5 Diskussion

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Das Renin-Angiotensin-System (RAS) wurde ursprünglich als systemisches, zirkulierendes, endokrines System beschrieben (Montani und van Vliet, 2004). Das Vorläufermolekül Angiotensinogen wird hauptsächlich in der Leber synthetisiert und ins Blut sezerniert, das zur Spaltung von Angiotensinogen notwendige Enzym Renin entstammt dem juxtaglomerulären Apparat der Niere, und die eigentliche Bildung des Effektorhormons Angiotensin II (Ang II) erfolgt durch gefäßendothelständiges Angiotensin-Converting-Enzym (ACE).

Neben diesem systemischen RAS, das anscheinend für die kurzfristigen, systemischen Effekte des RAS z.B. bei der Blutdruck- und Volumenregulation verantwortlich ist, sind in zahlreichen Organen sogenannte lokale oder Gewebe-RASs beschrieben worden (Lavoie und Sigmund, 2003). In diesen Organen sind alle zur Ang II Synthese notwendigen Komponenten in eng benachbarter Lokalisation vorhanden, so dass von einer lokalen Ang II Bildung, einer lokalen, spezifischen Regulation der Ang II Synthese und von lokal begrenzten, autokrinen und parakrinen Effekten ausgegangen werden kann. Zu den Organen/Geweben mit Gewebe-RAS gehören u.a. das Herz, die Gefäßwand, die Niere und Nebenniere, das Gehirn und die Leber.

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Da es zu Beginn der hier präsentierten Arbeiten nur wenige, zum Teil widersprüchliche Aussagen über Expression und mögliche Funktionen eines lokalen Renin-Angiotensin-Systems (RAS) in der Haut, insbesondere in menschlicher Haut gab, war es Ziel dieser Arbeit, diesen offenen Fragen systematisch nachzugehen.

Der Nachweis des Effektorpeptids Ang II selbst im Gewebe ist schwierig und technisch sehr aufwendig. Es wird aber allgemein davon ausgegangen, dass bei Vorliegen aller zur Angiotensin II Synthese notwendigen Komponenten, also des Vorläuferproteins Angiotensinogen sowie der Enzyme Renin und ACE in enger Nachbarschaft eine lokale Ang II Synthese stattfindet, so dass der Nachweis all dieser einzelnen Komponenten in einem Gewebe als indirekter Nachweis einer lokalen Ang II Bildung anerkannt ist.

Essentiell für eine Wirkungsentfaltung von Ang II vor Ort ist außerdem natürlich das Vorhandensein von Angiotensin-Rezeptoren.

5.1  Nachweis der RAS-Komponenten

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Die in dieser Arbeit vorgestellten Experimente erbrachten, dass in der Tat alle Komponenten des RAS (Angiotensinogen, Renin, ACE, AT1- und AT2-Rezeptoren) von humaner Haut exprimiert werden.

Der Nachweis erfolgte auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR an humanen Keratinozyten, Melanozyten, dermalen Fibroblasten und mikrovaskulären Endothelzellen in vitro (alle Zellen in Primärkultur). Alle RAS-Komponenten wurden von allen Zelltypen exprimiert mit einer einzigen Ausnahme: Melanozyten scheinen keine AT2-Rezeptoren zu exprimieren.

Die immunhistochemischen Färbungen von Gewebeschnitten gesunder Haut, also die Darstellung der RAS-Komponenten auf Protein-Ebene, bestätigten im wesentlichen diese Ergebnisse: die Epidermis, die überwiegend aus Keratinozyten besteht, in der aber auch die kutanen Melanozyten angesiedelt sind, zeigte eine homogene, alle Schichten umfassende Expression aller RAS-Komponenten. In der Dermis war eine deutliche Anfärbung vaskulärer Endothelzellen nach Inkubation mit Antikörpern gegen alle RAS-Komponenten festzustellen. Auch in einigen Hautanhangsgebilden wie Haarfollikeln und Schweißdrüsen scheinen alle RAS-Komponenten exprimiert zu sein. Nicht eindeutig feststellbar war jedoch die Bindung der Antikörper an dermale Fibroblasten. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu den Untersuchungen mittels RT-PCR, die die Expression von mRNA in primären, dermalen Fibroblasten gezeigt hatten. Möglicherweise werden RAS-Komponenten in dermalen Fibroblasten nur als Reaktion auf ein stimulierendes Ereignis wie z.B. eine Gewebsverletzung gefunden. Dieses Phänomen wurde bereits für einige Faktoren wie z.B. connective tissue growth factor (CTGF) beschrieben (Leask et al., 2001). Die Bedingungen in vitro mit einer „unnatürlich“ hohen Proliferationsrate entsprechen in der Tat eher denen bei Schließung eines Gewebedefektes als denen in normaler Haut. Weiterführende, in dieser Arbeit nicht dargestellte Experimente haben in der Zwischenzeit Hinweise darauf geliefert, dass zumindest die Ang II Rezeptoren AT1 und AT2 im Bereich eines Gewebedefektes von Fibroblasten stark exprimiert werden.

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Während der Durchführung dieser Versuche hat die Arbeitsgruppe um Takeda et al. drei Artikel veröffentlicht, in denen die Expression von AT1-Rezeptoren in normaler menschlicher Haut, Haarfollikeln, Schweißdrüsen und verschiedenen Hauttumoren immunhistochemisch nachgewiesen werden konnte (Takeda und Kondo, 2001 a, 2001 b, Takeda et al., 2002). Die Expression von Angiotensinogen, Renin und ACE wurde von dieser Arbeitsgruppe nicht untersucht.

Die Resultate von Takeda et al. widersprechen in zwei wesentlichen Punkten den Ergebnissen dieser Arbeit. Zum einen berichtet die Arbeitsgruppe um Takeda, in den immunhistochemischen Färbungen normaler Haut keine positiven Signale für AT2-Rezeptoren gefunden zu haben. In den hier durchgeführten immunhistochemischen Versuchen war dagegen eine zwar nicht sehr starke, aber reproduzierbare Färbung der gesamten Epidermis und einiger Hautanhangsgebilde sowie vaskulärer Endothelzellen mit Antikörpern gegen den AT2-Rezeptor zu sehen. Reproduzierbar war außerdem das charakteristische Anfärbungsmuster, nämlich eine Anfärbung der Zelloberflächen und nicht – wie beim AT1-Rezeptor – des Zytoplasmas. Für die Richtigkeit dieser Ergebnisse spricht weiterhin der positive Nachweis von AT2-Rezeptor kodierender mRNA in primären humanen Keratinozyten und mikrovaskulären Endothelzellen.

Der zweite Widerspruch liegt in dem Verteilungsmuster des AT1-Rezeptors in der Epidermis. In der Mehrheit der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Gewebeschnitte war die Epidermis nach Inkubation mit anti- AT1-Antikörpern vollständig und homogen positiv gefärbt. Die von Takeda et al. berichtete Aussparung der basalen Schichten wurde hier nicht gesehen.

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Da von Takeda und Mitarbeitern die gleichen Antikörper gegen AT1- und AT2-Rezeptoren benutzt wurden wie bei den hier vorliegenden Versuchen, gibt es keine naheliegende Erklärung für diese Diskrepanzen. Um den Widerspruch aufzuklären, ist wahrscheinlich die Untersuchung einer wesentlich größeren Anzahl an Gewebeschnitten, eingeteilt nach Lokalisation sowie Alter und Geschlecht des Patienten/ Donors notwendig.

Die Arbeiten von Takeda et al. sind (außer den eigenen) die einzigen derzeit bekannten, die die Expression von Angiotensin Rezeptoren in der gesamten adulten, humanen Haut zum Gegenstand hatten. Es existieren aber einzelne, weitere in vitro Ergebnisse. So konnten Nickenig et al. in humanen, dermalen Fibroblasten mittels Bindungsstudien den AT1-Rezeptor nachweisen sowie zusätzlich eine Bindungsstelle für Ang 1-7 (Nickenig et al., 1997). Der AT2-Rezeptor wurde in dieser Arbeit nicht gefunden. Takayanagi et al. dagegen fanden in humanen, dermalen Fibroblasten keinerlei Hinweis auf das Vorhandensein von Angiotensin Rezeptoren (Takayanagi et al., 1994). Steckelings et al. konnten in früheren Experimenten mit Bindungsstudien an primären, humanen Keratinozyten ebenfalls nur den AT1-Rezeptor sowie einen non- AT1-non- AT2-Rezeptor nachweisen (Steckelings et al., 1996). In der Zwischenzeit wurden jedoch die Kulturbedingungen für die Keratinozyten optimiert, so dass die neueren, in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse als gültig angesehen werden sollten.

Neben den hier genannten Studien an adulter Haut bzw. an Zellen in vitro liegen auch Studien an fetaler Haut von Affen und Ratten vor, die hier aber nicht weiter zum Vergleich herangezogen werden, da die Angiotensin Rezeptor Verteilung sich in fetalem Gewebe grundlegend von der in adultem Gewebe unterscheidet (Millan et al., 1989, Zemel et al., 1990, Tsutsumi und Saavedra, 1991, Tsutsumi et al., 1991, Johnson und Aguilera, 1991, Feuillan et al., 1993, de Gasparo et al., 2000).

5.2  Angiotensin II Synthese durch Keratinozyten

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Wie im vorhergehenden Text bereits mehrfach erläutert, gilt der Nachweis von Angiotensinogen, Renin und ACE in eng benachbarter Lokalisation bzw. in einer Zelle als starkes Indiz für die Fähigkeit dieses Gewebes/dieser Zelle, eigenständig, also ohne Zufuhr weiterer Komponenten aus der Zirkulation, Ang II zu synthetisieren. Da der Nachweis von Ang II selbst insbesondere im Gewebe technisch sehr anspruchsvoll bzw. kostenintensiv ist, hat sich die vorliegende Arbeit darauf beschränkt, die Ang II Synthese lediglich in humanen, primären Keratinozyten in vitro direkt zu überprüfen und zwar mit einem enzymatischen immunometrischen Assay. Mit Hilfe dieser Technik konnte sowohl in Zellhomogenaten als auch in Überständen der Keratinozyten Ang II nachgewiesen werden. Die Ang II Synthese war durch IL-6 und EGF stimulierbar, und diese Stimulation wiederum durch Ko-Inkubation mit einem ACE-Hemmer um ca. 60% hemmbar. Keratinozyten scheinen also zumindest in vitro in der Tat in der Lage zu sein, Ang II selbst zu synthetisieren. Der endgültige Beweis, dass dem auch in vivo so ist, steht allerdings noch aus.

Auch in der Haut der Ratte konnte schon Ang II selbst nachgewiesen werden, allerdings wurden hierbei Hautbiopsien verwendet, die auch Gefäße enthielten, so dass dieses Ergebnis nicht als streng hautspezifisch angesehen werden kann (Phillips et al., 1994).Mit dem Nachweis, dass humane Haut offensichtlich sowohl Quelle als auch Zielorgan von Ang II ist, stellt sich die Frage nach der physiologischen bzw. pathophysiologischen Funktion dieses Gewebe-RAS.

5.3  Mögliche physiologische Bedeutung des kutanen RAS

Eine mögliche physiologische Funktion des kutanen RAS könnte in der Regulation von Keratinozytenproliferation und –differenzierung in der normalen Epidermis bestehen.

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90 % aller epidermalen Zellen sind Keratinozyten. Die epidermale Basalschicht besteht zum großen Teil aus teilungsfähigen Stammzellen, aus denen sich alle neugebildeten Keratinozyten rekrutieren. Innerhalb von etwa 28 Tagen wandern die Keratinozyten durch alle Schichten der Epidermis, vom Stratum basale zum Stratum corneum, und durchlaufen dabei einen kontinuierlichen Prozess der Differenzierung, der schließlich in der Apoptose der Zellen mündet. Die Proliferationsrate der Stammzellen sowie der Prozess der Keratinozytendifferenzierung unterliegen komplexen Regulationsmechanismen, und Störungen dieser Mechanismen führen zu Hautkrankheiten wie Psoriasis vulgaris (Karasek, 1999).

Von anderen Geweben ist bekannt, dass das RAS regulatorisch auf Prozesse der Zellproliferation und -differenzierung einwirken kann. Während Ang II über den AT1-Rezeptor in der Regel proliferationsfördernd und anti-apoptotisch wirkt, vermittelt der AT2-Rezeptor Antiproliferation und fördert Apoptose (Stoll et al., 1995, Meffert et al., 1996, Yamada et al., 1996). Da Keratinozyten nach den vorliegenden Ergebnissen beide Rezeptor-Subtypen exprimieren, wäre es denkbar, dass Keratinozytenproliferation bzw. -differenzierung durch eine Änderung des Rezeptorverhältnisses in der Epidermis modifiziert werden können.

5.4  Mögliche pathophysiologische Bedeutung des kutanen RAS

Falls diese Hypothese sich als richtig erweisen sollte, müsste man erwarten, dass bei Hauterkrankungen mit veränderter/gestörter Keratinozytenproliferation bzw. –differenzierung Änderungen des kutanen RAS zu beobachten sind. In erster Linie gilt dies natürlich für die Verteilung der Angiotensin Rezeptoren. Experimente hierzu werden momentan von unserer Arbeitsgruppe durchgeführt. Teil der hier vorgelegten Arbeit waren Untersuchungen zur Expression der übrigen RAS Komponenten bei Dermatosen mit veränderter Keratinozytenproliferation, denn auch eine lokal gesteigerte oder verminderte Ang II Synthese könnte regulatorische Effekte auf die Keratinozyten haben.

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Als Modelle für eine gestörte Keratinozytenprolifertation und/oder -differenzierung wurden zunächst drei Dermatosen ausgewählt: die „klassische“ Dermatose dieses Formenkreises, die Psoriasis vulgaris, sowie zwei Neoplasien (Basaliom und Spinaliom).

5.5  Expression der RAS-Komponenten bei Psoriasis vulgaris

Bei der Psoriasis vulgaris ist die Zeit der Durchwanderung der Epidermis vom Stratum basale bis zum Stratum corneum durch die Keratinozyten von normalerweise ca. 28 Tagen auf etwa vier Tage reduziert. Ein wesentliches pathophysiologisches Charakteristikum der Psoriasis vulgaris ist also eine Proliferationsstörung der Keratinozyten, die mit einer Differenzierungsstörung einhergeht. Charakteristisch ist weiterhin eine inflammatorische Reaktion, die sich insbesondere durch Infiltrate im Bereich der Papillenspitzen und sogenannte Munro-Mikroabszesse äußert. Noch immer sind jedoch Ätiologie und Pathogenese der Psoriasis vulgaris weitgehend unverstanden (Sterry und Paus, 2004 a).

Bei den immunhistochemischen Färbungen im Rahmen dieser Arbeit mit Antikörpern gegen Angiotensinogen, Renin und ACE zeigte sich im Gegensatz zu normaler Haut keine durchgehend homogene Anfärbung der Epidermis, sondern eine sehr starke Anfärbung der unteren Epidermalschichten, während in den oberen Schichten, insbesondere im Stratum granulosum und im oberen Stratum spinosum fast kein positives Signal mehr nachweisbar war.

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In der Dermis fand sich eine deutliche Gefäßproliferation sowie ein entzündliches Infiltrat in den Papillenspitzen, das Infiltrat teilweise auch in der darunter liegenden Dermis. Die Infiltratzellen und Gefäßendothelzellen zeigten in den meisten Fällen eine deutliche Expression aller RAS-Komponenten.

Über die mögliche Rolle des RAS bei der Psoriasis vulgaris gibt es bislang keinerlei Daten. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine verstärkte Ang II Synthese im Bereich der basalen, epidermalen Schichten hin. Da Ang II einen proliferationsfördernden Effekt auf Keratinozyten ausübt, könnte eine erhöhte, lokale Ang II Konzentration zu der gesteigerten Proliferationsrate der psoriatisch veränderten Keratinozyten beitragen. Umgekehrt scheint in den oberen epidermalen Schichten die Ang II Synthese im Vergleich zu normaler Haut reduziert zu sein. Eine mögliche Deutung hinsichtlich der Ursache hierfür wäre, dass durch die verstärkte Proliferation die Syntheserate der Zellen abfällt, hinsichtlich der pathophysiologischen Bedeutung, dass ein modulierender Effekt von Ang II auf die Keratinozytendifferenzierung ausfällt. Für eine spezifischere Deutung der vorliegenden Ergebnisse wäre es allerdings von Nutzen, das Verteilungsmuster der Ang II Rezeptoren in psoriatischer Haut zu kennen, da die durch Ang II ausgelösten Effekte je nach dominierendem Rezeptor-Subtyp entscheidend differieren können.

Auffallend bei den Gewebeschnitten aus psoriatischer Haut war weiterhin die deutlich erkennbare Expression von Angiotensinogen, Renin und ACE in den Zellen der Papillenspitzeninfiltrate. Diese Beobachtung kann dahingehend interpretiert werden, dass mit der Kapillarproliferation in den Papillenspitzen die Einwanderung von Infiltratzellen in diesem Bereich verstärkt ist und somit eine weitere Quelle der Ang II Bildung in dem Gewebe angereichert wird. Welche Bedeutung diesem zusätzlichen lokalen RAS zukommt, ist noch unklar. Es ist jedoch bekannt, dass Ang II die Expression von Cytokinen, Chemokinen und Adhäsionsmolekülen beeinflusst, so dass denkbar ist, dass Ang II auch die inflammatorische Reaktion im Rahmen einer Psoriasis in vielfältiger Weise beeinflusst.

5.6  Expression der RAS-Komponenten beim Basaliom

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Die meisten Tumoren entstehen durch Teilung aus einer Ursprungszelle, bei der aufgrund somatischer Mutationen, z.B. in Protoonkogenen, oft auch Entwicklungskontrollgene aktiviert und Tumorsuppressorgene und Differenzierungsgene durch entsprechende Deletionen inaktiviert werden. Ist erst einmal ein Baustein aus dem ursprünglichen chromosomalen Gefüge gestört, folgen weitere Verluste an zellregulatorischer Information, so dass die natürlichen Zellreparationsmechanismen ausfallen und die Zelle entarten kann. Bei Basaliompatienten wird eine genetisch determinierte Verringerung der Reparaturkapazität UV-Licht induzierter DNS-Schäden diskutiert (Wie et al., 1994).

An der Entstehung eines Tumors sind in unterschiedlicher Gewichtung sämtliche Faktoren beteiligt, die bei der Embryogenese und Regeneration den Proliferations- und Differenzierungsstoffwechsel steuern (Lodish et al., 1995).

Dies ist ein wichtiger Ansatzpunkt für die Hypothese einer möglichen Beteiligung des RAS bei der Pathogenese des Basalioms, da die Komponenten des RAS nachweislich Einfluss auf Zellpoliferation und -differenzierung bis hin zur Apoptose nehmen (Meffert et al., 1996, Horiuchi et al., 1997, Stoll et al., 1995, Nakajima et al., 1995).

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In den immunhistochemischen Untersuchungen mit Antikörpern gegen Angiotensinogen und Renin ist die Anfärbung des Tumorgewebes im Vergleich zur gesunden Epidermis deutlich reduziert. Es zeigt sich eine leichte Randbetonung der Tumornester.

Auch unter Verwendung von Antikörpern gegen ACE findet sich ein ähnliches Anfärbungsmuster - die Tumorbereiche sind in diesem Fall eher noch weniger angefärbt, teilweise sogar negativ. Das umgebende, dermale Bindegewebe zeigt dagegen deutliche, positive Signale vermutlich aufgrund eines peritumorösen Infiltrats, welches bei den anderen untersuchten, hier nicht gezeigten Basaliomen weniger stark ausgeprägt war.

Inkubationen des Tumorgewebes mit Antikörpern gegen Angiotensin Rezeptoren wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt, sind aber geplant.

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Takeda et al. publizierten 2002 immunhistochemische Untersuchungen von Bas a liomen mit Antikörpern gegen AT1- und AT2-Rezeptoren, führten aber keine Anfärbungen mit Antikörpern gegen weitere RAS-Komponenten durch (Takeda et al., 2002). Trotzdem ist bemerkenswert, dass auch in den Experimenten von Takeda et al. in Basaliom-Tumorgewebe keine Anfärbungen festzustellen waren (außer im Zentrum follikulär differenzierender Basaliome, welche eine relativ seltene Untergruppe darstellen). Das kutane Gewebe-RAS scheint also im Basaliomgewebe auf allen Ebenen (d.h. im Bereich der für die Ang II Synthese notwendigen Komponenten und im Bereich der Rezeptoren) durch noch zu eruierende Mechanismen deutlich inhibiert bis völlig ausgeschaltet zu sein. Über die pathophysiologische Bedeutung dieser Beobachtung kann bislang nur spekuliert werden. Eine mögliche Interpretation läge in der Annahme, dass die Minderexpression des RAS in der Tumorzelle zu einem weitgehenden Wegfall des modulierenden Einflusses des RAS auf Proliferation, Differenzierung und Apoptose führt. Neben zahlreichen weiteren Ursachen könnte das möglicherweise ein wichtiger Auslöser für ungehemmtes Tumorwachstum der Basaliome sein. Die Unreife und die starke Proliferation der Zellen wiederum könnten die verminderte Synthese der RAS Komponenten erklären. Falls sich die Beobachtung von Takeda et al. (die in eigenen Versuchen bisher nicht geteilt werden konnte) bestätigen sollte, dass die RAS-Komponenten in den Basalzellen der Epidermis weniger stark exprimiert sind als in höheren Schichten, so würde sich in der im Vergleich zur Epidermis geringen Anfärbung der Basaliome vielleicht auch deren zellulärer Ursprung widerspiegeln.

5.7  Expression der RAS-Komponenten beim Spinaliom

Das Plattenepithelkarzinom der Haut wird als maligner Tumor der Keratinozyten definiert. Es ist nach dem Basaliom die zweithäufigste bösartige Neubildung der Haut. Spinaliome der Haut finden vermutlich ihren Ursprung in den normalen Stachelzellen des Stratum spinosum der Epidermis. Ein wesentliches feingewebliches Merkmal ist die Differenzierung in Richtung nichtfollikulärer Epidermisstrukturen mit der Fähigkeit zur Verhornung. Im Gegensatz zur gesunden Epidermis ist die normale Schichtung aufgehoben und vor allem die Zahl der Keratinozyten deutlich erhöht.

Die immunhistochemischen Anfärbungen von Gewebeschnitten aus humanen Spinaliomen im Rahmen dieser Arbeit erbrachten bei Anfärbung mit allen Antikörpern (anti-Angiotensinogen, anti-Renin und anti-ACE) eine deutliche, homogene Anfärbung der gesamten Tumormasse.

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Bisher sind in der Literatur keine weiteren Arbeiten zur Expression von Angiotensinogen, Renin und ACE beim Spinaliom erschienen. Takeda et al. publizierten allerdings die Ergebnisse immunhistochemischer Färbungen mit Antikörpern gegen AT1- und AT2-Rezeptoren in Plattenepithelkarzinomen (Takeda und Kondo, 2001 a). In 88% der untersuchten Fälle (insgesamt wurden 50 Fälle untersucht) war eine starke (74%) bis mittel-starke (14%) homogene Anfärbung der gesamten Tumormasse feststellbar. Obwohl sich diese Daten natürlich nicht direkt mit den vorliegenden vergleichen lassen, so ist doch bemerkenswert, dass in allen hier und in der Gruppe von Takeda durchgeführten Anfärbungen übereinstimmend die Expression der RAS-Komponenten in Spinaliomen deutlich ausgeprägt, in Bas a liomen dagegen verringert war.

Auch über die Bedeutung der starken Expression des RAS im Bereich von Spin a liomen kann nur spekuliert werden. Eine starke Ang II Synthese verbunden mit einer erhöhten Expression von AT1-Rezeptoren könnte natürlich zu der erhöhten Proliferationsrate der Tumorzellen beitragen. Ob dem wirklich so ist, muss allerdings noch in weiteren Experimenten geklärt werden.


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20.09.2006