4 Auswertung

4.1  Nachweis der RAS-Komponenten mittels RT-PCR

4.1.1  Angiotensinogen, Renin und Angiotensin-Converting-Enzym

↓60

Mittels RT-PCR wurde in allen kutanen Zellen in Primärkultur (Keratinozyten, Melanozyten, dermalen Fibroblasten und MVECs) die Expression der mRNA für alle drei RAS Komponenten (Angiotensinogen, Renin und ACE) untersucht.

4.1.1.1 Angiotensinogen

Bei der Amplifikation von cDNA aus Keratinozyten, Melanozyten, Fibroblasten und mikrovaskulären Endothelzellen zeigte sich bei Einsatz von Primern zur Detektion von Angiotensinogen ein Signal für ein Amplifikationsprodukt der erwarteten Größe von 524 bp.

↓61

Abbildung 6: Angiotensinogen mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)

Die Angiotensinogen-Expression war besonders ausgeprägt in Melanozyten; in den MVECs fand sich nur ein schwaches Signal. Eine genaue quantitative Aussage ist bei diesem Versuchsansatz jedoch nicht möglich (nicht-quantitative RT-PCR) und wurde auch nicht angestrebt.

4.1.1.2 Renin

Bei Einsatz von Primern zur Detektion von Renin zur Amplifikation von cDNA aus Keratinozyten, Melanozyten, Fibroblasten und mikrovaskulären Endothelzellen zeigte sich ein Signal für ein Amplifikationsprodukt der erwarteten Größe von 426 bp.

↓62

Das Signal für Renin mRNA war in allen untersuchten Zellen, außer in Melanozyten, stark ausgeprägt.

Abbildung 7: Renin mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)

4.1.1.3 Angiotensin-Converting-Enzym

Abbildung 8: ACE mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)

↓63

Die Amplifikation von cDNA zur Detektion von Angiotensin-Converting-Enzym erbrachte in allen untersuchten Zellen ein positives Signal für ein Produkt der erwarteten Größe von 388bp. Wie schon Renin scheint auch ACE in Melanozyten am schwächsten exprimiert.

Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass alle zur Ang II Synthese nötigen Komponenten des RAS in allen untersuchten kutanen Zellen vorhanden sind.

4.1.2 Angiotensin-Rezeptoren

4.1.2.1 AT1-Rezeptor

Abbildung 9: AT1 mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)

↓64

Die Amplifikation der cDNA aus primären Keratinozyten, Melanozyten, dermalen Fibroblasten und mikrovaskulären Endothelzellen mit Primern zum Nachweis des AT1-Rezeptors erbrachte für alle Zellen ein deutlich postives Signal für ein Amplifikationsprodukt der erwarteten Größe von 270 bp.

4.1.2.2 AT2-Rezeptor

Abbildung 10: AT2 mRNA Expression in kutanen Zellen (Ker=Keratinozyten, Mel=Melanozyten, Fib=Fibroblasten, MVEC=mikrovaskuläre Endothelzellen)

Die Amplifikation von cDNA zur Detektion des AT2-Rezeptors erbrachte in Keratinozyten, dermalen Fibroblasten und mikrovaskulären Endothelzellen ein positives Signal für ein Produkt der erwarteten Größe von 263bp. Melanozyten scheinen den AT2-Rezeptor nicht zu exprimieren.

4.2 Angiotensin II Synthese durch Keratinozyten

↓65

Zum Nachweis der Fähigkeit kutaner Zellen zur autonomen Ang II Synthese wurde exemplarisch das Vorkommen bzw. die Konzentration von Ang II in Homogenaten von Keratinozyten mittels enzymatischem immunometrischem Assay gemessen.

Die Messungen ergaben eine mittlere basale Konzentration von 9,75 pmol/mg Angiotensin II. Ang II war darüber hinaus auch in den Überständen der Keratinozyten nachweisbar und zwar in einer Konzentration von 30 pg/ml.

Die Ang II Synthese war durch Inkubation der Zellen mit 2 ng/ml Interleukin-6 (Il-6) und 10 ng/ml EGF (epidermal growth factor) um etwa 100% stimulierbar. Diese Stimulation konnte durch Koinkubation mit 10 –5 M ACE-Hemmer verhindert werden. Je 50 pg/ml TNFα und TGFß hatten keinen Einfluss auf die Ang II Synthese. Die in diesen Versuchen um etwa eine Zehnerpotenz niedrigere Konzentration von Ang II in den Überständen ist mit einer geringeren Zelldichte während des Versuches erklärbar.

↓66

Tabelle 8: Synthese von Ang II in Keratinozyten; angegeben sind jeweils drei unabhängige Messwerte, der Mittelwert sowie die Standardabweichung; Einheit: pg/ml

ohne ACE Hemmer

mit ACE Hemmer

ohne ACE Hemmer

mit ACE Hemmer

ohne ACE Hemmer

mit ACE Hemmer

Messwerte

Messwerte

Mittelwert

Mittelwert

Standard abweichung

Standard abweichung

basal

2,9

3,7

basal

3,1

3,7

2,93

3,65

0,15

0,09

basal

2,8

3,55

TNF α

3,8

4,2

TNF α

4,1

4,25

3,90

4,08

0,17

0,25

TNF α

3,8

3,8

IL-6

6,5

2,6

IL-6

6,15

2,6

6,30

2,57

0,18

0,06

IL-6

6,25

2,5

TGF ß

2,95

4,2

TGF ß

3,2

4,3

3,05

4,23

0,13

0,06

TGF ß

3

4,2

EGF

6,2

2,6

EGF

6,25

2,75

6,35

2,63

0,22

0,10

EGF

6,6

2,55

Abbildung 11: Synthese von Ang II in Keratinozyten

4.3 Nachweis der RAS-Komponenten mittels immunhistochemischer Färbungen

4.3.1  Angiotensinogen, Renin und Angiotensin-Converting-Enzym

4.3.1.1 Angiotensinogen

Abbildung 12: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt acht untersuchten.

↓67

Abbildungen 12 und 13 sind typische Beispiele für Inkubationen mit Antikörpern gegen Angiotensinogen. Die gesamte Epidermis ist von Stratum basale über Stratum spinosum bis Stratum granulosum homogen durchfärbt. Im Stratum corneum fehlt jegliche Anfärbung. In der Dermis zeigen die Gefäßwände ein deutlich positives Signal.

Abbildung 13: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 25µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt acht untersuchten Präparaten.

4.3.1.2 Renin

Abbildung 14: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt acht untersuchten. S=Schweißdrüsen, G=Gefäßwand.

↓68

Auch bei Nutzung von Antikörpern gegen Renin zeigte sich in der gesamten Epidermis bis auf das Stratum corneum eine deutliche Farbreaktion. Wie in Abbildung 14 (Markierung S) ersichtlich, zeigen die Schweißdrüsen der Dermis positive Signale. Auch die Gefäßwände (G) exprimieren Renin.

4.3.1.3 Angiotensin-Converting-Enzym

Abbildung 15: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ACE; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt acht untersuchten.

Auch bei Verwendung von Antikörpern gegen ACE zeigte sich ein ähnliches Bild: wie im Falle der Expression von Angiotensinogen und Renin ist auch hier die gesamte Epidermis durchfärbt. In der Dermis finden sich dagegen positive Signale nur in Gefäßwänden und Hautanhangsgebilden.

↓69

Die Versuche zur Expression der zur Ang II Synthese notwendigen RAS-Komponenten in normaler Haut erbrachten also, dass Angiotensinogen, Renin und ACE in der gesamten Epidermis exprimiert sind, während in der Dermis nur Gefäßwände, Haarfollikel und Schweißdrüsen positive Signale zeigten.

4.3.2 Angiotensin-Rezeptoren

4.3.2.1 AT1-Rezeptor

Abbildung 16: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem polyklonalen Antikörper gegen den humanen AT1 Rezeptor; scale bar 20µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt fünf untersuchten Präparaten.

Immunhistochemische Färbungen zum Nachweis von Angiotensin-Rezeptoren zeigten ein sehr ähnliches kutanes Anfärbungsmuster wie das des Angiotensin II-Vorläufers Angiotensinogen und der zur Angiotensin II-Synthese benötigten Enzyme Renin und ACE.

↓70

Bei Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen den menschlichen AT1-Rezeptor fanden sich in der gesamten Epidermis positive Signale im Zytoplasma der Keratinozyten, während in der Dermis nur bestimmte Strukturen wie Gefäßwände angefärbt waren.

4.3.2.2 AT2-Rezeptor

Abbildung 17: Immunhistochemische Färbung von normaler Haut mit einem polyklonalen Antikörper gegen den humanen AT2 Rezeptor; scale bar 20µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt fünf untersuchten. G=Gefäßwand.

Anfärbung eines Großteils der Epidermalzellen. Im Gegensatz zum AT1-Rezeptor waren nur die Plasmamembranen und nicht das Zytoplasma angefärbt. In den Gefäßwänden (G) der Kapillaren in den dermalen Papillenspitzen zeigten sich ebenfalls positive Signale.

4.4  RAS-Komponenten in pathologisch veränderter Haut

4.4.1  Psoriasis vulgaris

4.4.1.1 Angiotensinogen

↓71

Abbildung 18: Immunhistochemische Färbung von psoriatisch veränderter Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt sieben untersuchten Präparaten. P=Papillenspitze.

Schnittfärbungen von psoriatisch veränderter Haut mit Antikörpern gegen Angiotensinogen erbrachten wie in normaler Haut deutlich positive Signale in der Epidermis sowie in Gefäßwänden und Schweißdrüsen der Dermis. Im Bereich der Epidermis zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede zwischen dem Anfärbungsmuster in psoriatisch veränderter verglichen mit normaler Haut. Während in normaler Haut die gesamte Epidermis vom Stratum basale bis zum Stratum granulosum homogen angefärbt ist, ist die Anfärbung in psoriatischer Haut im Bereich des oberen Stratum spinosum und des Stratum granulosum deutlich reduziert, teilweise nicht mehr nachweisbar.

Die Dermis unterscheidet sich bei der Psoriasis vulgaris von normaler Haut insbesondere durch ausgeprägte Gefäßproliferationen sowie Infiltrate im Bereich der Papillenspitzen (siehe Abbildung 18, Markierung P). Sowohl die papillären Gefäßkonvolute, als ich die Infiltratzellen zeigen deutlich positive Signale bei Anfärbung mit dem Antikörper gegen Angiotensinogen.

4.4.1.2 Renin

↓72

Abbildung 19: Immunhistochemische Färbung von psoriatisch veränderter Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt sieben untersuchten Präparaten.

Wie in Abbildungen 19 und 20 dargestellt, findet sich bei Verwendung eines Antikörpers gegen Renin in psoriatisch veränderter Haut ein fast identisches Anfärbungsmuster wie bei Verwendung eines Antikörpers gegen Angiotensinogen, wobei die Betonung der unteren Schichten der Epidermis noch ausgeprägter erscheint. In der Dermis sind wiederum die Zellen des entzündlichen Infiltrats sowie Gefäßwände und Schweißdrüsen angefärbt.

Abbildung 20: Immunhistochemische Färbung von psoriatisch veränderter Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 50µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt sieben untersuchten.

4.4.1.3 Angiotensin-Converting-Enzym

↓73

Abbildung 21: Immunhistochemische Färbung von psoriatisch veränderter Haut mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ACE; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt sieben untersuchten Präparaten.

Auch bei Verwendung eines Antikörpers gegen ACE zeigt sich bei der Psoriasis vulgaris in der Epidermis eine deutliche Betonung des Stratum basale und des unteren Stratum spinosum. Die positiven Signale nehmen aber auch hier zu den oberen Schichten hin ab.

Besonders intensive Anfärbungen waren in den Infiltraten der Dermis sowie in den Gefäßwänden erkennbar.

4.5  Tumorerkrankungen der Haut - Basaliom

4.5.1  Angiotensinogen

↓74

Abbildung 22: Immunhistochemische Färbung eines Basalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt elf untersuchten Präparaten. R=Randbetonung.

In Schnittfärbungen von Basaliomen mit Antikörpern gegen Angiotensinogen fällt auf, dass die Signalstärke im Tumorgewebe im Vergleich zur Epidermis eindrucksvoll vermindert ist. Es zeigt sich eine leichte Randbetonung im Bereich des Basaliomgewebes (Markierung R). Im Vergleich dazu findet sich in der angrenzenden gesunden Epidermis - wie von den Schnitten aus normaler Haut bekannt - eine homogene Durchfärbung, während das unmittelbar an den Tumor grenzende dermale Gewebe nur schwach bis gar nicht angefärbt ist.

4.5.2 Renin

Abbildung 23: Immunhistochemische Färbung eines Basalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives Präparat von insgesamt elf untersuchten.

↓75

Bei Verwendung eines Antikörpers gegen Renin findet sich ein identisches Anfärbungsmuster im Bereich des Basalioms wie bei Angiotensinogen: ein vermindertes Signal im Tumorgewebe mit leicht randbetonter Anfärbung.

4.5.3 Angiotensin-Converting-Enzym

Abbildung 24: Immunhistochemische Färbung eines Basalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ACE; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt elf untersuchten Präparaten.

Wie in Abbildung 24 ersichtlich, sind beim Basaliom unter Benutzung eines Antikörpers gegen ACE die positiven Signale in den Tumorbereichen deutlich vermindert, teilweise nicht mehr nachweisbar. Die angrenzende gesunde Epidermis ist in ihrer Gesamtheit durchfärbt, wie bereits von den Schnitten an normaler Haut bekannt. Das Expressionsmuster von ACE im Tumorgewebe und in der Epidermis entspricht also im wesentlichen dem von Angiotensinogen und Renin.

↓76

Im Gegensatz zu den für den Nachweis von Angiotensinogen und Renin verwendeten Präparaten ist bei dieser Biopsie das peritumorösen Gewebe um das Basaliom deutlich angefärbt. Diese Anfärbung könnte entweder durch ein peritumoröses Infiltrat verursacht sein oder aber eine Induktion des ACE im Bindegewebe widerspiegeln. Diese Frage kann nur durch immunhistochemische Doppelfärbungen eindeutig geklärt werden, die aber nicht Gegenstand dieser Arbeit waren, sondern von der Arbeitsgruppe im Rahmen weiterer Untersuchungen geplant sind.

4.6 Tumorerkrankungen der Haut - Spinaliom

4.6.1  Angiotensinogen

Abbildung 25: Immunhistochemische Färbung eines Spinalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Angiotensinogen; scale bar 100µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt neun untersuchten Präparaten.

Unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen humanes Angiotensinogen zeigte sich bei Schnittfärbungen von Spinaliomen die gesamte Epidermis vom Stratum basale über Stratum spinosum bis Stratum granulosum homogen durchfärbt, während im Stratum corneum jegliche Anfärbung fehlte. Im Tumorgewebe war die Signalstärke vergleichbar mit der in der gesunden Epidermis. In der Umgebung der Tumorzellen fanden sich ebenfalls keine Auffälligkeiten.

4.6.2 Renin

↓77

Abbildung 26: Immunhistochemische Färbung eines Spinalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Renin; scale bar 200µm. Die Abb. zeigt ein repräsentatives von insgesamt neun untersuchten Präparaten.

Auch bei Inkubationen mit monoklonalem Antikörper gegen humanes Renin sind in Biopsien von Spinaliomen ganz homogene Anfärbungen in der Epidermis und dem Tumorgewebe zu sehen. Wieder ist das peritumoröse Gewebe unauffällig.

4.6.3 Angiotensin-Converting-Enzym

Abbildung 27: Immunhistochemische Färbung eines Spinalioms mit einem monoklonalen Antikörper gegen humanes ACE; scale bar 200µm (a) bzw. scale bar 100µm (b). Die Abb. zeigen ein repräsentatives von insgesamt neun untersuchten Präparaten. G=Gefäßwand.

↓78

Wie in Abbildung 27 ersichtlich, sind beim Spinaliom unter Benutzung eines Antikörpers gegen ACE homogene Anfärbungen in den Tumorbereichen nachweisbar, die eine leichte Randbetonung erkennen lassen. Auch die Gefäßwände (G) in der Dermis exprimieren ACE, wie bereits aus gesunder Haut bekannt.


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20.09.2006