydrat

Merck, Darmstadt, Deutschland

Choleratoxin (10-10 M)

Calbiochem, Schwalbach, Deutschland

Citronensäure-Monohydrat

Merck, Darmstadt, Deutschland

Deckgläser

Menzel, Braunschweig, Deutschland

Dispase

Boehringer, Mannheim, Deutschland

Verwendete Materialien

Hersteller

DMEM Medium (angereichert mit 5% fetalem Kälberserum)

Biochrom, Berlin, Deutschland

DNAse

Qiagen, Hilden, Deutschland

Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline w/o Sodium Bicarbonate

Gibco, Grand-Island, USA

Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline w/o Calcium and Magnesium, w/o Sodium Bicarbonate

Gibco, Grand-Island, USA

ECGF

Sigma, Deideshofen, Deutschland

EIA-Reagenzien

Cayman Chemical, Michigan, USA

Essigsäure 100%

Merck, Darmstadt, Deutschland

Ethanol 100%

Merck, Darmstadt, Deutschland

FAD Medium

Biochrom, Berlin, Deutschland

Faltenfilter

Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Fetales Kälberserum

Biochrom, Berlin, Deutschland

Gelkammer: Horizon 11.14

Gibco BRL Life Technology, Eggenstein, Deutschland

GeneAmp PCR System 2400

Perkin Elmer, Massachussetts, USA

Hämatoxylin

Merck, Darmstadt, Deutschland

Hydrocortison (0,5µg/ml)

Sigma, Deideshofen, Deutschland

IL 6

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Insulin (5µg/ml)

Sigma, Deisenhofen, Deutschland

Kaisers Glyceringelatine

Merck, Darmstadt, Deutschland

Kamera: Polaroid Quick Shooter, Modell QSR

Kodak Company, Cambridge, USA

Kollagenase Typ 4

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Kryomatrix

Tissue Tek, O.C.T., USA

Küvette

Assistent, Sodheim/Rhön, Deutschland

Levamisole

Sigma, Deideshofen, Deutschland

L-Glutamin

Biochrom, Berlin, Deutschland

Lyse-Puffer „Buffer RLT“

RNEasy Kit, Qiagen, Chatsworth, CA, USA

Master Mix

Boehringer, Mannheim, Deutschland

Verwendete Materialien

Hersteller

MEM-nicht essentielle Aminosäuren

Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland

2-Mercaptoethanol

Sigma Chemical Company, St.Louis, MO, USA

Mikroskop

Carl-Zeiss, Jena, Deutschland

Mikrotiter-Platten-Messpektrometer

Dynatech, Chantilly, VA, USA

Mikrowelle: Mikromat

AEG, Berlin, Deutschland

Minifuge RF, r=14,09cm, 1200U/min

Heraeus Sepatech, Osterode/ Harz, Deutschland

Mitomycin-C

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Naphtol AS-BI Phosphoric Acid

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Natriumchlorid

Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumjodat

Merck, Darmstadt, Deutschland

Natriumnitrit

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Natriumpyruvat (1mM)

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Neubauer-Zählkammer: 0,1mm, Fläche 9mm2

Rudolf Brand GmbH & Co, Wertheim, Deutschland

Neufuchsin

Merck, Darmstadt, Deutschland

N,N-Dimethylformamid

Merck, Darmstadt, Deutschland

PAP-Pen

Science Services, München, Deutschland

PBS

Gibco BRL Life Technology, Eggenstein, Deutschland

PCR-Puffer

Perkin Elmer, Langen, Deutschland

PCR-Reaktionsgefäße

Perkin Elmer, Norwalk, USA

Peptid-spezifische Säulen

Waters, Massachusetts, USA-

Petrischale (Kollagen A bedeckt)

Greiner, Frickenhausen, Deutschland

Pipetten und -spitzen

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Puffer (MgCl2, KCl, RNAsin, deoxyNTP, random primers, M-MVL Reverse Transcriptase)

Gibco BRL Life Technology, Eggenstein, Deutschland

QIA-shredder Säule

Qiagen, Hilden, Deutschland

Verwendete Materialien

Hersteller

Rabbit anti-mouse Immunglobulin

DAKO, Glostrup, Dänemark

Reverse Transcriptase Superscript

Gibco BRL Life Technology, Eggenstein, Deutschland

Rinderserum

Biochrom, Berlin, Deutschland

RNase Inhibitor

Boehringer, Mannheim, Deutschland

Rneasy Kit

Qiagen, Valencia,USA

RPE-Puffer

Qiagen, Hilden, Deutschland

RPMI 1640 without L-Glutamine

Gibco, Grand-Island, USA

RT-Puffer

Gibco BRL Life Technology, Eggenstein, Deutschland

RW1-Puffer

Qiagen, Hilden, Deutschland

Safe lock Reaktionsgefäße

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Spin Phase Lock tubes

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Sterilbank, Mikrobiologische Sicherheitskabine

Karl Bleymehl, Reinraumtechnik GmbH, Berlin, Deutschland

3T3 Zellen

F.Watt. ICRF, London, England

TAE Puffer

Selbstansatz: 242g Tris Base, 57,1ml Essigsäure, 100ml 0,5M EDTA (pH 8,0) auf 1000ml Aqua bidest.

Taq DNA Polymerase, native

Perkin Elmer, Langen, Deutschland

TGF ß

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Thermocycler 60

Bio-med Labordiagnostik GmbH, Oberschleißheim, Deutschland

Tissue Tec (OCT-Compound)

Sakura, Zoeterwoude, Niederlande

TNFa

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Tris-Base

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Tris-HCL

Sigma, Deideshofen, Deutschland

Trypanblau

Sigma, Deisenhofen, Deutschland

Trypsin EDTA

Biochrom/Seromed, Berlin, Deutschland

Ultraschall-Homogenisator

Branson Ultrasonic Corp, Danbury, USA

Verwendete Materialien

Hersteller

Waage: MA AF 200

Sartorius GmbH, Göttingen, Deutschland

Wasserbäder: MS/M6 Lauda

MS Laborgeräte, Wiesloch, Deutschland

Zellschaber

Renner GmbH, Dannstadt, Deutschland

Zentrifugenröhrchen

Falcon, Heidelberg, Deutschland

3.1.1  Hautbiopsien

Als Versuchsmaterial dienten 35 Hautbiopsien aus der Gewebebank der Klinik für Dermatologie und Allergologie, Charité, Universitätsmedizin-Berlin. Die Biopsien wurden zu diagnostischen oder kurativen Zwecken nach Einholen des schriftlichen Einverständnisses der Patienten entnommen. Dabei handelte es sich um: 7 x Psoriasis, 11 x Basaliom und 9 x Spinaliom. Für die Kontrollgruppe wurden Biopsien gesunder Haut von 8 Patienten herangezogen.

3.1.2 Antikörper

Der benutzte Antikörper MAB 4051 ist spezifisch gegen ACE (N-terminal) und von Chemicon International Inc., Temecula, CA entwickelt. Es handelt sich um einen monoklonalen Maus-Anti-ACE-Antikörper vom Isotyp IgG1. Anwendung findet er in der Immunhistochemie, Immunzytochemie, bei Immunoblot, Immunpräzipitation und ELISA.

↓37

Auch die Darstellung mit Maus-Anti-ACE-Antikörper MAB 4055 und MAB 4056 wurde initial versucht, aber wegen unbefriedigender Ergebnisse wieder aufgegeben.

Die Antikörper Anti-Angiotensinogen (VH-68), -Renin 2 und -Renin 3 wurden freundlicherweise von J. Peters und U. Hilgenfeldt, Institut für Pharmakologie, Universität Heidelberg, zur Verfügung gestellt. Es handelt sich bei VH-68 um einen Kaninchen-Antikörper vom Isotyp IgG1.und bei den Renin-Antikörpern um polyklonale Kaninchen-Antikörper.

Die polyklonalen Antikörper Anti- AT1-/ AT2-Rezeptor wurden von Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA entwickelt und sind vom Isotyp IgG.

↓38

Tabelle 5: Benutzte Antikörper und ihre Subklassen, Spezifitäten und Hersteller

Antikörper Anti-

Subklasse

Spezifität

Hersteller

ACE (MAB 4051)

IgG1

ACE (N-terminal) von Menschen, Affen, Ratten, Hamster und Katzen

Chemicon International Inc., Temecula, CA

ACE (MAB 4055)

IgG1

ACE (N-terminal) von Menschen und Affen

Chemicon International Inc., Temecula, CA

ACE (MAB 4056)

IgG1

ACE (N-terminal) von Menschen

Chemicon International Inc., Temecula, CA

Angiotensinogen (VH-68-8)

IgG1

Humanes Angiotensinogen

Peters J, Hilgenfeldt U, Institut für Pharmakologie, Universität Heidelberg

Renin (Renin 2)

IgG1

Humanes Renin

Peters J, Hilgenfeldt U, Institut für Pharmakologie, Universität Heidelberg

Renin (Renin 3)

IgG1

Humanes Renin

Peters J, Hilgenfeldt U, Institut für Pharmakologie, Universität Heidelberg

AT1-Rezeptor

IgG

Humaner AT1-Rezeptor

Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA

AT2-Rezeptor

IgG

Humaner AT2-Rezeptor

Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA

3.2 Methoden

3.2.1  Zellkulturen

3.2.1.1 Feeder Layer Zellen

Für optimale Wachstumsbedingungen wurden die Keratinozyten auf einem Feeder Layer aus 3T3 Maus-Fibroblasten (J2 Klone) kultiviert. Diese Zellen wurden in DMEM Medium unter Zusatz von 100 IU/ml Penicillin, 100 µg Streptomycin und 10 % FCS kultiviert und einmal wöchentlich im Verhältnis 1:10 geteilt. Wegen der spontanen Transformation und Alterung der 3T3 Zellen wurden alle drei Monate die alten Zellen verworfen und durch neue aus niedriger Passage ersetzt. Vor der Verwendung als Feeder-Layer wurde die Proliferation der konfluenten 3T3 Zellen durch zweistündige Inkubation mit Mitomycin C (4µg/ml) inhibiert. Anschließend folgte die Auslösung aus den Kulturflaschen mit Trypsin-EDTA, die Teilung im Verhältnis 1:3 und die Neuausssaat. Am Folgetag wurden die Keratinozyten auf die so generierten Feeder-Layer aufgebracht.

3.2.1.2 Keratinozyten

Die humanen Keratinozyten wurden nach Aufklärung und Einverständniserklärung der Eltern aus den Präputien von 14 Tage bis 10 Jahre alten Kindern nach Circumcision aus medizinischen oder religiösen Gründen gewonnen. Die Hautproben wurden in 70 % -iger Ethanol-Lösung 1 min vorsichtig steril gewaschen und anschließend vom subkutanen Fett befreit. Mit Hilfe eines Skalpells wurden die Hautstücke in schmale Streifen geschnitten und in einer Dispase Lösung (3mg/ml) über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurden die mit Dispase behandelten Hautproben mehrfach in PBS (ohne Ca-und Mg) gewaschen. Mit einer Pinzette wurde die Epidermis vorsichtig von der Dermis getrennt und in einer 0,25 % igen Trypsin Lösung für weitere 15 min bei 37°C inkubiert. Die Keratinozyten wurden über einen 40µm Filter in ein Falcon Röhrchen überführt. Anschließend erfolgte die Inaktivierung des Trypsins mit FCS, und die Keratinozyten wurden nach mehrmaligem Waschen mit PBS in Wachstumsmedium aufgenommen. Mittels Tryptanblaufärbung wurde die Viabilität der Keratinozyten überprüft. Dann wurden die Keratinozyten auf die Mitomcyin C behandelten 3T3 Feeder-Layer mit einer Zelldichte von 5 x 105 Zellen pro 75 cm² ausgesät. Das Wachstumsmedium für die Keratinozyten (FAD-Medium) hatte folgende Zusammensetzung: drei Teile Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) plus ein Teil F12 Medium angereichert mit Adenin (1,8 x 10-4 M), Hydrocortison (0,5 µg/ml), Insulin (5µg/ml), Choleratoxin (10-10 M) und EGF (10mg/ml). Ein Austausch des Wachstumsmediums fand dreimal pro Woche statt. Wenn die Keratinozyten eine Dichte von 70 % erreicht hatten, wurden die 3T3 Feeder Layer Zellen zuerst mit 0.02 % EDTA entfernt und daraufhin der Feeder-Layer anschließend mit Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin; 0.02 % EDTA) abgelöst. Die Keratinozyten wurden im Verhältnis 1:3 geteilt und wieder ausgesät. Für die Versuche wurden ausschließlich Zellen in Passage 3-5 verwendet.

3.2.1.3 Melanozyten

↓39

Die Melanozytenisolierung aus der Epidermis erfolgte nach dem gleichen Schema wie die der Keratinozyten. Für die Kultivierung der Melanozyten sind keine Feeder Layer notwendig. 1 bis 2 x 106 Zellen aus der Keratinozyten-Präparation wurden auf Kollagen beschichtete Petrischalen in einem Volumen von 10 ml eines speziellen Melanozyten–Mediums ausgesät. Durch Zusatz von PMA wurde das Wachstum der gleichzeitig ausgesäten Keratinozyten in den Melanozytenkulturen inhibiert, so dass die Melanozytenkulturen nach zwei Passagen 100% rein waren. Als Kulturmedium wurde ein serumfreies Melanozytenwachstumsmedium verwendet, das mit bovinem Hypophysenextrakt und Phorbolester angereichert war.

3.2.1.4 Dermale Fibroblasten

Für die Isolierung der dermalen Fibroblasten wurde die Haut zuerst über Nacht mit Dispase behandelt. Nach Abtrennung der Epidermis von der Dermis wurde die Dermis mit Hilfe einer Schere in 2-4 mm große Stücke geschnitten und in einer Kollagenase Lösung (10 mg/g Dermis) bei 37 °C unter Schütteln eine Stunde verdaut. Ungelöste Gewebereste wurden durch Filtration über einen 40µm Filter entfernt. Anschließend wurden die so gewonnenen Fibroblasten in DMEM Medium unter Zusatz von Antibiotika und FCS (5%) kultiviert.

3.2.1.5 Dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (MVECs)

Dermale mikrovaskuläre Endothelzellen wurden ebenfalls aus Präputien gewonnen. Die Haut wurde in kleine Stücke geschnitten und in 0.25 % Trypsin/PBS über Nacht bei 4°C inkubiert. Es folgte zweimaliges Waschen der Hautstücke mit PBS und die vorsichtige Trennung der Epidermis von der Dermis. Endothelzellen wurden mit Hilfe eines stumpfen, runden Skalpells vorsichtig aus der Dermis ausgepresst, durch einen 100µm Nylon-Filter in ein Falcon–Röhrchen überführt und 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in DMEM resuspendiert, mit ECGF, 1mM Natriumpyruvat, MEM-nicht essentiellen Aminosäuren sowie Heparin 50U/ml ergänzt und auf Kollagen A bedeckte Petrischalen ausgesät. Nach 10 Minuten wurden die Überstände abgegossen, um die nicht adhärenten Zellen aus den Petrischalen zu entfernen. Anhaftende MVECs wurden in Endothelzellmedium bis zur dritten Passage kultiviert. Durch immunhistochemische Färbungen (Cytospins) mit Antikörpern gegen von-Willebrand Faktor erfolgte eine regelmäßige Kontrolle der Zellreinheit, die immer über 95% erreichte.

3.2.2 Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)

3.2.2.1 Prinzip der RT-PCR

↓40

Die PCR wurde erstmalig 1984/1985 durch Kary B. Mullis, Kalifornien, als Verfahren beschrieben (Saiki et al., 1985). Sie beruht auf dem Doppelstrang-Prinzip der DNA und ermöglicht die Amplifizierung beliebiger DNA-Abschnitte und damit den Nachweis bestimmter Gensequenzen bzw. auch ganzer Gene. Heute ist die RT-PCR das meistverbreitete Verfahren zur Charakterisierung und zum quantitativen Nachweis von mRNA in verschiedenen Proben (Orlando et al., 1998).

3.2.2.2 Primer bei der RT-PCR

Tabelle 6: Benutzte Primer mit Sequenz, Länge und Zyklenzahl

Primer, spez i fisch für-

Sequenz

Länge

Zyklen zahl

ACE

Upstream 5’-AGG TTG AGA CTG DGC AGG TGC TTG G-3’

Downstream 5’-GGA CGC GGA GGA TGT TTA AGG-3’

388 bp

38

Renin

Upstream 5’-ACC TCA AGA CTG GTG TCT GGC-3’

Downstream 5’-CCA ATG CGG TTG TTA CGC CG-3’

426 bp

38

Angiotensinogen

Upstream 5’-AGC CTC ACT ATG CCT CTG ACC TGG-3’

Downstream 5’-TGA CAC ATC GCT GAT TTG TCC G-3’

526 bp

38

AT1-Rezeptor

Upstream 5’-CCC AAA GCT GGA AGG CAT AAT T-3’

Downstream 5’-GAC GCT GGC TGA AGC AAT CTT-3’

270 bp

38

AT2-Rezeptor

Upstream 5’CTG CTG TTG TTC TGG CCT TCA T-3’

Downstream 5’-ACT CTC TCT TTT CCC TTG GAG CC-3’

263 bp

38

3.2.2.3 Durchführung der RT-PCR

Die Isolation der Gesamt-RNA aus den verschiedenen Zelltypen wurde mit dem „RNA Isolation Kit“ der Firma Qiagen durchgeführt.

↓41

Die unterschiedlichen Zellen wurden in 350µl Lyse-Puffer lysiert. Danach wurden die Proben auf eine QIAshredder-Säule (Qiagen) gegeben und bei 14000 U/min 3 min bei 4°C zentrifugiert. Es folgte die Mischung des RNA-haltigen Zentrifugats mit 70% igem Ethanol im Verhältnis 1:1. Anschließend wurde dieses Gemisch auf eine RNeasy spin-Säule gegeben und für 15 Sekunden mit 10000 U/min zentrifugiert. Dadurch wurde die Bindung der RNA an das Säulenmaterial erreicht. Nun folgte die Entfernung der genomischen DNA aus der Säule. Zu diesem Zweck wurde nach dem ersten Waschen mit dem RW1 Puffer 1µl DNAse I in 80 µl DNAse-Puffer auf die Säule gegeben und bei Raumtemperatur 15 min inkubiert. Danach wurde die Säule nochmal mit RW1 und schließlich zweimal mit RPE-Puffer gewaschen. Die Gesamt-RNA wurde aus der Säule mit 30 µl RNAse freiem Wasser eluiert. Eine weitere Reinigung der RNA von der DNAse erfolgte durch eine Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion der Proben. Die Phenol-Phase wurde durch Zentrifugation der Proben über ein Phase-Lock System (Fa. Roche) von der wässrigen Phase quantitativ getrennt. Anschließend wurde RNA aus der wässrigen Phase durch Zugabe von 3 M K-Acetat und ein Co-präzipitations-System isoliert, nach Waschen mit Ethanol getrocknet und in 30 µl Wasser aufgenommen. Die Gesamtmenge der RNA wurde spektrophotometrisch mit einer UV-Absorption bei 260 nm bestimmt. Auf einem mit Ethidiumbromid angefärbten 1.5 % igen-Agarosegel wurde die Qualität der RNA untersucht.

Die Transkription der RNA in cDNA wurde mit dem 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Fa. Roche) für RT-PCR (AMV) wie folgt durchgeführt:

Es wurde ein Mix aus 2.0µl 10x Reaktions-Puffer, 4.0µl 25mM MgCl2, 2.0µl Desoxynukleotid-Mix, 2.0µl Random Primer, 1.0µl RNAse Inhibitor, 0.8 µl Reverse Transkriptase und abhängig von der RNA Konzentration ca. 5µl RNA Proben hergestellt und mit sterilem Wasser auf 20.0µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Die Proben wurden zuerst für 10 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend für 60 Minuten bei 42 °C inkubiert.

↓42

Amplifiziert wurde die cDNA durch PCR in einem Endvolumen von 50µl mit 25 µl Master-Mix und je 2.5µl spezifischen Primern für Gene von ACE, Renin, Angiotensinogen, AT1- und AT2-Rezeptoren. Die PCRs liefen über 38 Zyklen.

Für die PCR von ACE, Renin und Angiotensinogen wurde folgendes PCR-Programm durchgeführt: 5 min 94°C, 38 Zyklen 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 65°C, 45 sec 72°C, anschließend 10 min bei 72°C.

Für die PCR von AT1 und AT2 wurde ein Touch-Down Programm durchgeführt.

↓43

Dabei wurde die Annealing Temperatur bei den ersten zehn Zyklen von 65°C jeweils um ein Grad bis auf 55°C heruntergesetzt und anschließend mit 55°C bei weiteren 28 Zyklen ampfliziert.

3.2.3 Angiotensin II enzymatisches immunometrisches Assay (EIA)

Das Prinzip dieser Bestimmung liegt in der Bindung von aus den Zellen extrahiertem Ang II an Ang II spezifische, monoklonale Antikörper, die an eine 96-Loch-Mikrotiter-Platte gebunden sind. Nach immunologischer Reaktion von Ang II mit dem Antikörper wird der entstandene Komplex kovalent mit Hilfe von Glutaraldehyd über seine Aminogruppen an die Platte vernetzt. Der quantitative Angiotensin-Nachweis erfolgt schließlich spektrophotometrisch (Volland et al., 1999).

Im Einzelnen werden folgende Schritte durchgeführt:

3.2.3.1 Vorbereitung der Keratinozyten-Kulturen

↓44

Vor der Messung einer etwaigen spontanen Angiotensin Synthese der Keratinozyten wurden die Zellen 24 Stunden in serumfreiem Medium kultiviert. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen, mit einem Zellschaber (Renner GmbH, Deutschland) in 1ml PBS von den Kulturschalen abgekratzt und mit einem Ultraschall-Homogenisator (Branson Ultrasonic, USA) homogenisiert. Anschließend wurden die Homogenate zentrifugiert und bei –80°C aufbewahrt. Die Messung der Angiotensinkonzentration erfolgte in den Homogenaten und im Zellkultur-Überstand.

Für die Identifikation möglicher Stimuli der Ang II Synthese in humanen, primären Keratinozyten wurden die Zellen für 24 Stunden mit 2 ng/ml Interleukin-6 (Il-6), 10 ng/ml EGF (epidermal growth factor), 50 pg/ml TNFα (tumor necrosis factor α) oder 50 pg/ml TGFß (transforming growth factor ß) inkubiert. Die Inkubationen erfolgten mit und ohne Zusatz von 10–5 M ACE-Hemmer, um zwischen bereits vorhandenem Ang II und in der Stimulationsphase tatsächlich neu gebildetem Ang II zu unterscheiden.

3.2.3.2 Extraktion des Angiotensin II aus Zellhomogenaten

Zu diesem Zweck wurden die Homogenate in PBS verdünnt und anschließend auf Peptid-spezifische Säulen (Waters, USA) aufgetragen.

↓45

Im einzelnen wurden die Säulen zunächst mit 1 ml Methanol und anschließend mit 1 ml Wasser vorgespült. Dann wurde 1 ml Zellhomogenat auf die Säulen aufgetragen und mit 1 ml Wasser gewaschen. Die Peptide wurden anschließend mit 0,5 ml Methanol von der Säule eluiert. Mit Hilfe einer Vakuum-Zentrifugation erfolgte die Entfernung der Methanolphase, die Probe wurde in 0,5 ml EIA Puffer aufgenommen und bei 3000 g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert.

3.2.3.3 Vorbereitung der EIA Reagenzien

EIA Puffer:
Dem in dem Kit enthaltene Lyophylisat wurden 50 ml destilliertes Wasser hinzugefügt, die Mischung fünf Minuten stehen gelassen und anschließend vorsichtig bis zur kompletten Lösung aller Bestandteile gerührt.

Angiotensin II Standard:
Der im Kit enthaltene Flascheninhalt wurde in 1 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Die Konzentration des Standards betrug 125 pg/ml. Durch weitere Verdünnungen wurde dann folgende Standardreihe hergestellt: 125 pg/ml (S1), 62.5 pg/ml (S2), 31.25 pg/ml (S3), 15.63 pg/ml (S4), 7.81 pg/ml (S5), 3.91 pg/ml (S6), 1.95 pg/ml (S7) und 0.98 (S8) pg/ml.

↓46

Qualititätskontrolle:
Als Qualitätskontrolle wurde eine vorgegebene Konzentration von 2pg/ml Angiotensin II in 1 ml destilliertem Wasser aufgelöst und mitgemessen.

Anti-Angiotensin II IgE:
Anti-Angiotensin II IgE wurde in 10 ml EIA Puffer aufgenommen.

Glutaraldehyd:
100µl Glutaraldehyd wurden mit 5 ml verdünntem Waschpuffer gemischt.

↓47

Boran-Trimethylamin:
Kurz vor Gebrauch wurde Boran-Trimethylamin in 5 ml einer 2N HCl/Methanol (50/50, v/v) Lösung aufgenommen.

Ellman`s Reagenz:
Fünf Minuten vor Gebrauch wurde Ellman`s Reagenz in 1 ml konzentriertem Waschpuffer aufgenommen und anschließend auf 50 ml mit destilliertem Wasser aufgefüllt.

Waschlösung:
2 ml konzentrierter Waschpuffer wurden auf 0.8 l Endvolumen mit Wasser verdünnt und mit 400µl Tween 20 versetzt.

↓48

Plattenvorbereitung:
Vor Gebrauch wurden die Platten mit 300µl Waschpuffer fünfmal gewaschen und die Restflüssigkeit durch Abklopfen der Platten entfernt.

Abbildung 3: Beispiel Plattenformat

Blk : Blank (leer)
NSB : Nicht-Spezifische Bindung
B0 : Maximale Bindung
TA : Total Aktivität
S1-S8 : Standards 1-8
1-24 : Proben oder Qualitätskontrolle

3.2.3.4 Inkubation und Waschen der Platten

Jeweils 100µl Standard und Proben wurden auf die Platten aufgetragen und eine Stunde bei Raumtemperatur unter langsamem Schütteln inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde in jedes Well (außer Blank) 50µl Glutaraldehyd-Lösung gegeben und weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von Boran-Trimethylamin (50 µl pro Well [außer Blank]), und die Proben wurden für weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt.

↓49

Die Platten wurden fünfmal mit Waschpuffer (300µl pro Well) gewaschen und - um die Flüssigkeitsreste zu entfernen - heftig mit der Oberseite nach unten auf Papiertücher geklopft. Nach Zugabe von 100 µl anti-Angiotensin II IgG (außer Blank) wurden die Platten mit einem Parafilm bedeckt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten fünfmal mit Waschpuffer (300µl) gewaschen. Nach dem letzten Waschvorgang wurden in jedes Well nochmals 300µl Waschpuffer hinzugegeben und für weitere fünf Minuten inkubiert.

Nach der Entfernung der Restflüssigkeit wurden jeweils 200 µl Ellman‘s Reagenz in jedes Well hinzugefügt und für weitere 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Platten in einem Mikrotiter-Platten-Messspektrometer (Dynatech, USA) bei 405 nm gemessen. Die Auswertung der Daten erfolgte mit Graph-Prism 2.

3.2.4 Einbettung von Hautbiopsien

Die Exzisate wurden nach Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff im Gefriermikrotom (Kryostat) in Kryomatrix (Tissue Tek, USA) eingebettet und dann bei – 80°C gelagert.

3.2.5 Herstellung von Gefrierschnitten

↓50

Mittels Kryostat wurden von den Hautbiopsien bei etwa –28 °C 4 μm dünne Schnitte angefertigt. Diese Gefrierschnitte wurden dann auf mit Aminosilane-Lösung beschichtete Objektträger aufgebracht, 2 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur luftgetrocknet und anschließend für 10 Minuten bei –20°C in 10% Acetonlösung fixiert. Nach wiederholter Lufttrocknung bei Raumtemperatur wurden sie bis zu ihrer Weiterverarbeitung bei -20°C aufbewahrt.

3.2.6 Alkalische Phosphatase – Anti - Alkalische Phosphatase (APAAP)

3.2.6.1 Prinzip der APAAP – Technik

Diese von Cordell et al. 1984 erstmals beschriebene immunenzymatische Färbemethode nutzt eine Enzym–Substratreaktion, um farblose Chromogene in ein gefärbtes Endprodukt umzuwandeln. Das Enzym Alkalische Phosphatase stammt aus dem Darm von Kälbern.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der APAAP Technik

↓51

Die Primärantikörper gegen die gesuchten Antigene werden mit einem Medium versetzt, welches Rinderalbumin enthält. Dieses lagert sich an elektrisch geladene Gewebselemente an und verhindert so eine Adsorption der Antikörper. Hat der Antikörper an das Antigen gekoppelt, lagert sich der APAAP-Komplex an die Antikörper-Antigen-Verbindung an. Um eine Bindungsstelle des Antikörpers für diesen Maus-APAAP-Komplex freizuhalten, muss Brückenantikörper im Überschuß dazugegeben werden. Eine unspezifische Kreuzreaktion des Brückenantikörpers mit dem humanen Gewebe wird durch humanes AB-Serum verhindert, welches im Verdünnungsmedium für Brückenantikörper und APAAP-Komplex enthalten ist. Durch diese Brückenantikörper und den APAAP-Komplex bildet sich in mehreren Inkubationszyklen eine komplexe Verbindung, wenn das gesuchte Antigen vorhanden ist (siehe Abb.4 und Abb.5). Wiederholte Inkubationen führen zu zusätzlichen Anlagerungen der Enzymmoleküle an die Antigen-Bindungsstelle und bewirken so eine gesteigerte Farbreaktion (rot) bei Entwicklung in hexazotierter Astraneufuchsin-Entwicklungslösung, einer chromogenen Substratlösung für Alkalische Phosphatase. Eine Gegenfärbung zur Kontrastdarstellung erfolgt mit Mayers saurem Hämalaun.

Abbildung 5: Schematisches Diagramm der amplifizierten APPAP Technik

3.2.7 Versuchsablauf

3.2.7.1 Vorbereitung

Die aufgetauten und luftgetrockneten Gefrierschnitte wurden flach in den mit feuchtem Tuch ausgelegten APAAP-Kasten (Feuchtkammer) gelegt, und jeder Gewebespot wurde mit einem hydrophoben PAP-Pen umkreist, um das Auseinanderfließen der später aufgetropften Reagenzien zu vermeiden.

3.2.7.2 Inkubation mit dem Primär-Antikörper

↓52

Auf jeden Gewebespot wurden 40 μl des jeweiligen Primärantikörpers gegeben. Mit einem Medium aus 2,5 ml RPMI 1640 Medium ohne L-Glutamin, 22,5 ml destilliertem Wasser und 2,5 ml Rinderserum (vor Gebrauch inaktiviert im Wasserbad bei 56°C für 30 min.) wurden die Primärantikörper entsprechend ihrer bestimmten Titer verdünnt (s. Titerbestimmung). Nun erfolgte eine 30 minütige Inkubation bei geschlossenem Deckel und Raumtemperatur.

Als Negativkontrolle diente ein Präparat, das nur mit Verdünnungslösung ohne Primärantikörper inkubiert wurde.

3.2.7.3 Spülung der Gewebeschnitte in TBS

Die Schnitte wurden entnommen und in den Objektträgerständer gestellt. Die Präparate wurden sorgfältig gespült, indem sie nacheinander in vier mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) 0,05M gefüllten Küvetten geschwenkt wurden.

↓53

TBS 0.05 M wurde folgendermaßen hergestellt:
1,80 g Tris-Base
13,76 g Tris-Hydrochlorid und
17,56 g Natriumchlorid

Die pH-Einstellung auf 7,4-7,6 erfolgte mit 2 N HCl bzw. 2 N NaOH. Die überschüssige Flüssigkeit wurde vorsichtig abgeklopft und die Objektträger wurden wieder nebeneinander flach in den APAAP-Kasten gelegt.

3.2.7.4 Zwischeninkubation bei polyklonalen Antikörpern

Im Falle von Angiotensinogen, Renin 2 und Renin 3 war der Antikörper nicht von der Maus, sondern vom Kaninchen, so dass vor den Inkubationen eine 30 minütige „mousefication“ erforderlich war. Hierbei wurde der polyklonale Antikörper mit einer sogenannten mouse-anti-rabbit-Antikörperlösung (m.a.r.; Monoclonal Mouse Anti-Rabbit Ig, DAKO, Glostrup/Dänemark) mit demselben Verdünnungsmedium auf 1:200 verdünnt, das auch beim Primärantikörper verwendet wurde. Auf jeden Gewebespot wurden 40 μl mouse-anti-rabbit-Antikörperlösung aufgetragen. Die 30 minütige Inkubation zur Überführung in das monoklonale Maus-System und anschließende Spülung erfolgten wie zuvor.

3.2.7.5 Inkubation mit dem Brückenantikörper

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Die Schnitte wurden nun mit 40 μl Brückenantikörper Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin (Rabbit Anti-Mouse Immunglobulin, DAKO, Glostrup/ Dänemark) benetzt, das durch Mischung mit einem Medium (pH 7,4 – 7,6) aus 25ml RPMI 1640 Medium ohne L-Glutamin und 5 ml humanem AB-Serum (vor Gebrauch inaktiviert im Wasserbad bei 56°C für 30 min.) in einer Verdünnung von 1:40 vorlag. Wieder folgte eine 30 minütige Inkubation gefolgt von fünf fünfminütigen Spülungen in TBS, vorsichtigem Abklopfen der überschüssigen Flüssigkeit und Zurücklegen der Objektträger in den APAAP-Kasten.

3.2.7.6 Inkubation mit dem APAAP-Komplex

Nun wurden die Schnitte mit 40 μl APAAP-Komplex (APAAP, Mouse Monoclonal, DAKO, Glostrup/Dänemark), der mit dem gleichen Verdünnungsmedium des Brückenantikörpers auf 1:40 verdünnt war, wieder für 30 Minuten inkubiert und fünf Mal in TBS gewaschen (siehe oben).

3.2.7.7 Wiederholte Inkubation mit Brückenantikörper und APAAP-Komplex

Erneut wurden 40 μl Brückenantikörper (1:40) aufgetragen, 10 Minuten inkubiert und gespült.

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Eine abschließende 10 minütige Inkubation wurde nochmals mit dem APAAP-Komplex (40 μl, 1:40) durchgeführt.

Bis zur Entwicklung konnten die Präparate im TBS-Puffer stehenbleiben.

3.2.7.8 Färbung in hexazotierter Astraneufuchsin-Entwicklungslösung

Zunächst wurden folgende Lösungen angesetzt:
Lösung A)
62,5 ml Propandiol-Stammlösung 0,2 M wurden mit 175 ml Tris-Puffer aus
0,98 g Tris-Base
0,30 g Tris-HCl und
1,74 g NaCl
in 200ml destilliertem Wasser verrührt. Davon wurden 175 ml entnommen und mit 100 mg Levamisole (inhibiert die endogene Alkalische Phosphatase) auf dem Magnetrührer vermischt.

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Lösung B)
125 mg Naphthol AS-BI Phosphat (Substrat) wurden in 1,5 ml NN-Dimethylformamid (DMF) gelöst.

Lösung C)
50 mg Natriumnitrit wurden in 1250 μl destilliertem Wasser aufgelöst. Anschließend wurden 500 μl Neufuchsin tropfenweise innerhalb von 60 sec. dazugegeben (Natriumnitrit aktiviert Neufuchsin zu rotem Farbstoff).

Waren die Lösungen A, B und C vorbereitet, wurde Lösung C zu A gegeben. Das Gemisch wurde verrührt und anschließend Lösung B hinzugegeben. Mit 2N Salzsäure wurde der pH-Wert mittels pH-Meter auf 8,8 eingestellt. Die Lösung wurde durch Filterpapier in eine Küvette gefiltert. Der Objektträgerständer mit den Gewebeschnitten wurde in diese Küvette hineingestellt. Die 30 minütige Entwicklung fand auf dem Schüttler statt. War das spezifische Antigen vorhanden, kam es durch die im APAAP Komplex enthaltene Alkalische Phosphatase zur Umsetzung von Neufuchsin zu einem roten Farbstoff und damit zur spezifischen Anfärbung der das Antigen enthaltenden Gewebestrukturen.

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Nach abgeschlossener Entwicklung wurden die Schnitte in TBS mehrmals gewaschen.

3.2.7.9 Gegenfärbung mit Mayer`s saurem Hämalaun

Die Gegenfärbung erfolgte für 5 Minuten in einer mit Mayer`s saurem Hämalaun gefüllten Küvette. Anschließend wurde nochmals drei bis fünf Mal mit TBS-Puffer gewaschen.

3.2.7.10 Eindecken

Die überschüssige Flüssigkeit wurde vorsichtig abgeklopft und um die Gewebespots herum abgewischt. Die Schnitte wurden mit ein bis zwei Tropfen Kaisers Glyceringelatine und Deckplättchen luftblasenfrei eingedeckt.

3.2.8 Stammlösungen

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Die benutzten Stammlösungen setzten sich folgendermaßen zusammen:
Aminosilane Lösung 0,2%:
200 μl 3-Aminopropyltrietoxy-silane wurden in 100 ml Aqua dest. gelöst.
Propandiol-Stammlösung 0,2 M:
21 g 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol wurden in 1 l Aqua dest. gelöst und bei 4°C in einer dunklen Flasche aufbewahrt.

Neufuchsin-Stammlösung:

5 g Neufuchsin wurden in 100 ml 2N Salzsäure auf dem Schüttler gelöst und ebenfalls bei 4°C in einer dunklen Flasche gelagert.

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Mayer´s saures Hämalaun:

1 g Hämatoxilin, 0,2 g Natriumjodat und 50 g Kalialaun (Aluminiumkaliumsulfat-Dodecahydrat) wurden über Nacht in 1 l Aqua dest. auf dem Magnetrührer gelöst. Vorsichtig wurden 50 g Chloralhydrat und 1 g Zitronensäure (Citronensäure-Monohydrat) hinzugefügt und wieder über Nacht auf dem Schüttler gelöst. Vor Verarbeitung musste das Gemisch dann für mindestens sieben Tage in einer dunklen Flasche reifen. Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur.

3.2.9 Titerbestimmungen

In Voruntersuchungen wurde der Verdünnungstiter der benutzten Primärantikörper festgelegt. Hierzu erfolgte die Färbung nach APAAP-Technik mit den Primärantikörpern in unterschiedlichen Titrationsreihen an Gefrierschnitten gesunder Haut. Ziel war es, die größte spezifische Farbintensität bei minimaler Hintergrundfärbung zu erlangen. Die ermittelten Titer für jeden Primärantikörper sind in der folgenden Tabelle aufgelistet:

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Tabelle 7: Endverdünnung der Primärantikörper

Primärantikörper

Verdünnung

MAB 4051 ACE

1:1000

VH 68-8 Angiotensinogen

1:2000

Renin 2

1:1000

Renin 3

1:2000

AT1-Rezeptor

1:100

AT2-Rezeptor

1:200


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20.09.2006