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3.  Material und Methoden

3.1. Präparation der Hirnschnitte der Ratte und verwendete Lösung

Adulte Ratten (6-8 Wochen, beiden Geschlechts) wurden mit Äther anästhesiert, die Gehirne entnommen und in 0-4° C kalter artifizieller zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) überführt. Mit Hilfe eines Vibratoms (Campden Instruments Ltd.) wurden 400 µM dünne, horizontale Hirnschnitte bestehend aus Hippokampus, subikulärem Komplex, entorhinaler und perirhinaler Region sowie Teilen des temporalen Kortex (Abb. 1) angefertigt. Die Hirnschnitte wurden in eine Interface-Kammer überführt, welche mit begaster (95%O2, 5% CO2), vorgewärmter (32-34o C) ACSF bei einem pH von 7,4 perfundiert wurde (in mM):

Tabelle 1: Artifizielle zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF)

NaCl

129

Na2PO4

1,25

NaHCO3

21

KCl

3

CaCl2

1,6

MgSO4

1,8

Glucose

10

3.2. Messkammer

Die Abbildung 5 zeigt die Messkammer, die aus einer Perfusions- und einer Heizkammer besteht. Die Perfusionskammer wird mit einem speziellen Filterpapier ausgelegt, auf dem die Schnitte aufbewahrt werden. Die Perfusionsgeschwindigkeit beträgt ca. 1.5 ml/min. Die Heizkammer ist mit Aqua bidest gefüllt, erwärmt die zugeführte Lösung und leitet Carbogen (95%O2, 5% CO2) an die Oberfläche der Hirnschnitte. Unter diesen Bedingungen bleiben die Hirnschnitte ca. 12 bis 14 h vital.


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Abb. 5: Foto experimenteller Setup: Messkammer mit Perfusions- und Heizkammer. Ableitelektrode an Headstage und Leitz-Manipulator. Stimulationsmanipulator mit Reizelektrode.

3.3. Pilokarpin-Modell der Temporallappenepilepsie

Das Pilokarpin-Modell ist ein anerkanntes Modell der TLE. Die Behandlung von Ratten mit dem muskarinergen Agonisten Pilokarpin löst bei den Tieren einen Status epilepticus aus. In der vorliegenden Studie wurden adulte Ratten (150 – 230 g) mit Pilokarpin behandelt (intraperitoneale Applikation von 340 mg/kg KG). Nach wenigen Minuten zeigten die Tiere initiale Symptome einer Akinesie, orofaziale Automatismen und eines Kopftremors, und nachfolgend einen generalisierten tonisch-klonischen Anfall. Nach eineinhalb Stunden wurde der Anfall mit Diazepam (5 – 10 mg/kg KG) unterbrochen. Nach einer Latenzzeit („silent period“) von 4 bis 6 Wochen zeigten die Tiere spontan auftretende epileptische Anfälle (Cavalheiro, 1995). Um dies sicherzustellen, wurden die Tiere über 24 bis 48 Stunden videoüberwacht. Erst danach wurden die Gehirne der Tiere entnommen und die angefertigten Hirnschnitte elektrophysiologisch untersucht.


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3.4.  Epilepsiechirurgische Resektate von Patienten mit pharmakoresistenter Temporallappenepilepsie

Die humanen Hirnschnittpräparate dieser Studie entstammen Patienten mit einer pharmakoresistenten Temporallappenepilepsie. Im Rahmen der prächirurgischen Diagnostik wurde eine Beteiligung des mesialen Temporallappens mittels Bildgebung und elektroenzephalografischer Diagnostik gesichert. Die Patienten wurden präoperativ über die Untersuchungen an dem entnommen Gewebe aufgeklärt. Ein schriftliches Einverständnis der Patienten lag vor. Eine Übersicht über die biografischen Daten der Patienten findet sich in der Anlage. Alle Untersuchungen erfolgten gemäß den Richtlinien und der Zustimmung der hiesigen Ethikkommission.

Die Operationsresektate wurden nach dem Transport aus der neurochirurgischen

Klinik der Charité in horizontale, 500 µm dünne Schnitte geschnitten und in einer Interface-Kammer aufbewahrt.

3.5. Elektrophysiologische Untersuchungen

3.5.1. Extrazelluläre Messungen

Zur Aufzeichnung extrazellulärer Feldpotentiale wurden Glaspipetten von 1,5-2,0 mm Außendurchmesser verwendet. Die Elektroden wurden mit ACSF gefüllt und unter Sicht im Subikulum platziert. Nach Stimulation der alveären Afferenzen mittels einer bipolaren Stimulationselektrode konnte ein Populationsspike aufgezeichnet werden. Dieser spiegelt eine synchronisierte Entladung von mehreren hundert Nervenzellen dar. Als Verstärker wurde sowohl für die extra- wie für die intrazellulären Messungen ein SEC 5 LX- oder SEC 10 LX-Verstärker der Firma NPI Instruments verwendet.

3.5.2. Intrazelluläre Messungen

Die Untersuchung der intrinsischen und synaptischen Eigenschaften subikulärer Neurone erfolgte in der Strom- oder Spannungsklemme mit scharfer Mikroelektrode. Mit Hilfe eines Leitz-Manipulators (siehe Abbildung 5) wurde eine Mikroelektrode unter mikroskopischer Sicht im Subikulum platziert. Unter ständiger Applikation eines hyperpolarisierenden Strompulses (-0.1nA) wurde die Elektrode vorgetrieben und eine [Seite 22↓]Zelle unter Zuhilfenahme eines kurzen, oszillierenden Strompulses („buzz“) penetriert. Nach Stabilisierung des Ruhemembranpotentials wurde die Zellen auf ihre intrinsischen Eigenschaften untersucht. Es wurden insbesondere der Eingangswiderstand, das Entladungsverhalten sowie die Akkommodation der Zelle bestimmt. Während der Messung wurde eine Änderung des Eingangswiderstandes von bis zu 20 % des Ausgangwertes akzeptiert. In Analogie zu vorherigen Publikationen konnte zwischen beiden subikulären Zelltypen kein signifikanter Unterschied der passiven Membraneigenschaften festgestellt werden (Staff et al., 2000; Taube, 1993).

3.5.3. Reizelektroden

Afferente Verbindungen subikulärer Pyramidenzellen wurden mit Hilfe einer bipolaren Mikrostimulationselektroden synaptisch aktiviert. Stimuliert wurde mit Einzel- und Doppelpulsen (50-100 µs Dauer, 20-100 ms Interstimulusintervall).

3.5.4. Induktion einer Langzeitpotenzierung

Die Induktion einer LTP erfolgte mit vier hochfrequenten Stimulationen (100 Hz, Dauer 1 s) im Abstand von 10 s. Nachfolgend wurde über einen Zeitraum von > 15 min aufgezeichnet (alle 30 s ein Doppelpuls), um das Ausmaß der LTP nach tetanischer Stimulation beurteilen zu können. Die intrazelluläre Ableitungen wurden bei Ruhemembranpotential (Stromklemme/Brückenschaltung) in Gegenwart des GABAA-Rezeptor Antagonist Bicuculline (BCM) durchgeführt, um auszuschließen, dass die LTP durch eine Abnahme der GABAA-vermittelten Inhibition bedingt ist. Zur Verminderung polysynaptischer Antworten wurde die Magnesium- und Kalziumkonzentration auf 4 mM angehoben.

3.6. Pharmaka

Die folgende Tabelle fasst die verwendeten Pharmaka und deren Wirkung zusammen:


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Tabelle 2: Verwendete Pharmaka

Pharmaka

Funktion

Konzentration

D,L-2-Amino-5-phosphono-valeric acid (D,L-APV)

NMDA-Rezeptor Antagonist

60-200 µM

1,2-bis(2-aminophenoxy) ethane- N,N,N',N' -tetraacetic acid (BAPTA)

Kalziumchelator

200 mM

Bicuculline (BCM)

GABAA-Rezeptor Antagonist

5 µM

Cäsiumchlorid

Blockade des H-Stroms, sowie verschiedener Kaliumkanäle z.B. des KIR

3 mM

1,9-Dideoxyforskolin

Inaktives Analogon von Forskolin

50 µM

Forskolin

Zellpermeabler Aktivator von cAMP

50 µM

Ifenprodil

Antagonist der NMDAR-2B Untereinheit

10 µM

Kynurensäure

Glutamatrezeptor-Antagonist

5-10 mM

Nω-Nitro-L-Arginine

Inhibitor der NO-Synthetase

50 µM

RS-alpha-methyl-4-carboxy-phenylglycine (RS-MCPG)

Antagonist der metabotropen Glutamatrezeptoren der Gruppe I und II

500 µM

Verapamil

Antagonist des L-Typ Kalziumkanals

50-100 µM

3.7. Erfassung und Auswertung der Daten

Für die Erfassung der Daten wurde das Programm TIDA (Heka, Lambrecht) verwendet. Alle Daten wurde online auf einem Oszillografen gesichtet. Nach Aufnahme von stabilen Kontrollwerten über einen Zeitraum von 10- bis 20 Minuten, einer sogenannten Baseline, erfolgte das LTP-Protokoll und die anschließende off-line Auswertung der LTP.

Der Doppelpulsindex wurde als Amplitude des zweiten EPSP (bzw. des Populationsspike) dividiert durch die Amplitude des ersten EPSP berechnet.


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Neben dem Doppelpulsindex stellt die Analyse des Variationskoeffizienten (CV) eine statistische Methode zur Beschreibung eines präsynaptischen Effektes dar. Der CV ist lediglich abhängig von zwei präsynaptischen Parametern: der Anzahl der Freisetzungsstellen (n) und der Freisetzungswahrscheinlichkeit (p) von Transmittermolekülen. Er berechnet sich als CV = [(1 – p)/np] -1/2 (Manabe et al., 1993; Voronin, 1993).

Im Rahmen elektrophysiologischer Untersuchungen zur synaptischen Plastizität wird meist der Term CV-2 verwendet (Bekkers & Stevens, 1990; Malinow & Tsien, 1990; Manabe et al., 1993). Er berechnet sich als CV-2 = (Mittelwert)2/(Standardabweichung)2.

Das arithmetische Mittel ist als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Statische Tests wurden mit Hilfe von Excel (Microsoft) durchgeführt. Es wurde in der Regel, wenn nicht gesondert erwähnt, ein Student’s t-test durchgeführt. Für die erhobenen Daten wurde eine Normalverteilung angenommen. Das Signifikanz-Niveau wurde auf p < 0,05 festgelegt. Ein p < 0,01 wurde als „hoch signifikant“ definiert, ein p < 0,001 als „höchst signifikant“.


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09.03.2005