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4.  Ergebnisse

4.1. Extrazelluläre Ableitungen zur Langzeitpotenzierung im Subikulum der Ratte

Stimulation der Axone von Pyramidalzellen der Area CA1 im Alveus führte bei extrazellulärer Ableitung im Subikulum zu einem Populationsspike. Ein typisches Beispiel ist in der Abbildung 6A zu sehen. Die multiplen Populationsspikes sind auf die synchronisierten Entladungen von Bursterzellen zurückzuführen (Stewart, 1997). Die maximale Größe der abgeleiteten Feldpotentiale betrug in der Regel 1,5-2 mV.

Für die Untersuchung der synaptischen Plastizität wurde eine Feldpotentialgröße von 30-50% des Maximalwertes gewählt. Nach Aufzeichnung einer Baseline über einen Zeitraum von 20 Minuten wurden subikuläre Neurone tetanisch stimuliert. In der Abbildung 6A sieht man, dass es nach dem Tetanus zu einer Vergrößerung des Populationsspike gekommen ist. Der Populationsspike direkt nach dem Tetanus zeigt die posttetanische Potenzierung (PTP) an. Im Verlauf der Messung nimmt die PTP ab und geht in eine stabile LTP über, welche unter in vitro Bedingungen mehrere Stunden anhält (Abraham & Williams, 2003).

In den extrazellulären Ableitungen konnte eine stabile Potenzierung über mindestens 50 bis 60 Minuten aufgezeichnet werden. Die GABAerge Transmission wurde in den extrazellulären Ableitungen nicht geblockt. Die PTP betrug 165 ± 8% der Kontrollamplitude (p < 0,01), die LTP 30 Minuten nach tetanischer Reizung 129 ± 7% und 50 Minuten danach 124 ± 3% (Abbildung 6B, n = 5, p < 0,05).


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Abb. 6: Extrazelluläre Ableitungen: (A): ein typisches Beispiel eines Populationsspike nach alveärer Reizung. 1: Baseline-Antwort, 2: Posttetanische Potenzierung, 3: LTP. Die Amplitude des Populationsspike wurde berechnet als (a+b)/2. (B): Zeitverlauf der extrazellulären Antworten (n = 5).

4.2. Zellspezifische Langzeitpotenzierung im Subikulum der Ratte

4.2.1. Synaptische Langzeitpotenzierung unter Kontrollbedingungen

Tetanische Stimulation erzeugte sowohl in regulär feuernden als auch in Bursterzellen eine PTP und eine LTP (30 Minuten nach Tetanus). Während der intrazellulären Ableitungen wurde die schnelle GABAerge Neurotransmission mit dem GABAA-Rezeptor Antagonisten Bicuculline (5 µM, BCM) blockiert, um auszuschließen, dass eine LTP nicht durch eine Abnahme der GABAA-vermittelten Inhibition bedingt ist.


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Bursterzellen zeigten eine PTP von 521 ± 80 % der Kontrollamplitude (p < 0,01 verglichen mit Werten vor der tetanischen Reizung) und eine LTP von 282 ± 30 % der Kontrollamplitude (n = 6, p < 0,01). In regulär feuernden Zellen fand sich eine PTP von 228 ± 29 % (p < 0,05) und eine LTP von 166 ± 26 % der Kontrollamplitude (p < 0,05, n = 5, Abbildung 7).

Abb. 7: Zellspezifische LTP. Beispiele für die unterschiedlichen Zelltypen. (A): typische Beispiele der zellspezifischen LTP, gefüllte Punkte: Bursterzellen (n = 6), offene Punkte: regulär feuernde Zellen (n = 5). 1: Baseline-Antwort, 2: PTP, 3: LTP. (B): zusammengefasste Zeitverläufe für beide Zelltypen.


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Bursterzellen zeigten eine signifikant erhöhte PTP (p < 0,05) und LTP (p < 0,05) im Vergleich zu regulär feuernden Zellen. In Abbildung 8 sind die Ergebnisse als Balkendiagramm für beide Zelltypen zusammengefasst.

Abb. 8: Zusammenfassung der LTP in Burster-, sowie regulär feuernden Zellen. Bursterzellen zeigten eine signifikant erhöhte PTP und LTP im Vergleich zu regulär feuernden Zellen. *: p < 0.05, **: p < 0.01.

Bursts von Aktionspotentialen während des Stimulationsprotokolls könnten zu einen vermehrten Einstrom von Kalziumionen in die Zelle führen und so eine vergrößerte LTP bedingen. Während des Stimulationsprotokolls wurde deshalb darauf geachtet, dass die Neurone keine Aktionspotentiale feuerten (Abbildung 9). Lediglich in einer Bursterzelle wurde ein Burst von Aktionspotentialen während des Tetanus aufgezeichnet. Eine vergrößerte LTP Amplitude, sowie ein veränderter Zeitverlauf konnte aber nicht registriert werden.


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Abb. 9: EPSPs während eines Tetanus. Keine der beiden Zelltypen feuerte ein Aktionspotential während des Tetanus (Darstellung der ersten 10 Pulse). Die Zeitverläufe der Potenzierung zeigen ein typischen Abfall der EPSPs nach wenigen Pulsen.

4.2.2. APV-sensitive Langzeitpotenzierung in regulär feuernden Zellen

Wie bereits in der Einleitung beschrieben, ist die LTP in den meisten bislang untersuchten Hirnregionen NMDAR-abhängig. (Ausnahmen siehe Einleitung). Badapplikation des NMDAR-Antagonisten D,L-APV (im weiteren bezeichnet als APV) in einer gängigen Konzentration von 60 µM (Zalutsky & Nicoll, 1990)1 konnte die Induktion der LTP in regulär feuernden Zellen allerdings nicht unterdrücken. In Anwesenheit von APV (60 µM) betrug die PTP 246 ± 34 % und die LTP 150 ± 14 % der Kontrollamplitude (p < 0,01, n = 6, Abbildung 10 und 11A).


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Abb. 10: Effekt von APV 60 µM auf die LTP in regulär feuernden Zellen. (A): APV 60 µM hatte keinen Effekt auf die LTP-Amplitude. Ein typisches Beispiel für den Zeitverlauf. Offene Punkte: ACSF, geschlossene Punkte: APV 60 µM (B): Zeitverlauf für n = 6 regulär feuernde Zellen.

In der Literatur werden zur Blockade NMDA-vermittelter synaptischer Antworten auch höhere Konzentrationen an APV verwendet (Mellor & Nicoll, 2001; Schmitz et al., 2003). So konnte unter 200 µM APV die LTP in den regulär feuernden Zellen blockiert werden.


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Abb. 11: APV 200 µM blockierte die LTP in regulär feuernden Zellen. (A): Beispielzelle. (B): Zeitverlauf für n = 4.

In Abbildung 11 sind die Ergebnisse für vier Zellen zusammengefasst. Zehn Minuten nach dem Tetanus war der posttetanische Anstieg der EPSP Amplituden bereits wieder auf 101 ± 6 % der Kontrollamplitude abgefallen.

Wie bereits in Kapitel 1.4 beschrieben, erlaubt der Doppelpulsindex Rückschlüsse auf den Expressionsort der LTP. Eine Änderung des Doppelpulsindex nach tetanischer Reizung weist auf eine präsynaptische Expression der LTP hin (Debanne et al., 1996). In den regulär feuernden Zellen konnte keine signifikante Änderung des Doppelpulsindexes festgestellt werden. Vor tetanischer Reizung betrug der Doppelpulsindex 1,30 ± 0,13, danach 1,17 ± 0,13 (n = 6, p = 0,47, Abbildung 12).


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Abb. 12: Doppelpulsindex in regulär feuernden Zellen. (A): Zusammenfassendes Balkendiagramm. n.s.: nicht signifikant. (B): Doppelpulsindex vor und nach dem Tetanus zeigte keine signifikante Veränderung (in Gegenwart von APV 60 µM). (C): Typische EPSPs vor und nach LTP-Induktion, sowie normalisierte Doppelpulsantworten.

Die Berechnung des Variationskoeffizienten (CV, bzw. CV-2, siehe Material und Methoden) stellt neben dem Doppelpulsindex eine weitere Methode dar, indirekt eine Veränderung der präsynaptischen Transmitterfreisetzung nachzuweisen (Faber & Korn, 1991). Bei Wahl eines fünfminütigen Intervalls zur Bestimmung des CV-2 ergab sich ein heterogenes Bild. Vergleicht man das Intervall von „minus 5 bis 0“ Minuten vor LTP Induktion (mittlerer CV-2 mit 65,6 ± 10,0, Abbildung) mit dem Intervall „5 bis 10“ Minuten nach Hochfrequenzstimulation (mittlerer CV-2 mit 103,3 ± 26,6), so konnte keine statistisch signifikante Veränderung des CV-2 festgestellt werden (p = 0,23, n = 6). Zwischen dem Intervall von „minus 10 bis minus 5“ Minuten vor LTP Induktion und dem Intervall „10 bis 15“ Minuten nach tetanischer Reizung (mittlerer CV-2 mit 108,5 ± 32,7) zeigte sich allerdings ein signifikanter Unterschied (p = 0,03). Somit muss man an dieser Stelle feststellen, dass sich aus diesen Daten kein definitiver Schluss über den Ort der LTP Expression ziehen lässt.

Interessanterweise konnten Manabe und Kollegen nach Induktion einer LTP in der Area CA1 ebenfalls keine Veränderung des Doppelpulsindex, wohl aber eine Zunahme des Variationskoeffizienten feststellen. Die Gründe hierfür sind bis dato unklar (Manabe et al., 1993).


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Abb. 13: Variationskoeffizient in regulär feuernden Zellen. (A): Datenpunkte entlang der Winkelhalbierenden deuten auf präsynaptische Veränderung nach tetanischer Reizung hin. (B): Zeitverlauf CV-2. Daten auf x-Achse: Mittelwerte der entsprechenden Zeitdauer in Minuten (n = 6).

4.2.3. APV-insensitive Langzeitpotenzierung in Bursterzellen

Im Gegensatz zu den regulär feuernden Zellen konnte die Verwendung von APV in den Konzentrationen von 60 und 200 µM die LTP in den Bursterzellen nicht vollständig blockieren. 60 µM APV reduzierte die Amplitude der LTP um ungefähr 100 % von 300 auf 200 % der Kontrollamplitude (207 ± 11 %, p < 0,05, n = 5, Abbildung 14). Eine Erhöhung der Konzentration von 60 auf 200 µM ergab eine weitere Reduktion um 50 % auf 145 ± 10 % der Amplitude (n = 5, p < 0,05, Abbildung 15).


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Abb. 14: Effekt von APV 60 µM auf die LTP in Bursterzellen. (A): APV 60 µM reduzierte die Amplitude um ungefähr 100 % von 300 auf 200 %. Ein typisches Beispiel einer Bursterzelle. (B): Zeitverlauf für n = 5 Bursterzellen. (C): Zusammenfassendes Balkendiagramm. *: p < 0.05, **: p < 0.01.

Somit zeigte sich in Bursterzellen im Gegensatz zu regulär feuernden Zellen eine signifikante Reduktion der LTP in Gegenwart von 60 µM APV sowie eine residuale Komponente nach Badapplikation der erhöhten APV Konzentration von 200 µM.

Abb. 15: Effekt von 200 µM APV auf die LTP in Bursterzellen (n = 5).


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Die Auswertung des Doppelpulsindexes in Bursterzelle zeigte eine hochsignifikante Veränderung nach Tetanisierung. So änderte sich der Doppelpulsindex von 1,47 ± 0,15 zu 1,08 ± 0,10 (n = 5, 60 µM APV, p < 0.01, Abbildung 16 A).

Abb. 16: Doppelpulsindex und Variationskoeffizient in Bursterzellen. (A): Änderung des Doppelpulsindexes. Typische EPSPs vor und nach LTP-Induktion sowie normalisierte Doppelpulsantworten. (B): Variationskoeffizient. Datenpunkte entlang der Winkelhalbierenden deuten auf präsynaptische Veränderung nach tetanischer Reizung hin (n = 5).

Auch die Veränderung des Variationskoeffizienten in den Bursterzellen weist auf eine präsynaptische Expression hin. So liegen die errechneten Datenpunkte entlang der Winkelhalbierenden (Abbildung 16B).

4.2.4. Einfluss des Kalziumchelators BAPTA auf die LTP in Bursterzellen und regulär feuernden Zellen

Der Doppelpulsindex sowie die Veränderungen des Variationskoeffizienten geben eindeutige Hinweise auf eine präsynaptische Komponente der LTP in den Bursterzellen. Um zu belegen, dass die LTP in Bursterzellen tatsächlich unabhängig von dem postsynaptischen Einstrom von Kalzium ist, wurden vier Bursterzellen mit je 200 mM BAPTA dialysiert. Nach einer Dialysedauer von einer halben Stunde (n = 2) bis zu einer Stunde (n = 2) konnte noch eine LTP ausgelöst werden. Abbildung 17 zeigt ein Beispiel. Dies zeigt, dass ein Teil der LTP in Bursterzellen unabhängig ist von dem postsynaptischen Einstrom von Kalzium. Sie wird somit präsynaptisch induziert und exprimiert.


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In den regulär feuernden Zellen zeigten der Doppelpulsindex und die Veränderungen des Variationskoeffizienten widersprüchliche Ergebnisse. In Analogie zu den Bursterzellen wurden drei regulär feuernde Zellen mit 200 mM BAPTA dialysiert. Nach einer Dialysedauer von einer halben Stunde konnte in den regulär feuernden Zellen im Gegensatz zu den Bursterzellen keine LTP mehr ausgelöst werden (n = 3, Abbildung 17). Diese Ergebnisse zeigen, dass die LTP in den regulär feuernden Zellen postsynaptisch induziert wird.

Abb. 17: Einfluss des Kalziumchelators BAPTA (200 mM) auf LTP in Bursterzellen und regulär feuernden Zellen. (A): Beispielzellen. Eine halbe Stunde Dialysedauer. (B): Zusammenfassende Zeitverläufe für regulär feuernde Zellen (n = 3) und Bursterzellen (n = 4).

4.2.5. Applikation des Glutamatantagonisten Kynurensäure

Um neben dem veränderten Doppelpulsindex, dem CV-2-Index sowie den BAPTA-Experimenten einen weiteren Beleg für eine präsynaptische Expression der LTP in den Bursterzellen zu bekommen, wurde im nächsten Schritt das LTP-Protokoll in Gegenwart des Glutamatrezeptorantagonist Kynurensäure durchgeführt. Die Applikation von Kynurensäure blockiert alle ionotropen Glutamatrezeptoren, dass heißt sowohl AMPA-, NMDA- als auch Kainatrezeptoren. Somit ist der Kalziumeinstrom durch NMDAR in die postsynaptische Zelle blockiert. Zusätzlich wird der Kalziumeinstrom über spannungsabhängige Kalziumkanäle blockiert, da die postsynaptische Zelle in Anwesenheit von Kynurensäure nicht ausreichend depolarisiert werden kann. Veränderungen, die eine erhöhte Kalziumkonzentration in der Postsynapse benötigen, z.B. der Einbau von zusätzlichen AMPAR in die postsynaptische Membran, sind somit nicht mehr möglich (siehe Einleitung). Die Transmitterfreisetzung aus der [Seite 37↓]präsynaptischen Endigung erfolgt aufgrund eines Kalziumeinstromes durch evozierte Aktionspotentiale und Aktivierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle. Sie wird durch die Applikation von Kynurensäure nicht beeinträchtigt. Die Induktion einer präsynaptischen, NMDAR-unabhängigen LTP in Bursterzellen, die auf einer erhöhten Transmitterfreisetzung beruhen könnte, müsste aufgrund dieser Überlegungen unter Applikation von Kynurensäure nicht beeinträchtigt sein.

Nach kurzer 5 bis 10 minütiger Applikation von Kynurensäure wurde die synaptische Transmission komplett blockiert. Zum Zeitpunkt Null konnte keine postsynaptische Antwort mehr aufgezeichnet werden. Der subikuläre Eingang wurde tetanisch gereizt und die Kynurensäure wieder ausgewaschen. Die Auswaschzeit betrug in der Regel 30 bis 45 Minuten. Wider Erwarten konnte nach Auswaschen des Glutamatrezeptorantagonisten keine Potenzierung der EPSP Amplitude festgestellt werden (50 Minuten nach Tetanus 106 ± 3 %, n = 5, Abbildung 17).

Abb. 18: Applikation des Glutamatrezeptor Antagonisten Kynurensäure. Nach Auswaschen der Droge zeigte sich keine Zunahme der EPSP Amplitude (n = 5). Der Pfeil markiert den Zeitpunkt des Tetanus.

4.2.6. NR2B-abhängige Potenzierung in Bursterzellen

Aufgrund der verschiedenden Hinweise auf eine präsynaptische Form der LTP legt die fehlende Potenzierung nach Auswaschen von Kynurensäure den Schluss nahe, dass Glutamatrezeptoren einen Beitrag zur präsynaptischen LTP in Bursterzellen leisten könnten. Die konzentrationsabhängige Wirkung von APV deutet auf eine Beteiligung verschiedener Untereinheiten des NMDAR hin. Es ist bekannt, dass APV eine geringere Affinität zu NR2B- als zu NR2A-Untereinheiten hat (Buller & Monaghan, 1997; Hrabetova et al., 2000; Laurie & Seeburg, 1994). Um dies zu überprüfen, wurde [Seite 38↓]der selektive NR2B-Antagonist Ifenprodil eingesetzt (Williams, 1993). In der Tat blockierte Ifenprodil zusammen mit APV in der Konzentration von 60 µM die Induktion einer LTP in Bursterzellen (Abbildung 19A). Nach Auswaschen von APV und Ifenprodil war eine 200 %-ige Potenzierung auslösbar. Eine Zusammenfassung der Daten ist in Abbildung 19B zu sehen (110 ± 5 %, n = 4, p = 0,18).

Abb. 19: NR2B-abhängige LTP in Bursterzellen. (A): APV 60 µM und Ifenprodil 10 µM blockierten die LTP in Bursterzellen. Nach Auswaschen konnte eine zweihundertprozentige Potenzierung registriert werden. (B): Zusammenfassende Zeitverläufe.

Die alleinige Applikation von Ifenprodil unterdrückte die LTP zu 192 ± 27 % (n = 4, Abbildung 20), konnte sie aber nicht vollständig aufheben. Der Doppelpuls änderte sich nach Applikation von Ifenprodil nicht signifikant von 1,37 ± 0,13 zu 1,28 ± 0,15 (15 Minuten nach Tetanus, p > 0,05). Dies weist darauf hin, dass die Ifenprodil-insensitive LTP postsynaptisch exprimiert wird. Umgekehrt lässt sich schlussfolgern, dass die [Seite 39↓]Ifenprodil-sensitive LTP der präsynaptischen LTP in den Bursterzellen entspricht. In regulär feuernden Zellen konnte Ifenprodil die LTP nicht blockieren (145 ± 22 %, n = 3).

Abb. 20: Zusammenfassendes Diagramm für Bursterzellen und regulär feuernde Zellen.

4.2.7. Rolle metabotroper Glutamatrezeptoren in subikulärer LTP

Da es eine Vielzahl von Hinweisen auf eine Beteiligung von metabotropen Glutamatrezeptoren im Rahmen synaptischer Plastizitätphänomene gibt, wurde in den folgenden Experimenten die Rolle metabotroper Glutamatrezeptoren untersucht (Riedel & Reymann, 1996; Yeckel et al., 1999). (RS) – MCPG blockiert die metabotropen Glutamatrezeptoren der Gruppe I und II. Wie in Abbildung 21 zu sehen ist, konnte (RS) – MCPG die Induktion sowohl in den Bursterzellen, als auch in den regulär feuernden Zellen nicht unterbinden. Nach einer Zeit von 15 Minuten betrug auch hier die Potenzierung ungefähr 300 %. In der abgebildeten regulär feuernden Zelle fand man nach 15 Minuten eine einhundertfünfzigfache Potenzierung. Diese Werte sind sehr gut vergleichbar mit den Kontrolldaten.


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Abb. 21: Einfluss von metabotropen Glutamatrezeptoren auf die subikuläre Langzeitpotenzierung. Offene Punkte: Regulär feuernde Zellen, geschlossene Punkte: Bursterzellen. Die PTP in der Bursterzelle war so massiv, so dass aufgrund der hier gewählten graphischen Darstellung die ersten Werte nicht dargestellt wurden.

4.2.8. Rolle von L-Typ Kalzium Kanälen in subikulärer LTP

Untersuchungen zur synaptischen Plastizität in der Area CA1 konnten zeigen, dass L-Typ Kalzium Kanäle neben NMDAR an der Induktion der LTP beteiligt sind (Golding et al., 2002). Der Beitrag dieser Kanäle zur LTP in regulär feuernden Zellen wurde mit dem Antagonisten Verapamil (50 – 100 µM) untersucht. 15 Minuten nach Tetanisierung zeigte sich kein signifikanter Unterschied zu den Kontrollwerten. Die normalisierte EPSP-Amplitude betrug 1,57 ± 0,23 (n = 4, Abbildung 22).

Abb. 22: Einfluss L-Typ Kalzium Kanäle auf LTP in regulär feuernden Zellen. Es zeigte sich nach Applikation von Verapamil kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen.


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4.2.9.  Rolle von Stickstoffmonoxid in subikulärer LTP

Als membranpermeables Molekül spielt Stickstoffmonoxid (NO) in der retrograden Signalübertragung zwischen Nervenzellen eine wichtige Rolle (O'Dell et al., 1991). NO wird kalziumabhängig postsynaptisch gebildet und diffundiert in die Präsynapse. Greene und Kollegen konnten zeigen, dass regulär feuernde Zellen selektiv das Enzym Stickstoffmonoxidsynthetase (NOS) exprimieren (Greene et al., 1997). Es ist somit denkbar, dass NO an der Expression der LTP in regulär feuernden Zellen beteiligt ist. Ein Kalziumeinstorm durch den NMDAR würde selektiv in den regulär feuernden Zellen die NOS aktivieren und die Bildung von NO anregen.

Zur Unterdrückung der NOS Aktivität wurden die Hirnschnitte mit dem NOS-Inhibitor Nω-Nitro-Arginine mindestens eine Stunde vor Beginn der Messungen inkubiert. Nach LTP Induktion konnte jedoch kein signifikanter Unterschied zu den Kontrollwerten gefunden werden. 15 Minuten nach Tetanus betrug die normalisierte EPSP Amplitude 148 ± 27 % (n = 5, Abbildung 24).

Abb. 23: Inhibition der NO-Synthetase nach Inkubation der Hirnschnitte mit Nω-Nitro-Arginine. Kein signifikanter Unterschied der LTP in regulär feuernden Zellen zu den Kontrollwerten.

4.2.10. cAMP-abhängige Expression der LTP in Bursterzellen

Die Ifenprodil – Experimente sprechen für die Beteiligung von präsynaptischen NR2B an der LTP in den Bursterzellen. Die Aktivierung der NR2B-Rezeptoren führt zu einem Kalziumeinstrom und der Aktivierung einer Signalkaskade, welche für die langanhaltende Erhöhung der Transmitterfreisetzung verantwortlich ist. An den hippokampalen Moosfasern, den kortikothalamischen Synapsen, sowie den Parallelfasern im Zerebellum spielt cAMP für die Expression der LTP eine wichtige [Seite 42↓]Rolle (Castro-Alamancos & Calcagnotto, 1999; Salin et al., 1996; Weisskopf et al., 1994). Während eines Tetanus gelangt Kalzium in die Präsynapse und bindet an Calmodulin, welches die Adenylylcyclase aktiviert, die wiederum aus Adenosintriphosphat (ATP) cAMP bildet.

Um die Beteiligung von cAMP in den beiden subikulären Zelltypen zu testen, wurde die membranpermeable Droge Forskolin verwendet. Forskolin aktiviert die Adenylylcyclase und erhöht so indirekt die cAMP-Konzentration in der Präsynapse, welche letztendlich in einer erhöhten Transmitterfreisetzung mündet.

Die Applikation von Forskolin (50 µM) führte in den Bursterzellen zu einem massiven Anstieg der EPSP Amplitude (215 ± 19 % nach 20 Minuten Applikationsdauer in der Gegenwart von 60 µM APV, n = 7, p = 0,0005, Abbildung 24 A, B). Zudem verringerte Forskolin den Doppelpulsindex von 1,48 ± 0,18 auf 0,88 ± 0,55 (p = 0,009, Abbildung 24 D) übereinstimmend mit einem präsynaptischen Wirkort von Forskolin. Im Anschluss wurde der alveäre Eingang tetanisch gereizt. Falls Forskolin und elektrische Reizung die synaptische Transmission über denselben Mechanismus langanhaltend verstärken, dürfte der Tetanus zu keiner weiteren Potenzierung der Antwort führen. In der Tat erhöhte sich die EPSP Amplitude nach hochfrequenter Reizung nicht signifikant gegenüber den Werten nach Applikation von Forskolin (242 ± 42% 15 Minuten nach dem Tetanus vs. 215 ± 19 % nach Forskolin Applikation, n = 7, p = 0.25).


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Abb. 24: cAMP-abhängige Expression der LTP in Bursterzellen. (A): Forskolin-induzierte Verstärkung der synaptischen Transmission. Nach 20 Minuten Applikationsdauer tetanische Reizung. Es konnte keine signifikante Potenzierung nach dem Tetanus nachgewiesen werden. (B,C): Der Doppelpulsindex zeigte eine hoch signifikante Änderung nach Badapplikation von Forskolin (n = 7). (C): Zusammenfassung der Experimente in Gegenwart von 60 µM APV.


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Um eine postsynaptische Aktivierung von NMDAR zu verhindern, wurden diese Experimente in Gegenwart von APV in einer Konzentration von 60 µM durchgeführt.

Um beschriebene unspezifische Effekte auf Kaliumkanäle auszuschließen (Hoshi et al., 1988), wurde das inaktive Forskolinanalogon 1,9-Dideoxyforskolin (50 µM) appliziert. Dies führte nicht zu einer Potenzierung der synaptischen Antworten (92 ± 13 %, n = 4, Abbildung 24 C).

4.2.11. Effekt von Forskolin in regulär feuernden Zellen

Im Gegensatz zu den Bursterzellen erhöhte sich die EPSP Amplitude in den regulär feuernden Zellen nach Forskolingabe lediglich moderat (146 ± 13 %, n = 6, p = 0,006, Abbildung 25). Es zeigte sich, dass der EPSP Anstieg signifikant geringer ausgeprägt war als in den Bursterzellen (p = 0,015, Abbildung 25 A). Übereinstimmend mit einem präsynaptischen Wirkort änderte sich der Doppelpulsindex signifikant von 1,3 ± 0,11 auf 0,84 ± 0,13 (n = 6, p = 0,028, Abbildung 25 B). Nach 20 minütiger Applikationsdauer wurde der alveäre Eingang tetanisch gereizt. Im Gegensatz zu den Bursterzellen konnte die synaptische Antwort in regulär feuernden Zellen um weitere 50 % elektrisch potenziert werden (199 ± 27 %, 10 Minuten nach Tetanus, n = 6, p = 0,056). Die Abbildung 25 zeigt ein typisches Beispiel.

Abb. 25: Effekte von Forskolin auf EPSP Amplitude in regulär feuernden Zellen. (A): Beispielzelle. (B): Zusammenfassung von n = 6 regulär feuernden Zellen.


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Zusammenfassend deuten die vorliegenden Daten darauf hin, dass präsynaptische Endigungen, die auf Bursterzellen projizieren, über einen erhöhten Gehalt an Adenylylcyclase verfügen als präsynaptische Endigungen, die synaptische Kontakte mit regulär feuernden Zellen eingehen. Der unterschiedliche Gehalt an Adenylylcyclase spiegelt sich in einer verschieden starken Ausprägung der Potenzierung nach Forskolinapplikation wider (Abbildung 26 A). Des weiteren kann in regulär feuernden Zellen die chemische Potenzierung elektrisch durch eine tetanische Reizung weiter potenziert werden. Die chemische und elektrische Potenzierung beruhen in regulär feuernden Zellen somit auf zwei verschiedenen Mechanismen.

Abb. 26: Zusammenfassung der normalisierten EPSP Amplituden nach Applikation von Forskolin. (A): zellspezifische Potenzierung. (B): Doppelpulsindex in regulär feuernden Zellen.

4.2.12. Rolle des H-Stromes in subikulärer LTP

Für die präsynaptisch induzierte LTP der Moosfasersynapse der Area CA3 konnte gezeigt werden, dass der Kationenkanal Ih an der Expression der Moosfaser-LTP beteiligt ist (Huang & Hsu, 2003; Mellor et al., 2002) aber siehe (Chevaleyre & Castillo, 2002). In Gegenwart des Ih-Blockers Cäsium (3 mM) konnte in Bursterzellen allerdings weiterhin eine LTP ausgelöst werden (n = 2; Abbildung 27 B). Als Kontrolle der Wirksamkeit der Droge zeigte sich nach Einwaschen eine Vergrößerung des Eingangswiderstandes (Abbildung 27 A).


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Abb. 27: Einfluss des Ih-Blockers Cs+ (3 mM) auf LTP in Bursterzellen. (A): Cäsium erhöhte den Eingangswiderstand (Pfeile). (B): LTP Protokoll in Gegenwart von Cs+ und APV (60 µM).

4.3. Untersuchungen zur Kurzzeitplastizität im Subikulum der Ratte

Im Folgenden wurde die Hypothese geprüft, ob sich im Subikulum der Ratte neben der zellspezifischen LTP auch Hinweise auf eine zellspezifische Kurzzeitplastizität finden.

Aus diesem Grunde wurde eine Versuchsreihe mit Doppelpulsexperimenten durchgeführt. Die Interstimulusintervalle (ISI) betrugen 20, 50 und 100 ms. In allen drei Gruppen fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Zelltypen. Nach Stimulation eines Doppelpulses mit 20 ms dauerndem ISI betrug der Doppelpulsindex in den regulär feuern Zellen 1,93 ± 0,20 (n = 7) und in den Bursterzellen 1,80 ± 0,26 (n = 9, p = 0,71, Abbildung 28 A), nach Stimulation eines Doppelpulses mit 50 ms dauerndem ISI in den regulär feuern Zellen 1,48 ± 0,14 (n = 7) und in den Bursterzellen 1,63 ± 0,15 (n = 9, p = 0,48, Abbildung 28 A) und schließlich nach Stimulation eines Doppelpulses mit 100 ms dauerndem ISI in den regulär feuern Zellen 1,33 ± 0,09 (n = 6) und in den Bursterzellen 1,29 ± 0,09 (n = 8, p = 0,73, Abbildung 28 A).


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Es ist bekannt, dass bei geringer Amplitude des ersten EPSP das darauffolgende EPSP in Übereinstimmung mit der „residualen Kalzium-Hypothese“ umso größer ist (Debanne et al., 1996; Zucker & Regehr, 2002). Aus diesem Grund wurde während der Experimente darauf geachtet, dass die Amplitude des ersten EPSPs zwischen beiden Zelltypen nicht signifikant unterschiedlich war.

Abb. 28: Kurzzeitplastizität im Subikulum. (A): Doppelpulsexperimente mit Interstimulusintervallen (ISI) von 20, 50 und 100 ms. Es fand sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen beiden Zelltypen. (B1-B3): Auftragung der Größe des ersten EPSP gegenüber dem Doppelpulsindex. In allen drei Gruppen fand sich ein negativ proportionaler Zusammenhang.


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Um den Zusammenhang zwischen der ersten EPSP Amplitude und dem Doppelpulsindex aufzuzeigen, wurden die beiden Größen grafisch gegeneinander aufgetragen (Abbildung 28 B1-B3). In allen drei Gruppen ergab sich in Übereinstimmung mit der „residualen Kalzium-Hypothese“ ein negativ exponentieller Zusammenhang.

Zusammenfassend zeigten die Doppelpulsexperimente somit keine zellspezifischen Unterschiede.

4.4. Charakterisierung des alveären Eingangs in das Subikulum in Pilokarpin-behandelten Tieren

Alveäre Stimulation erzeugte im Kontrollgewebe eine EPSP/IPSP Sequenz, bei erhöhter Stimulationsstärke Aktionspotentiale (APs) (Abbildung 29 A). Im Pilokarpin-behandelten Tier fand sich dagegen in einigen Zellen ein doppelgipfliges EPSP (Abbildung 29 B1, Pfeile). Bei erhöhter Stimulationsstärke feuerte die Zelle ein AP auf das zweite EPSP (n = 3 von 9 Zellen, 8 Tiere). In den Zellen, die lediglich ein EPSP auf einen Stimulus zeigten, konnte ein doppelgipfliges EPSP durch die Applikation des GABAA-Antagonisten Bicuculline erzeugt werden (n = 5).


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Abb. 29: Charakterisierung synaptisch evozierter Potentiale im Subikulum Pilokarpin-behandelter Tiere. (A): Alveäre Stimulation erzeugte im Kontrollgewebe ein EPSP, bei steigender Stimulationsstärke ein Burst von Aktionspotentialen. (B1): im Pilokarpin-behandelten Tier fand sich ein doppelgipfliges EPSP (Pfeile), bei erhöhter Stimulationsstärke feuerte die Zelle ein AP auf das zweite EPSP. (B2): In den Zellen, die lediglich ein EPSP auf einen Stimulus zeigten, konnte ein doppelgipfliges EPSP durch die Applikation des GABAA-Antagonisten Bicuculline erzeugt werden. Man beachte die unterschiedliche Zeitskala zwischen A und B1, B2.

Das zweite EPSP zeigte Eigenschaften eines polysynaptischen Signals (Miles & Wong, 1987a).

In Abbildung 30 ist eine Zelle dargestellt, die auf einen Stimulus nach einer Latenz von ungefähr 80 ms mit einem Aktionspotential antwortet ohne dass ein EPSP diesem voranging. Bei steigender Stimulationsstärke verkleinerte sich die Latenz zum AP und ein initiales EPSP kam zum Vorschein (Abbildung 30, Pfeil). Die Abnahme der Latenz synaptisch evozierter Potentiale bei steigernder Stimulationsintensität deuten auf ein polysynaptisches Signal hin.


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Abb. 30: Polysynaptische Signale nach Alveusstimulation im Pilokarpin-behandelten Tier. Bei niedriger Stimulationsstärke konnte kein EPSP aufgezeichnet werden (2V), bei Erhöhung antwortete die Zelle nach dem „Alles-oder-nichts“ Prinzip (4V). Bei erhöhter Stimulationsintensität zeigte sich ein initiales EPSP (6,10V). (B): Abnahme der Latenz synaptisch evozierter Potentiale bei steigender Stimulationsintensität deuten auf ein polysynaptisches Signal hin. Aufzeichnungen unter GABAA-Rezeptor Blockade.

4.5. Langzeitpotenzierung in Pilokarpin-behandelten Tieren

Analog zu den Untersuchungen im Kontrolltier wurden extra-, wie intrazelluläre Messungen zur synaptischen Langzeitplastizität in Pilokarpin-behandelten Tieren durchgeführt. Nach tetanischer Reizung zeigte sich, dass zwar eine posttetanische Potenzierung auslösbar war, die synaptische Übertragungsstärke aber nicht dauerhaft erhöht blieb.


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Abb. 31: Beispiel einer extrazellulären Ableitung im Pilokarpin-behandelten Tier. Populationspike erreichte zwanzig Minuten nach tetanischer Reizung wieder das Ausgangniveau. Aufzeichnungen in ACSF.

Sowohl in den extra-, als auch in den intrazellulären Ableitungen zeigte sich, dass 15 bis 20 Minuten nach dem Tetanus der Populationsspike, bzw. die EPSP-Amplitude wieder auf das Ausgangsniveau gefallen waren (Abbildung 31 – 33). Interessanterweise konnte in einigen Fällen nach tetanischer Potenzierung doppelgipflige EPSPs aufgezeichnet werden. Diese ähneln den in Kapitel 4.4 beschriebenen Potentialen Pilokarpin-behandelter Tiere auf einen Einzelreiz.

Abb. 32: Vergleich von Bursterzellen im Pilokarpin-behandelten Tier und Kontrolltieren. Abfall der EPSP-Amplitude im Pilokarpin-behandelten Tieren innerhalb von 20 Minuten. Im Kontrolltier zeigte sich hingegen eine stabile Potenzierung (Kapitel 4.2). Aufzeichnungen in Gegenwart des GABAA-Rezeptor Antagonisten BCM.


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Abb. 33: Beispiel einer regulär feuernden Zelle im Pilokarpin-behandelten Tier. Vor Induktion der LTP (fette Linie) zeigte sich kein offensichtlicher Unterschied im Vergleich zum Kontrolltier. Nach Potenzierung wurden Aktionspotentiale vor der 2.Stimulation aufgezeichnet. Inlay: EPSPs während tetanischer Reizung. Bereits nach wenigen Pulsen zeigten sich Aktionspotentiale. Aufzeichnungen unter GABAA-Rezeptor Blockade.

Nimmt man an, dass die doppelgipfligen Antworten polysynaptischer Natur sind, so scheint es, dass synaptisch latente Verbindungen nach tetanischer Reizung funktionell aktiv werden und ein Aktionspotential oder einen Burst von Aktionspotentialen induzieren (Abbildung 33). In einigen Hirnschnitten waren diese polysynaptischen Verbindungen bereits vor Tetanisierung aktiviert (Abbildung 29 B1), in anderen durch die Blockade der GABAA-vermittelten Transmission aktivierbar. Im Kontrolltier konnte die polysynaptische Exzitation durch eine pharmakologische Inhibition der GABAergen Transmission nicht induziert werden (Abbildung 29 A). Zukünftige Experimente werden in Kombination mit histologischen Methoden zeigen, ob rekurrente Verschaltungen diese polysynaptischen Signale erklären können. Inwiefern im hippokampalen Hirnschnitt Pilokarpin-behandelter Tiere bereits rekurrente, aktivierbare Verbindungen existieren, bleibt ebenfalls zu klären.


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4.6.  Charakterisierung humaner subikulärer Zellen

Während das Verhältnis Bursterzellen zu regulär feuernden Zellen im Kontrollgewebe der Ratte zwei zu eins beträgt (O'Mara et al., 2001), konnten wir mit Hilfe intrazellulärer Ableitungen an Operationsresektaten von Patienten mit pharmakoresistenter Temporallappenepilepsie (TLE) zeigen, dass sowohl im AHS wie auch im Non-AHS Gewebe (siehe Einleitung Kapitel 1.10) die Mehrzahl der Zellen als intrinsisch regulär feuernd beschrieben werden konnten. Im AHS Gewebe (Wyler Grad W0 – W2) waren 75% der Zellen regulär feuernde (n = 18) und 25% der Zellen Bursterzellen (n = 6). Im Non-AHS Gewebe betrug der Anteil der regulär feuernden Zellen 79% (n = 15). Der Anteil der Bursterzellen betrug 21% (n = 4, Abbildung 34).

Abb. 34: Charakterisierung humaner subikulärer Pyramidalzellen. (A): Bursterzellen und regulär feuernde Zellen. (B): Im AHS Gewebe betrug der Anteil regulär feuernder Zellen 75 %, (n = 18) und im Non-AHS Gewebe 79 % (n = 15). Pfeil: spontane interiktale Aktivität.

Eine Aufteilung der Zelltypen nach dem Grade der Wyler Klassifikation zeigte in allen vier Gruppen eine vergleichbare Verteilung zugunsten der regulär feuernden Zellen (Abbildung 35).


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Abb. 35: Anzahl der Zellen in Abhängigkeit vom Wylergrad.

Im AHS Gewebe hatten regulär feuernde Zellen ein Ruhemembranpotential von –68,4 ± 1,1 mV und einen Eingangswiderstand von 35,6 ± 3,4 MΩ (n = 18). Bursterzellen zeigten ein vergleichbares Ruhemembranpotential von –68,7 ± 2,6 mV (n = 6, p = 0,40) und einen vergleichbaren Eingangswiderstand von 29,6 ± 3,6 MΩ (n = 6, p = 0,41). Im Non-AHS Gewebe zeigten regulär feuernde Zellen ein Ruhemembranpotential von –69,3 ± 1,0 mV und einen Eingangswiderstand von 34,8 ± 3,3 MΩ (n = 15), Bursterzellen ein Ruhemembranpotential von –64,0 ± 3,6 mV (n = 4, p = 0,23) und einen Eingangswiderstand von 23,8 ± 4,2 MΩ (n = 4, p = 0,08). Zwischen regulär feuernden Zellen des AHS und Non-AHS Gewebe fand sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied des Ruhemembranpotentials und des Eingangswiderstandes.

4.7. Spontane epileptische Aktivität im humanen Subikulum

Interessanterweise konnte in 56 % der subikulären Zellen im AHS Gewebe (n = 10 von 18) und in 28 % der Zellen im Non-AHS Gewebe (n = 5 von 18) interiktale Aktivität aufgezeichnet werden. Die Aktivität bestand aus rhythmischen EPSP/IPSP Sequenzen im Bereich von 0,75 bis 3 Hz. Die in-vitro Daten korrelierten in ihrem Auftreten sehr gut mit den EEG-Ableitungen, die ebenfalls interiktale Aktivität zeigten (Abbildung 36). Aktionspotentiale konnte lediglich in einer Zelle beobachtet werden. Diese zeigte aber keine typischen Merkmale einer Schrittmacherzelle, da die Aktionspotentiale asynchron auftraten. Es zeigte sich keine Korrelation zur unterliegenden EPSP/IPSP Aktivität.


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Abb. 36: Spontane interiktale Aktivität im humanen Subikulum. Im AHS-Gewebe zeigten 56% der abgeleiteten Zellen sponaten interiktale Aktivität., im Non-AHS-Gewebe 28% der Zellen. Diese in vitro-Aktivität korrelierte sehr gut mit den EEG-Ableitungen (in vivo).
[Die EEG-Ableitungen, sowie deren Auswertung wurden von Herrn Dr. C. Dehnicke, EZBB, sowie Herrn Dr. T.-N. Lehmann, Charité, Neurochirurgie. durchgeführt].

Die inhibitorische, bzw. exzitatorische interiktale Aktivität konnte durch Applikation des GABAA-Rezeptor Antagonisten Bicuculline (5 µM), bzw. des AMPA/Kainat-Rezeptor Antagonisten NBQX (10 µM) blockiert werden (Abbildung 37). Der NMDA-Rezeptor Antagonist APV hatte keinen Einfluss auf die Amplitude und Frequenz der interiktalen Aktivität.

Abb. 37: Interiktale Aktivität wurde durch den AMPAR-Antagonist NBQX (A) sowie den GABAA-Rezeptor Antagonist Bicuculline geblockt (B).

Im nächsten Schritt wurde die Spannungsabhängigkeit der spontanen, interiktalen Aktivität untersucht. Bei Ruhemembranpotential zeigten sich inhibitorische Ereignisse, die bei hyperpolarisierenden Haltepotentialen depolarisierend und bei [Seite 56↓]depolarisierten Haltepotentialen verstärkt hyperpolarisierend waren. Im dargestellten Beispiel in Abbildung 38 wurden ein Gleichgewichtspotential von –76,3 mV ermittelt, welches dem GABAergen Gleichgewichtspotential sehr nahe ist.

Cohen und Kollegen beschrieben evozierte exzitatorische Potentiale in humanen subikulären Pyramidalzellen, die durch den GABAA-Rezeptor Antagonisten BCM blockierbar waren. Zudem zeigten diese synaptisch evozierten Signale eine Spannungsabhängigkeit, welche auf ein in depolarisierende Richtung verschobenes Gleichgewichtspotentials schließen ließ. Cohen und Kollegen konnten zudem Schrittmacherzellen nachweisen, welche elektrophysiologische Eigenschaften von Interneuronen aufweisen (Cohen et al., 2002). Wie oben beschrieben, fand sich in dieser Studie hingegen kein Hinweis auf depolarisierende GABAA-Rezeptor vermittelte Antworten.

Abb. 38: Spannungsabhängigkeit der spontanen, interiktalen Aktivität. (A): Beispiel bei Ruhemembranpotential von –69 mV. Depolarisierung auf –64mV verstärkte die hyperpolarisierenden Ereignisse. Hyperpolarisierung auf –79 mV zeigte depolarisierende Ereignisse. (B): Grafische Auftragung der gemessenen Ereignisse gegenüber dem Haltepotential. Es ergibt sich ein Umkehrpotential von –76,3 mV.

4.8. Nachhyperpolarisation humaner subikulärer Zellen

Wie in der Einleitung beschrieben, spielen Nachhyperpolarisationen in der Regulation neuronaler Erregbarkeit eine besondere Rolle (Einleitung Kapitel 1.9). Auf einen depolarisierenden Puls folgen eine schnelle und eine langsame Nachhyperpolarisation. Im Folgenden wurden verschiedene Pulsdauern depolarisierender Ströme gewählt und die Amplitude beider Formen der [Seite 57↓]Nachhyperpolarisation bestimmt. Es fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen AHS und Non-AHS Gewebe in den Pulsdauern 50, 500 und 1000 ms. Lediglich bei einer Pulsdauer von 20 ms zeigte sich eine signifikant vergrößerte schnelle Nachhyperpolarisation (fAHP) im Non-AHS Gewebe. Die folgende Tabelle 3 fasst alle Daten zusammen.

Tabelle 3: Intrinsische Eigenschaften humaner subikulärer Zellen in Abhängigkeit vom Wylergrad (*: p = 0.047). Abkürzungen: RMP: Ruhemembranpotentials, Inres: Eingangswiderstand, fAHP: schnelle Nachhyperpolarisation, sAHP: langsame Nachhyperpolarisation.

  

AHS

Regular firing cells

Non-AHS

Regular firing cells

RMP (mV)

 

- 68.4 ± 1.1 (n = 18)

- 69.3 ± 1.0 (n = 15)

Inres (M Ω )

 

35.6 ± 3.4 (n = 18)

34.8 ± 3.3 (n = 15)

fAHP (mV)

20 ms

2.0 ± 0.4 (n =12)

3.2 ± 0.5 (n = 9) *

 

50 ms

3.4 ± 0.7 (n = 6)

4.9 ± 0.7 (n = 7)

 

500 ms

4.3 ± 0.5 (n = 11)

4.9 ± 0.7 (n = 9)

 

1000 ms

5.4 ± 0.6 (n = 15)

5.3 ± 0.7 (n = 8)

sAHP (mV)

20 ms

0.2 ± 0.1 (n = 12)

0.8 ± 0.3 (n = 9)

 

50 ms

0.4 ± 0.2 (n = 6)

0.7 ± 0.3 (n = 7)

 

500 ms

0.9 ± 0.3 (n = 11)

1.7 ± 0.4 (n = 9)

 

1000 ms

1.8 ± 0.5 (n = 15)

1.9 ± 0.4 (n= 8)

Eine Unterscheidung in spontan aktive und nicht aktive Zellen, unabhängig von dem Wyler Grad, zeigte jedoch eine hochsignifikante Abnahme der schnellen und langsamen Nachhyperpolarisation bei 1000 ms Pulsdauer (Abbildung 39, Tabelle 4). Bei Pulsen von 20 bis 500 ms Dauer zeigten sich in spontan aktiven Zellen zwar tendenziell, aber nicht signifikant geringere Werte für die schnelle und langsame Nachhyperpolarisation.


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Abb. 39: Nachhyperpolarisation humaner subikulärer Zellen in Abhängigkeit vom spontanen Entladungsverhalten. Der Pfeil in der Abbildung zeigt spontane interiktale Aktivität.

Tabelle 4: Nachhyperpolarisation humaner subikulärer Zellen in Abhängigkeit vom spontanen Entladungsverhalten. Abkürzungen: fAHP: schnelle Nachhyperpolarisation, sAHP: langsame Nachhyperpolarisation.

  

Spontaneous activity

AHS and Non-AHS

No activity

AHS and Non-AHS

 

p=

fAHP (mV)

20 ms

2.4 ± 0.2 (n = 9)

2.7 ± 0.1 (n = 11)

0.64

 

50 ms

3.9 ± 0.4 (n = 5)

4.4 ± 0.2 (n = 8)

0.71

 

500 ms

3.9 ± 0.2 (n = 8)

4.9 ± 0.2 (n = 12)

0.22

 

1000 ms

3.9 ± 0.2 (n = 9)

6.3 ± 0.2 (n = 12)

0.0085

sAHP (mV)

20 ms

0.2 ± 0.1 (n = 9)

0.6 ± 0.1 (n = 4)

0.16

 

50 ms

0.2 ± 0.1 (n = 5)

0.8 ± 0.1 (n = 8)

0.12

 

500 ms

1.0 ± 0.1 (n = 8)

1.5 ± 0.1 (n = 12)

0.20

 

1000 ms

0.7 ± 0.1 (n = 9)

2.8 ± 0.1 (n = 12)

0.0018


Fußnoten und Endnoten

1 Die von Zalutsky und Nicoll (1990) verwendeten Konzentrationen von 25 µM D-APV oder 50 µM D,L-APV blockierten die LTP an kommissuralen Fasern der Area CA3.



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09.03.2005