Aus dem
Neurowissenschaftlichen Forschungszentrum
der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

„Elektrophysiologische Untersuchungen zur
physiologischen und pathologischen neuronalen Plastizität
im Subikulum“

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät
der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von
Christian Wozny

aus Aachen

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. Denise Manahan-Vaughan
2. Prof. Dr. Heiko Luhmann
3. PD Dr. Joachim Behr

Datum der Promotion: 13.12.2004

Abstract

The subiculum plays a key role in processing memory information from the hippocampus to different cortical and subcortical brain regions. Subicular pyramidal cells are classified as regular firing or bursting cells according to their responses to supra-threshold depolarizing current pulses. Synaptic terminals arising from CA1 pyramidal cells do not function as a single compartment but show a specialized synaptic plasticity onto subicular pyramidal cells depending on the discharge properties of the synaptic target. Tetanic stimulation of CA1 axons caused a significantly stronger long-term potentiation (LTP) in bursting cells than in regular firing cells. Postsynaptic bursting was not necessary for the enhanced synaptic potentiation in bursting cells. The LTP in bursting neurons was independent of postsynaptic calcium, induced by presynaptic NR2B-containing autoreceptors and mediated via a adenylyl cylcase-cAMP-dependent signaling cascade.

In pilocarpine-treated animals subicular LTP was impaired. A long-lasting increase in synaptic transmission could not be observed after titanic stimulation neither in regular firing cells nor in bursting cells.

In human brain slices resected from patients from with drug-resistant temporal lobe epilepsy the subiculum displayed spontaneous rhythmic activity. In sclerotic but also in non-sclerotic hippocampal tissue the subiculum showed cellular and synaptic changes which suffice to generate spontaneous rhythmic activity that is correlated with the occurrence and frequency of interictal discharges recorded in the electroencephalograms of the corresponding patients.

Keywords: Hippocampus, Subiculum, Synaptic plasticity, NMDA receptor, Learning and memory, Long-term potentiation, Temporal lobe epilepsy

Zusammenfassung

Im Subikulum der Ratte finden sich zwei unterschiedliche Typen von Pyramidalzellen, die sich auf Grund ihres intrinsischen Entladungsverhaltens unterscheiden. Die Funktion dieser beiden Zelltypen hinsichtlich der synaptischer Neurotransmission ist unklar. Bursterzellen und regulär feuernde Zellen zeigten nach tetanischer Reizung ein unterschiedliches Ausmaß der LTP. Neben der zellspezifischen Ausprägung der LTP fanden sich mehrere Hinweise auf eine zielspezifische Projektion der Efferenzen der vorgeschalteten Area CA1. Die durchgeführten Experimente legen den Schluss nahe, dass Axone von Pyramidalzellen der Area CA1 selektiv auf subikuläre Pyramidenzellen projizieren und so den hippokampalen Informationsfluss steuern und regulieren können. NMDA-Rezeptoren auf beiden Seiten des synaptischen Spaltes spielen hier eine besondere Rolle. Präsynaptische NMDAR der Untereinheit NR2B scheinen an der LTP in Bursterzellen beteiligt zu sein und über einen vermehrten Kalziumeinstrom in die Präsynapse eine langanhaltende Erhöhung der Transmitterausschüttung herbeizuführen. Ebenso zeigten sich abhängig von der Zielzelle Hinweise auf eine unterschiedliche Aktivierung der präsynaptischen Adenylylcyclase-cAMP Kaskade.

In Pilokarpin-behandelten Tieren ließ sich nach hochfrequenter Reizung keine langanhaltende Potenzierung der synaptischen Antworten nachweisen. Stattdessen scheinen polysynaptisch latente Verbindungen mittels tetanischer Stimulation aktivierbar zu sein. In einigen Fällen waren diese polysynaptisch latenten Verbindungen per se, in anderen Fällen nach Blockade der GABAergen Neurotransmission aktiv.

In Hirnschnittpräparaten von Patienten mit pharmakoresistenter Temporallappenepilepsie konnte im Subikulum spontane rhythmische Aktivität mit einer Frequenz von 0,75 bis 3 Hz aufgezeichnet werden. Diese Aktivität, bestehend aus EPSP/IPSP Sequenzen, wurde sowohl in sklerotischem als auch in nicht sklerotischem Gewebe gefunden. In beiden Gruppen korrelierte die in vitro Aktivität sehr gut mit dem präoperativen Auftreten elektroenzephalografisch detektierter interiktaler Aktivität. Die Blockade GABAerger oder glutamaterger Neurotransmission hob die inhibitorische bzw. exzitatorische Aktivität auf. Dies legt den Schluss nahe, dass sowohl Interneurone wie Pyramidalzellen an der spontanen rhythmischen Aktivität beteiligt sind.

Eigene Schlagwörter: Hippokampus, Subikulum, synaptische Plastizität, NMDA Rezeptor, Lernen und Gedächtnis, Langzeitpotenzierung, Temporallappenepilepsie

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1.  Die Hippokampale Formation
  • 1.2. Das Subikulum
  • 1.3.  Synaptische Plastizität
  • 1.4. Kurzzeitplastizität – Doppelpulsverstärkung und -verminderung
  • 1.5. Die Langzeitpotenzierung – Zelluläres Modell für Lernen und Gedächtnis
  • 1.6. Induktionsmechanismen der Langzeitpotenzierung
    • 1.6.1. NMDA-Rezeptor abhängige Langzeitpotenzierung
    • 1.6.2. NMDA-Rezeptor unabhängige Langzeitpotenzierung
  • 1.7. Expressionsmechanismen der Langzeitpotenzierung
  • 1.8. Synaptische Plastizität im Subikulum
  • 1.9. Intrinsische Eigenschaften subikulärer Neurone
  • 1.10. Pathologische Plastizität in chronisch epileptischem Gewebe
• 2.  Fragestellung
• 3.  Material und Methoden
  • 3.1. Präparation der Hirnschnitte der Ratte und verwendete Lösung
  • 3.2. Messkammer
  • 3.3. Pilokarpin-Modell der Temporallappenepilepsie
  • 3.4.  Epilepsiechirurgische Resektate von Patienten mit pharmakoresistenter Temporallappenepilepsie
  • 3.5. Elektrophysiologische Untersuchungen
    • 3.5.1. Extrazelluläre Messungen
    • 3.5.2. Intrazelluläre Messungen
    • 3.5.3. Reizelektroden
    • 3.5.4. Induktion einer Langzeitpotenzierung
  • 3.6. Pharmaka
  • 3.7. Erfassung und Auswertung der Daten
• 4.  Ergebnisse
  • 4.1. Extrazelluläre Ableitungen zur Langzeitpotenzierung im Subikulum der Ratte
  • 4.2. Zellspezifische Langzeitpotenzierung im Subikulum der Ratte
    • 4.2.1. Synaptische Langzeitpotenzierung unter Kontrollbedingungen
    • 4.2.2. APV-sensitive Langzeitpotenzierung in regulär feuernden Zellen
    • 4.2.3. APV-insensitive Langzeitpotenzierung in Bursterzellen
    • 4.2.4. Einfluss des Kalziumchelators BAPTA auf die LTP in Bursterzellen und regulär feuernden Zellen
    • 4.2.5. Applikation des Glutamatantagonisten Kynurensäure
    • 4.2.6. NR2B-abhängige Potenzierung in Bursterzellen
    • 4.2.7. Rolle metabotroper Glutamatrezeptoren in subikulärer LTP
    • 4.2.8. Rolle von L-Typ Kalzium Kanälen in subikulärer LTP
    • 4.2.9.  Rolle von Stickstoffmonoxid in subikulärer LTP
    • 4.2.10. cAMP-abhängige Expression der LTP in Bursterzellen
    • 4.2.11. Effekt von Forskolin in regulär feuernden Zellen
    • 4.2.12. Rolle des H-Stromes in subikulärer LTP
  • 4.3. Untersuchungen zur Kurzzeitplastizität im Subikulum der Ratte
  • 4.4. Charakterisierung des alveären Eingangs in das Subikulum in Pilokarpin-behandelten Tieren
  • 4.5. Langzeitpotenzierung in Pilokarpin-behandelten Tieren
  • 4.6.  Charakterisierung humaner subikulärer Zellen
  • 4.7. Spontane epileptische Aktivität im humanen Subikulum
  • 4.8. Nachhyperpolarisation humaner subikulärer Zellen
• 5.  Diskussion
  • 5.1. Zellspezifische Langzeitplastizität im Subikulum der Ratte
  • 5.2. Prä- versus postsynaptische Induktion der Langzeitpotenzierung
  • 5.3. Beitrag von NMDA-Rezeptoren zur LTP in subikulären Zellen
  • 5.4. Expressionsmechanismen subikulärer LTP
  • 5.5. Pathologische Plastizität in Pilokarpin-behandelten Tieren
  • 5.6. Pathologische Plastizität im humanem Subikulum
• 6.  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Anhang
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung
• Publikationsliste
• Symposiumsbeiträge

Tabellen

• Tabelle 1: Artifizielle zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF)
• Tabelle 2: Verwendete Pharmaka
• Tabelle 3: Intrinsische Eigenschaften humaner subikulärer Zellen in Abhängigkeit vom Wylergrad (*: p = 0.047). Abkürzungen: RMP: Ruhemembranpotentials, Inres: Eingangswiderstand, fAHP: schnelle Nachhyperpolarisation, sAHP: langsame Nachhyperpolarisation.
• Tabelle 4: Nachhyperpolarisation humaner subikulärer Zellen in Abhängigkeit vom spontanen Entladungsverhalten. Abkürzungen: fAHP: schnelle Nachhyperpolarisation, sAHP: langsame Nachhyperpolarisation.

Bilder

• Abb. 1: Schematische Darstellung eines Hirnschnittpräparates (verändert nach Witter).
• Abb. 2: Afferente und efferente Verschaltung des Subikulums (verändert nach Greene).
• Abb. 3: LTP Induktionsmechanismus: Die tetanische Reizung führt zu einer vermehrten Transmitterfreisetzung von Glutamat (A). Über eine Aktivierung von AMPAR wird die postsynaptische Zelle ausreichend depolarisiert um den spannungsabhängigem Magnesiumblock der NMDA-Rezeptoren aufzuheben und den Rezeptor für Natrium- und Kalziumionen durchlässig zu machen (B).
• Abb. 4: LTP Expressionsmechanismus: Ein vermehrter Kalziumeinstrom (1) in die postsynaptische Zelle führt über second-messenger-Kaskaden (2) zu einem Einbau von zusätzlichen AMPA-Rezeptoren in die postsynaptische Membran (3).
• Abb. 5: Foto experimenteller Setup: Messkammer mit Perfusions- und Heizkammer. Ableitelektrode an Headstage und Leitz-Manipulator. Stimulationsmanipulator mit Reizelektrode.
• Abb. 6: Extrazelluläre Ableitungen: (A): ein typisches Beispiel eines Populationsspike nach alveärer Reizung. 1: Baseline-Antwort, 2: Posttetanische Potenzierung, 3: LTP. Die Amplitude des Populationsspike wurde berechnet als (a+b)/2. (B): Zeitverlauf der extrazellulären Antworten (n = 5).
• Abb. 7: Zellspezifische LTP. Beispiele für die unterschiedlichen Zelltypen. (A): typische Beispiele der zellspezifischen LTP, gefüllte Punkte: Bursterzellen (n = 6), offene Punkte: regulär feuernde Zellen (n = 5). 1: Baseline-Antwort, 2: PTP, 3: LTP. (B): zusammengefasste Zeitverläufe für beide Zelltypen.
• Abb. 8: Zusammenfassung der LTP in Burster-, sowie regulär feuernden Zellen. Bursterzellen zeigten eine signifikant erhöhte PTP und LTP im Vergleich zu regulär feuernden Zellen. *: p < 0.05, **: p < 0.01.
• Abb. 9: EPSPs während eines Tetanus. Keine der beiden Zelltypen feuerte ein Aktionspotential während des Tetanus (Darstellung der ersten 10 Pulse). Die Zeitverläufe der Potenzierung zeigen ein typischen Abfall der EPSPs nach wenigen Pulsen.
• Abb. 10: Effekt von APV 60 µM auf die LTP in regulär feuernden Zellen. (A): APV 60 µM hatte keinen Effekt auf die LTP-Amplitude. Ein typisches Beispiel für den Zeitverlauf. Offene Punkte: ACSF, geschlossene Punkte: APV 60 µM (B): Zeitverlauf für n = 6 regulär feuernde Zellen.
• Abb. 11: APV 200 µM blockierte die LTP in regulär feuernden Zellen. (A): Beispielzelle. (B): Zeitverlauf für n = 4.
• Abb. 12: Doppelpulsindex in regulär feuernden Zellen. (A): Zusammenfassendes Balkendiagramm. n.s.: nicht signifikant. (B): Doppelpulsindex vor und nach dem Tetanus zeigte keine signifikante Veränderung (in Gegenwart von APV 60 µM). (C): Typische EPSPs vor und nach LTP-Induktion, sowie normalisierte Doppelpulsantworten.
• Abb. 13: Variationskoeffizient in regulär feuernden Zellen. (A): Datenpunkte entlang der Winkelhalbierenden deuten auf präsynaptische Veränderung nach tetanischer Reizung hin. (B): Zeitverlauf CV-2. Daten auf x-Achse: Mittelwerte der entsprechenden Zeitdauer in Minuten (n = 6).
• Abb. 14: Effekt von APV 60 µM auf die LTP in Bursterzellen. (A): APV 60 µM reduzierte die Amplitude um ungefähr 100 % von 300 auf 200 %. Ein typisches Beispiel einer Bursterzelle. (B): Zeitverlauf für n = 5 Bursterzellen. (C): Zusammenfassendes Balkendiagramm. *: p < 0.05, **: p < 0.01.
• Abb. 15: Effekt von 200 µM APV auf die LTP in Bursterzellen (n = 5).
• Abb. 16: Doppelpulsindex und Variationskoeffizient in Bursterzellen. (A): Änderung des Doppelpulsindexes. Typische EPSPs vor und nach LTP-Induktion sowie normalisierte Doppelpulsantworten. (B): Variationskoeffizient. Datenpunkte entlang der Winkelhalbierenden deuten auf präsynaptische Veränderung nach tetanischer Reizung hin (n = 5).
• Abb. 17: Einfluss des Kalziumchelators BAPTA (200 mM) auf LTP in Bursterzellen und regulär feuernden Zellen. (A): Beispielzellen. Eine halbe Stunde Dialysedauer. (B): Zusammenfassende Zeitverläufe für regulär feuernde Zellen (n = 3) und Bursterzellen (n = 4).
• Abb. 18: Applikation des Glutamatrezeptor Antagonisten Kynurensäure. Nach Auswaschen der Droge zeigte sich keine Zunahme der EPSP Amplitude (n = 5). Der Pfeil markiert den Zeitpunkt des Tetanus.
• Abb. 19: NR2B-abhängige LTP in Bursterzellen. (A): APV 60 µM und Ifenprodil 10 µM blockierten die LTP in Bursterzellen. Nach Auswaschen konnte eine zweihundertprozentige Potenzierung registriert werden. (B): Zusammenfassende Zeitverläufe.
• Abb. 20: Zusammenfassendes Diagramm für Bursterzellen und regulär feuernde Zellen.
• Abb. 21: Einfluss von metabotropen Glutamatrezeptoren auf die subikuläre Langzeitpotenzierung. Offene Punkte: Regulär feuernde Zellen, geschlossene Punkte: Bursterzellen. Die PTP in der Bursterzelle war so massiv, so dass aufgrund der hier gewählten graphischen Darstellung die ersten Werte nicht dargestellt wurden.
• Abb. 22: Einfluss L-Typ Kalzium Kanäle auf LTP in regulär feuernden Zellen. Es zeigte sich nach Applikation von Verapamil kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen.
• Abb. 23: Inhibition der NO-Synthetase nach Inkubation der Hirnschnitte mit Nω-Nitro-Arginine. Kein signifikanter Unterschied der LTP in regulär feuernden Zellen zu den Kontrollwerten.
• Abb. 24: cAMP-abhängige Expression der LTP in Bursterzellen. (A): Forskolin-induzierte Verstärkung der synaptischen Transmission. Nach 20 Minuten Applikationsdauer tetanische Reizung. Es konnte keine signifikante Potenzierung nach dem Tetanus nachgewiesen werden. (B,C): Der Doppelpulsindex zeigte eine hoch signifikante Änderung nach Badapplikation von Forskolin (n = 7). (C): Zusammenfassung der Experimente in Gegenwart von 60 µM APV.
• Abb. 25: Effekte von Forskolin auf EPSP Amplitude in regulär feuernden Zellen. (A): Beispielzelle. (B): Zusammenfassung von n = 6 regulär feuernden Zellen.
• Abb. 26: Zusammenfassung der normalisierten EPSP Amplituden nach Applikation von Forskolin. (A): zellspezifische Potenzierung. (B): Doppelpulsindex in regulär feuernden Zellen.
• Abb. 27: Einfluss des Ih-Blockers Cs+ (3 mM) auf LTP in Bursterzellen. (A): Cäsium erhöhte den Eingangswiderstand (Pfeile). (B): LTP Protokoll in Gegenwart von Cs+ und APV (60 µM).
• Abb. 28: Kurzzeitplastizität im Subikulum. (A): Doppelpulsexperimente mit Interstimulusintervallen (ISI) von 20, 50 und 100 ms. Es fand sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen beiden Zelltypen. (B1-B3): Auftragung der Größe des ersten EPSP gegenüber dem Doppelpulsindex. In allen drei Gruppen fand sich ein negativ proportionaler Zusammenhang.
• Abb. 29: Charakterisierung synaptisch evozierter Potentiale im Subikulum Pilokarpin-behandelter Tiere. (A): Alveäre Stimulation erzeugte im Kontrollgewebe ein EPSP, bei steigender Stimulationsstärke ein Burst von Aktionspotentialen. (B1): im Pilokarpin-behandelten Tier fand sich ein doppelgipfliges EPSP (Pfeile), bei erhöhter Stimulationsstärke feuerte die Zelle ein AP auf das zweite EPSP. (B2): In den Zellen, die lediglich ein EPSP auf einen Stimulus zeigten, konnte ein doppelgipfliges EPSP durch die Applikation des GABAA-Antagonisten Bicuculline erzeugt werden. Man beachte die unterschiedliche Zeitskala zwischen A und B1, B2.
• Abb. 30: Polysynaptische Signale nach Alveusstimulation im Pilokarpin-behandelten Tier. Bei niedriger Stimulationsstärke konnte kein EPSP aufgezeichnet werden (2V), bei Erhöhung antwortete die Zelle nach dem „Alles-oder-nichts“ Prinzip (4V). Bei erhöhter Stimulationsintensität zeigte sich ein initiales EPSP (6,10V). (B): Abnahme der Latenz synaptisch evozierter Potentiale bei steigender Stimulationsintensität deuten auf ein polysynaptisches Signal hin. Aufzeichnungen unter GABAA-Rezeptor Blockade.
• Abb. 31: Beispiel einer extrazellulären Ableitung im Pilokarpin-behandelten Tier. Populationspike erreichte zwanzig Minuten nach tetanischer Reizung wieder das Ausgangniveau. Aufzeichnungen in ACSF.
• Abb. 32: Vergleich von Bursterzellen im Pilokarpin-behandelten Tier und Kontrolltieren. Abfall der EPSP-Amplitude im Pilokarpin-behandelten Tieren innerhalb von 20 Minuten. Im Kontrolltier zeigte sich hingegen eine stabile Potenzierung (Kapitel 4.2). Aufzeichnungen in Gegenwart des GABAA-Rezeptor Antagonisten BCM.
• Abb. 33: Beispiel einer regulär feuernden Zelle im Pilokarpin-behandelten Tier. Vor Induktion der LTP (fette Linie) zeigte sich kein offensichtlicher Unterschied im Vergleich zum Kontrolltier. Nach Potenzierung wurden Aktionspotentiale vor der 2.Stimulation aufgezeichnet. Inlay: EPSPs während tetanischer Reizung. Bereits nach wenigen Pulsen zeigten sich Aktionspotentiale. Aufzeichnungen unter GABAA-Rezeptor Blockade.
• Abb. 34: Charakterisierung humaner subikulärer Pyramidalzellen. (A): Bursterzellen und regulär feuernde Zellen. (B): Im AHS Gewebe betrug der Anteil regulär feuernder Zellen 75 %, (n = 18) und im Non-AHS Gewebe 79 % (n = 15). Pfeil: spontane interiktale Aktivität.
• Abb. 35: Anzahl der Zellen in Abhängigkeit vom Wylergrad.
• Abb. 36: Spontane interiktale Aktivität im humanen Subikulum. Im AHS-Gewebe zeigten 56% der abgeleiteten Zellen sponaten interiktale Aktivität., im Non-AHS-Gewebe 28% der Zellen. Diese in vitro-Aktivität korrelierte sehr gut mit den EEG-Ableitungen (in vivo).  [Die EEG-Ableitungen, sowie deren Auswertung wurden von Herrn Dr. C. Dehnicke, EZBB, sowie Herrn Dr. T.-N. Lehmann, Charité, Neurochirurgie. durchgeführt].
• Abb. 37: Interiktale Aktivität wurde durch den AMPAR-Antagonist NBQX (A) sowie den GABAA-Rezeptor Antagonist Bicuculline geblockt (B).
• Abb. 38: Spannungsabhängigkeit der spontanen, interiktalen Aktivität. (A): Beispiel bei Ruhemembranpotential von –69 mV. Depolarisierung auf –64mV verstärkte die hyperpolarisierenden Ereignisse. Hyperpolarisierung auf –79 mV zeigte depolarisierende Ereignisse. (B): Grafische Auftragung der gemessenen Ereignisse gegenüber dem Haltepotential. Es ergibt sich ein Umkehrpotential von –76,3 mV.
• Abb. 39: Nachhyperpolarisation humaner subikulärer Zellen in Abhängigkeit vom spontanen Entladungsverhalten. Der Pfeil in der Abbildung zeigt spontane interiktale Aktivität.