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3.  MATERIAL UND METHODEN

3.1. Patientengut und Tumormaterial

In der vorliegenden Arbeit wurden 18 Patienten mit Aesthesioneuroblastomen untersucht. Darunter waren 10 Männer und 8 Frauen. Das mittlere Erkrankungsalter betrug bei Männern 55,2 Jahre und bei Frauen 44,5 Jahre. Siebzehn Patienten wurden im Zeitraum zwischen 1988 und 2001 in der HNO-Klinik und ein Patient in der Neurochirurgischen Klinik des Klinikums Fulda operiert. Bis auf eine Patientin wurden alle postoperativ bestrahlt, z.T. stereotaktisch. Zwei Patienten stellten sich mit einem Residualtumor nach auswärtiger primärer Operation (Fälle 2, 12) bzw. nach primär auswärts durchgeführter Radiatio (Fall 16) zur Operation in der HNO-Klinik vor. Bei einem weiteren Patienten wurde zunächst primär neurochirurgisch der intrazerebrale Tumoranteil reseziert und zweizeitig in der HNO-Klinik der Tumoranteil im Bereich der Nase bzw. Nasennebenhöhlen. Der postoperative Beobachtungszeitraum betrug längstens 163 Monate. Acht Patienten waren innerhalb dieser Zeit verstorben, davon 6 am Tumorleiden (in 4 Fällen durch Fernmetastasen, 2x durch Lokalrezidive). Ein Patient verstarb an postoperativen Komplikationen und ein weiterer an einem Astrozytom 7 Jahre nach Operation des Aesthesioneuroblastoms. Die klinischen Daten der Patienten sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Die histologische Diagnose wurde am HE-Schnitt sowie durch die Beurteilung immunhistochemischer Reaktionen auf Zytokeratin, S-100 Protein, Synaptophysin (Syn) und neuronspezifische Enolase (NSE) im Institut für Pathologie des Klinikums Fulda gestellt. Die Abbildungen 2A und B zeigen die entsprechenden histologischen Befunde. Darüber hinaus erfolgte ein Grading nach dem System von Hyams [1983]. Die Tumoren wurden entsprechend der Stadieneinteilung nach Kadish [1976] bzw. erweitert nach Morita et al. [1993] klassifiziert.

Von 12 Patienten lag in Paraffin eingebettetes Material vom Primärtumor, in 3 Fällen von Rezidiven und in 2 Fällen von mehreren Metastasen vor.


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Tabelle 1: Klinisch-pathologische Daten des untersuchten Tumorkollektivs

Nr.

Alter

Geschl.

Tumor

Stadium

n. Morita

Grading

n. Hyams

Operativer Zugang

Gesamtüberleben

(Monate)

Rez.- u. meta.-freies Überleben

Tod am

Tumor

1

38

m

PT

B

II

endonasal

29

29

 

2

54

w

R

B

III

endonasal

26

26

 

3

50

m

PT

C

IV

subfrontal

17

12

 

4

16

w

PT

C

I

MD, OS

82

82

 

5

22

w

PT

D

IV

LR, EO, ND

24

4

#

6

39

m

PT

B

-

MD

163

163

 

7

33

m

PT

C

II

LR

84

84

an Zweit-Ca

(Astrozytom)

8

43

w

PT

C

-

LR, OS

8

6

#

9

58

w

PT

C

III

LR, EO

13

2

#

10

59

m

PT

B

III

endonasal

25

25

 

11

58

m

PT

C

IV

endonasal n. intrakran. Tu-Res.

1

1

#

12

82

m

R

B

IV

endonasal

38

38

 

13

53

w

PT

A

-

endonasal

130

130

 

14

56

w

PT

B

II

endonasal

37

37

 

15

47

m

PT

C

-

LR

64

64

#

16

54

w

R

C

IV

LR, EO

3

1

#

17

72

m

PT

C

II

subfrontal

7

7

 

18

74

m

PT

C

II

intrakraniell

1

1

Komplikation

PT = Primärtumor, R = Residualtumor, LR = laterale Rhinotomie, EO = Exenteratio orbitae, OS = osteoplastische Stirnhöhlenoperation,
MD = Midfacial degloving, ND = Neck dissection; Intrakranielle Resektionen bezeichnen OP’s durch Neurochirurgen.
Von den Tumoren der Patienten 1-5, 7, 9-11 und 16-18 lag Paraffinmaterial vor, das molekularzytogenetisch untersucht werden konnte.


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Abbildung 2A: Hämatoxylin-Eosin-Färbung eines Aesthesioneuroblastoms; Lobuläre Anordnung gering differenzierter Neuroblasten (kleine, uniforme Zellen mit spärlichem eosinophilem Zytoplasma und runden bis ovalen hyperchromatischen Zellkernen mit reichlich Mitosen) ohne Neurofibrillen, separiert durch feines fibro-vaskuläres Stroma.

Abbildung 2B:Immunhistochemisches Muster eines Aesthesioneuroblastoms, positive Reaktion auf NSE, S-100 und Syn bei negativer Reaktion auf Zytokeratin.


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3.2.  Vergleichende Genomische Hybridisierung (CGH)

Die Vergleichende Genomische Hybridisierung (engl. "Comparative GenomicHybridization", CGH) ist eine 1992 erstmals beschriebene molekularzytogenetische Methode, die es erlaubt, in einem Experiment einen Überblick über die gesamten chromosomalen und subchromosomalen Veränderungen eines Tumorgenoms zu erlangen [Kallioniemi et al. 1992]. Die CGH beruht auf der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Es werden die zu untersuchende Tumor-DNA und daneben normale DNA eines gesunden Probanden extrahiert, mit unterschiedlichenFluoreszenzfarbstoffen markiert und dann zu gleichen Teilen auf normale Metaphasenchromosomen, die aus Blutlymphozyten eines ebenfalls gesunden Probanden gewonnen werden, hybridisiert. Tumor- und Normal-DNA konkurrieren dabei um homologe Bindungsstellen auf den Chromosomen. Überwiegt im Tumor eine DNA-Sequenz, so bindet diese häufiger an die entsprechende chromosomale DNA, hat der Tumor hingegen DNA verloren,so bindet mehr Normal-DNA. Die genetischen Aberrationen eines Tumorgenoms werden somit als DNA-Gewinn (Überrepräsentierung, Amplifikation) oder DNA-Verlust (Deletion) erkennbar. Dies hat biologische Bedeutung, da eine Amplifikation auf die Aktivierung eines Proto-Onkogens, eine Deletion hingegen auf die Inaktivierungeines TSG hinweisen können. Um diese DNA-Veränderungen quantifizieren zu können, erfolgt die Auswertung nicht visuell sondern nach Aufnahme mit einer CCD-Kamera über ein Computersystem mit einem Programm zur digitalen Bildanalyse der Fluoreszenzbilder.

Die CGH wurde in Anlehnung an die Protokolle von Kallioniemi et al. [1992, 1994a] sowie du Manoir et al. [1993] durchgeführt. Die Einzelheiten der Protokolle sind publiziert [Bockmühl et al. 1996b, Petersen et al. 1996, Roth et al. 1997] und über die Internetseite (http://amba.charite.de/cgh) abrufbar. Die CGH umfasst folgende Schritte: a) DNA-Extraktion, b) Metaphasen-Präparation, c) DNA-Markierung, d) Hybridisierung, e) DNA-Nachweis, f) digitale Bildverarbeitung und -auswertung.

DNA-Extraktion

Von dem in Paraffin eingebetteten Tumormaterial wurden jeweils ca. dreissig 5μm dicke Gewebeschnitte auf Objekträger aufgezogen. Der erste Schnitt wurde in Haematoxylin-Eosin gefärbt und mikroskopisch das Tumorareal markiert. Dieses wurde dann entsprechend von den anderen Schnitten mikrodissektiert und in 2ml Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach Entparaffinisierung mit Xylol erfolgte die DNA-Extraktion nach [Seite 16↓]Standardprotokoll [Wright & Manos 1990] bzw. auch nach dem Protokoll von Speicher et al. [1993]. Zuerst wurden die Proben zum Verdau in jeweils 900µl Digestionspuffer, bestehend aus 30mM Trispuffer (pH 8,5) + 1mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, ph 8,0) + 0,5% Tween20 + Proteinase K (1mg/ml) über Nacht bei 50°C inkubiert. Daran schlossen sich die DNA-Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und die Fällung in Ethanol nach Standardprotokoll an [Sambrook et al. 1989]. Die Pellets wurden dann in Aqua bidest gelöst und ihre Konzentration mit einem Photometer bei 280nm bestimmt.

Die Normal-DNA wurde durch Blutentnahme von gesunden Spendern gewonnen. Nach Abtrennung der Leukozyten erfolgte die DNA-Extraktion wie oben beschrieben.

Metaphasen-Präparation

Die Präparation der Metaphasen erfolgte aus Blutlymphozyten gesunder Probanden, die in einer Kurzzeitkultur durch Phythämagglutinin zur Proliferation angeregt wurden. Nach Arretierung in der Metaphase mittels Colcemid erfolgte die Aufreinigung der Lymphozytenkerne über mehrere Waschschritte und das Auftropfen der Kerne auf gereinigte Objektträger (Verma & Babu 1994). Kurz vor der eigentlichen Hybridisierung wurden die Objektträger mit den Metaphasenchromosomen in 70%igem Formamid/2xSSC (pH 7,5) bei 78°C für 60-90 Sekunden denaturiert und danach jeweils 3 Minuten in einer eiskalten aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert.

DNA-Markierung

Die Markierung der DNA erfolgte über eine Nick-Translation, wobei die Tumor-DNA mit Biotin-16-dUTP (Boehringer, Mannheim, FRG), die Normalgewebs-DNA mit Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer, Mannheim, FRG) nach Standardprotokoll (Sambrook et al. 1989) markiert wurden. Die Größe der entstandenen Fragmente wurde mittels eines 2%igen Agarosegels überprüft. Nach Erreichen der optimalen Länge von 300 bis 700 Basenpaaren wurde die Reaktion durch Zugabe von 2,5µl EDTA (pH 8,0) und 2,5µl SDS(20%) gestoppt. Die Markierungseffizienz wurde in regelmäßigen Abständen mit einem einfachen Dot Blot undanschließender Farbreaktion überprüft.

Hybridisierung

Die Fällung von jeweils 5µg markierter Tumor- und Normalgewebs-DNA, 20µg Cot1-DNA (Gibco BRL, Life Technologies, Paisly, UK) und 1µg Heringssperma-DNA erfolgte [Seite 17↓]in 3-fachem Volumen absolutem Ethanol und 0,3M Natriumacetat bei -80°C für ca. 30 Minuten. Nach Zentrifugation bei +4°C und 14 000rpm für 30 Minuten, Dekantieren des Überstandes und Trocknen des Pellets wurde dieses für 30 Minuten bei 37°C in 5µl deionisiertem Formamid gelöst. Danach wurden 10µl Mastermix (20% Dextransulfat/4xSSC) zugegeben und das Gemisch für 5 Minuten bei 77°C denaturiert. Anschließend erfolgte das "preannealing" (Hybridisierung repetitiver Sequenzen) bei 37°C für 1 bis 2 Stunden.

Zwölf µl einer Probe wurden jeweils auf einen der vorbereiteten Objektträger aufgetragen, durch ein 18 x 18mm Deckglas bedeckt und mit Fixogum luftdicht sowie blasenfrei abgeschlossen. Die Hybridisierung erfolgte bei konstant 37°C für 3 Tage [Kallioniemi et al. 1994a].

Die Tumor-DNA wurde überwiegend geschlechtsneutral hybridisiert, d.h. bei einem Tumor von einem männlichen Patienten wurde die DNA mit männlicher Referenz-DNA und männlichen Metaphasenchromosomen präpariert bzw. bei weiblicher Tumor-DNA mit XX-Normal-DNA und XX-Metaphasenchromosomen.

DNA-Nachweis

Die Detektion erfolgte durch eine Bindung von Fluorescein-Avidin (FITC) an die Biotin-markierte Tumor-DNA und Anti-Digoxigenin-Rhodamin (TRITC) an die mitDigoxigenin markierte Normalgewebs-DNA. Zur Identifizierung der Chromosomen wurden diese mit 4,6-Diamino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) gefärbt [Verma & Babu 1994].

Nach der Hybridisierung erfolgten zunächst 3 Waschschritte für jeweils 3 Minuten mit Formamid/2xSSC (1:1, pH 7,0) bei 37°C, anschließend wiederum dreimal jeweils 3 Minuten mit 0,1xSSC bei 60°C. Danach wurden die Präparate kurz in 4xSSC/0,2% Tween20 getaucht und dann mit 3% BSA in 4xSSC/0,2% Tween20 für 20 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert (Blocking-Schritt). Nach einem erneuten kurzen Waschschritt mit 4xSSC/0,2% Tween20 wurden pro Objektträger FITC (VectorLaboratories, Burlingame, CA) 1:200 und TRITC (Boehringer, Mannheim, FRG) 1:100 in 3% BSA in 4xSSC/0,2% Tween20 aufgetragen, mit einem Deckgläschen bedeckt und für 30 Minuten abgedunkelt in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Objektträger wiederum dreimal jeweils 3 Minuten in 4xSSC/0,2% Tween20 bei 45°C gewaschen bevor sie mit DAPI (0,2mg/ml, 1:5000) für 5 Minuten bei Raumtemperatur gegengefärbt wurden. Abschliessend wurden die Präparate mit Aqua dest. gespült und mit Antifading (DABCO) eingedeckt.

[Seite 18↓]Digitale Bildverarbeitung und -auswertung

Die Bildaquirierung wurde an einem Zeiss Axiophot Epifluoreszenzmikroskop (Plan NEOFLUAR Ölobjektiv x63, N.A. 1.25, Zeiss, Oberkochen, FRG) durchgeführt. Es wurden folgende Filter verwendet: DAPI - Zeiss Filter-Set 02 Ausführung G365, Beamsplitter FT 395, Emission LP 42; FITC - Zeiss Filter-Set 10, Ausführung BP 450-490, Beamsplitter FT 510, Emission BP 515-565; TRITC - Chroma Filter-Set plus Ausführung Zeiss-Filter-Set 15, Ausführung BP 546/12,Beamsplitter FT 565, Emission BP 570-650. Pro Fall wurden 10 bis 15 Metaphasen ausgewählt. Von jeder Metaphase wurden drei monochrome Bilder (entsprechend den Fluorochromen) aufgenommen. Die Bildaufnahme erfolgte über eine mit einem Mikroskop verbundene CCD-Kamera (Photometrics, Tucson, AZ). Die FITC-, TRITC- und DAPI-Fluoreszenzsignale wurden jeweils separat als 8-bit Graustufenbilder (256 Graustufen) digital kodiert und im TIFF-Format abgespeichert. Die digitale Bildauswertung erfolgte anhand einer CGH-Software, die auf der Grundlage des AMBA-Systems und des Karyotypisierungsmoduls KARYOTYP (IBSB GmbH, Berlin, FRG) entwickelt und auf einem Pentium PC unter Windows implementiert wurde (Roth et al., 1997). Die drei Fluoreszenzbilder einer Metaphase und der erste Schritt der Bildauswertung sind beispielhaft in Abbildung 3 veranschaulicht.

Aus der Übereinanderlagerung des FITC- und TRITC-Bildes, der Normierung der Fluoreszenzintensitäten und dem Vergleich der korrespondierenden Bildpunkte resultiert das sog. RATIO-Bild. Es gibt die DNA-Veränderungen anhand von Fehlfarben wieder. Ein DNA-Gewinn (Überrepräsentierung, Amplifikation) im Tumor gegenüber dem Normalgewebe ist grün und ein DNA-Verlust (Deletion) rot gefärbt, während ein Gleichgewicht beider Genome blau dargestellt ist.


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Abbildung 3:Erster Schritt der Bildverarbeitung.

Nach Identifizierung der Chromosomen anhand des DAPI-Bildes werden die Chromosomen jeder Metaphase in ein Karyogramm sortiert. Pro Fall werden dann die Karyogramme von mindestens 10 Metaphasen zu einem Summen-Karyogramm gemittelt. Dadurch können zufällige Fehler und Rauscheffekte minimiert werden. Neben den Chromosomen-Ideogrammen sind die DNA-Veränderungen als Profile angegeben. Die mittlere der drei Linien verdeutlicht das Gleichgewicht zwischen Tumor- und Normal-DNA, während die linke bzw. rechte Linie dem theoretischen Wert für eine Mono- bzw. Trisomie in 50% der Tumorzellen eines diploiden Tumors entsprechen. Die Sensitivität der Methode lässt die Detektion von Deletionen bis zu 10 Megabasen und Amplifikationen bis 2 Megabasen Größe zu. Diese Auswertungsschritte sind in der nachfolgenden Abbildung 4 wiedergegeben.


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Abbildung 4 :

Die chromosomalen Imbalanzen der Einzelfälle lassen sich auch in Form einer Strichdarstellung verdeutlichen (siehe Abbildung 5).

Die statistische Analyse von Tumorgruppen erfolgt durch die Berechnung bzw. Erstellung eines Histogramms. Dazu werden von jedem Einzelfall die Imbalancen in den RATIO-Profilen mit dem Student-t-Test auf 95%ige und/oder 99%ige Signifikanz geprüft. Das CGH-Histogramm der Tumorgruppe repräsentiert dann die Anzahl der Fälle, die an einer gegebenen chromosomalen Region eine signifikante Veränderung aufweisen, normiert über die Gesamtzahl der Fälle dieser Tumorgruppe. Daraus ergibt sich die Verteilung der Imbalanzen in Form einer Inzidenzkurve zu beiden Seiten der Chromosomenideogramme, wobei Ausschläge links Deletionen und rechts Amplifikationen entsprechen (Abbildung 6). [Seite 21↓]Die Inzidenz lässt sich dann anhand von Hilfslinien ablesen; der Maximalwert von 100% wird erreicht, wenn alle Tumoren an einer bestimmten chromosomalen Region die gleiche Alteration aufweisen.

Abbildung 5:Imbalancen eines Einzelfalls in Form einer Strichdarstellung (blaue Striche=99%, grüne Striche=95% Signifikanz im Student-t-Test, rote Striche=besonders deutliche Deletionen bzw. Amplifikationen mit RATIO-Werten von < 0,5 resp. > 1,5 ).

Abbildung 6:Histogramm einer Tumorgruppe (blaue Bereiche=99%, grün=95% signifikante Imbalancen).


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06.08.2004