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1  Einleitung

Neurodegenerative Erkrankungen sind erblich oder sporadisch auftretende Zustände, welche durch fortschreitende Fehlfunktion des Nervensystems gekennzeichnet sind. Diese Erkrankungen sind oft mit der Atrophie (Verkümmerung) der betroffenen zentralen und peripheren Nervensystemstrukturen verbunden [2]. Die am häufigsten vorkommende neurodegenerative Erkrankung ist Alzheimer (AD), von der 7% - 10% aller Menschen über 65 Jahre und ungefähr 40 % der über 80-Jährigen betroffen sind [3]. An Parkinson eine weitere, häufige Gehirnerkrankung leiden in den Vereinigten Staaten von Amerika ungefähr eine Million Menschen [4]. Neben diesen häufigen neurodegenerativen Erkrankungen gibt es seltene, meist auf einzelne Gendefekte zurückzuführende Leiden. Die Ursache einiger dieser Erkrankungen ist die Verlängerung eines instabilen, Trinukleotids, welches sowohl in der kodierenden (Exon), als auch in der nichtkodierenden Sequenz (Intron) liegen kann. Beispiele für das Vorkommen in einem Intron sind das Fragile X Syndrom und die Myotonische Dystrophie [5]. Beim Vorkommen des Trinukleotids in einem Exon, kodiert dieses bei einigen Erkrankungen für die Aminosäure Glutamin [5, 6]. Ein Beispiel für so eine Erkrankung ist Huntington’s Chorea (HD).

1.1 Neurodegenerative Erkrankungen hervorgerufen durch verlängerte Poly-Glutamin-Wiederholungen

Die Zahl der neurodegenerativen Erkrankungen, die auf die Verlängerung einer instabilen Poly-Glutamin-Wiederholung (poly-glutamine-repeat; PGW) zurückgeführt werden kann, wächst ständig. Bisher sind mindestens acht unterschiedliche, sogenannte Polyglutaminerkrankungen bekannt geworden. Diese reichen von der Spinobulbaren Muskulären Atrophie über die Spinozerebralen Ataxien (SCA) bis hin zu HD [6]. HD tritt in einem von 10,000 Menschen auf [7]. An Huntington’s Chorea leiden ungefähr 30.000 Amerikaner [1] und sie ist somit eine der häufigsten, monogenetisch verursachten, neurodegenerativen Erkrankungen.

1.2 Die Erkrankung HD

Die neurodegenerative Erkrankung HD ist eine autosomal dominant vererbte Krankheit, die gewöhnlich im mittleren Lebensabschnitt beginnt und nach ungefähr 15 bis 20 Jahren [Seite 17↓]unausweichlich zum Tode führt [7, 8]. Die krankheitsverursachende Mutation besteht aus einer instabilen, verlängerten CAG-Trinukleotid Wiederholung 5´ im ersten Exon des HD Gens, IT15, welche für eine Kette von Polyglutaminen kodiert [9]. Die Anzahl der Glutaminwiederholungen im Genprodukt Huntingtin (Htt) [9] ist einer der entscheidenden Faktoren, die den Zeitpunkt des Ausbruchs der Erkrankung bestimmen. Menschen mit 6 – 25 Glutaminen sind nicht betroffen. Sobald zumindest eines der Allele des Gens die Schwelle von 36 Wiederholungen überschreitet kommt es zum Ausbruch der Erkrankung [10, 11]. Je größer die Zahl der PGW desto früher im Leben bricht die Krankheit aus [8]. Ein wichtiges Kennzeichen von HD ist der Untergang von vorwiegend mittelgroßen, dornigen Neuronen im Striatum des Gehirns [12]. Htt ist ein im Gehirn in weitem Umfang exprimiertes Protein. Es wurde mit Vesikeltransport [13], dem Endosomal-Lysosomalen Stoffwechselweg [14] und mit der Regulation der Produktion eines aus dem Neokortex abgeleiteten Faktors, „brain-derived neurotrophic factor“, BDNF in Verbindung gebracht [15]. BDNF ist ein für das Überleben von Neuronen des Striatums, welche bei HD sterben, wichtiger Faktor. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass Htt mit expandierten Polyglutaminwiederholungen (EPW) die Histonazetylierung hemmt und zwar entweder durch das blockieren von Histonazetylasen oder durch deren „Einbinden“ in Aggregate [16, 17]. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass Histon-Deazylase-Hemmer die Toxizität von EPW vermindern können [18]. Die Regulation der Aggregation von Htt-Fragmenten mit EPW könnte durch das Protein Arfaptin 2 erfolgen [19]. Eine weitere potentielle Funktion von Htt könnte in der Verhinderung des Zelltodes durch die Interaktion mit dem Protein Hip-1 bestehen. Eine Verlängerung der PGW führt zu einer Verminderung der Bindungsfähigkeit an dieses Protein. Hip-1 interagiert daraufhin mit Hippi was zu einer Rekrutierung von Kaspase 8 führen könnte. Mit Hilfe des extrinsischen, rezeptorvermittelten Zelltodpfad, an dem Kaspase 8 beteiligt ist, könnte so Apoptose ausgelöst werden [20]. Apoptose ist ein Prozess, bei dem eine vorher festgelegte Abfolge von biochemischen und morphologischen Veränderungen es der Zelle erlaubt, zu sterben, ohne dass sie ihre Nachbarn beeinträchtigt [21]. Diese Literaturdaten zeigen, dass es bereits viele Anhaltspunkte für eine mögliche Funktion von Huntingtin „in vivo“ gibt, jedoch eine eindeutige Klärung immer noch nicht vorliegt, da fast alle Experimente „in vitro“ durchgeführt wurden und deshalb nur Möglichkeiten für die Funktion „in vivo“ darstellen können.


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1.3  Ursache der Neurodegeneration bei HD

An dieser Stelle ist es wichtig festzustellen, dass die ursprünglichen genetischen und umweltbedingten Signale, die den Untergang von Neuronen auslösen, sich bei den verschiedenen physiologischen und pathologischen Zuständen von unterschiedlichen (neurodegenerativen) Erkrankungen unterscheiden mögen, dass aber gemeinsame Mediatoren, Aggregatbildung [6] und toxische Fragmentbildung (AD und HD) [21], existieren. Diese Aggregate finden sich sowohl im Zellkern, als auch im Zytoplasma [22]. Die sich an die Aggregat- und/oder Fragmentbildung anschließenden, biochemischen Abläufe, die während der Neurodegeneration ablaufen, sind apoptoseähnlich und könnten hoch konserviert sein [21]. Die Ursache des Sterbens der Neuronen im Gehirn sowie die Art des Zelltodes bei HD konnte noch nicht genau bestimmt werden [23]. Um eine Vorstellung über den Prozess der Neurodegeneration zu erhalten wird dieser im folgenden anhand seiner Gemeinsamkeiten mit Apoptose im Mausmodell und am Menschen beschrieben. Die bisherigen Daten über den Mechanismus wie Neuronen bei HD sterben sprechen dafür, dass ähnliche Prozesse wie bei Apoptose wichtig sind. Beim Zelltod durch Apoptose spielt die Aktivierung von Kaspasen eine wichtige Rolle. Dies sind Cystein-abhängige Proteasen, die auf der C-terminalen Seite die Peptidbindung bei der Aminosäure Aspartat schneiden [24]. Toxische Fragmente, die möglicherweise von Kaspasen generiert werden, spielen neben HD auch bei Alzheimer eine Rolle und lösen in „in vitro“-Modellen der Erkrankungen Apoptose aus [21]. In der Literatur existieren zwei Haupthypothesen für das Signal das zum Untergang von Neuronen bei HD führt. Nach der ersten Theorie, der „toxischen Peptid“ Hypothese, entstehen nach Kaspasespaltung kleine, N-terminale Fragmente von mutiertem Htt, die eine erhöhte Anzahl an PGW besitzen. Diese Fragmente akkumulieren selektiv im Gehirn von an HD Erkrankten und verursachen aufgrund eines noch nicht genau aufgeklärten Mechanismuses Neurodegeneration [25, 26]. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass Htt mit EPW resistenter gegenüber Proteolyse ist, da sich die Löslichkeitseigenschaften durch die Mutation verändert haben und das Protein nun schwerer löslich ist. Dies erlaubt es dem Protein zu akkumulieren und Proteine aus wichtigen Stoffwechselpfaden und auch Htt mit normaler Anzahl von PGW an sich zu binden und so Neuronen zu schädigen [27].


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1.3.1  Zelltod bei Neuronen durch toxische Peptidfragmente

Für die „toxische Peptid“ Hypothese spricht, dass Peptide bei Postmortem-Gehirnen von HD Patienten und Kontrollen gefunden wurden, die durch eine Spaltung von Htt durch Kaspase 3 entstanden sein könnten [28]. Zuvor wurden bereits potentielle Schnittstellen in Htt für die Kaspasen 3 und 6 nahe dem N-Terminus identifiziert [29, 30]. Es konnte gezeigt werden, dass N-terminale Fragmente im Gehirn von Menschen [31, 32] und Mäusen [33, 34] aggregieren und hierbei durch gehirnregionsspezifische Proteolyse gezielt zytotoxisch wirken könnten [35]. Ein Anhaltspunkt hierfür ist, dass N-terminale Htt Fragmente mit EPW „in vitro“ Apoptose auslösen können [36]. Die „toxische Peptid“ Hypothese mit der Involvierung von Kaspasen wird außerdem von der Beobachtung gestützt, dass sich Kaspase-Inhibitoren positiv auf das Überleben von Zellen bei HD auswirken [29, 36, 37, 38]. Charakteristisch für Apoptose ist neben der Kaspase-Aktivierung oxidativer Stress, gestörte Kalzium Homöostase (Gleichgewicht) und die Fehlfunktion der Mitochondrien [24]. Es gibt Hinweise dafür, dass auch diese Prozesse bei HD eine Rolle spielen.

1.3.1.1 Toxische Peptidfragmente sind nur eines von vielen Signalen die Apoptose in der Zelle auslösen können

Signale, welche Apoptosis in Neuronen auslösen sind vielfältig. Beispiele dafür sind der Mangel an neurotrophen Faktoren [39] oder der anregende Neurotransmitter Glutamat, welcher vermittelt durch die ionotrophen Glutamatrezeptoren des Typs AMPA (α-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazol Propionat) und NMDA (N-Methyl-D-Aspartat), Apoptose auslöst. Bei einem Mausmodell für HD (R6/2) ist die Expression von AMPA während der Erkrankung vermindert [40], was möglicherweise auf eine Herunterregulierung nach übermäßiger Aktivierung des AMPA-Rezeptors zurückzuführen ist. Bei Apoptose spielt Kalziuminflux in die Zelle eine wichtige Rolle. Ein wichtiger Auslöser für neuronalen Zelltod ist auch verstärkter, oxidativer Stress, hervorgerufen durch freie Radikale, wie zum Beispiel dem Superoxid-Anion und dem Hydroxyl Radikal. Bei R6/1 Mäusen, einem weiteren Mausmodell für HD [41] erfolgt eine oxidative Schädigung des Striatums parallel zum neurologischen Phänotyp [42]. Radikale beschädigen zelluläre Lipide [42], Proteine und Nukleinsäuren, indem sie die chemischen Bindungen dieser Moleküle angreifen.


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1.3.1.2  Verlauf der Apoptose in der Zelle

Es gibt zwei bekannte Signalübertragungswege beim Zelltod durch Apoptose. Beide Wege teilen gemeinsame Eigenschaften, wie z. B. molekulare Werkzeuge, welche Kaspasen durch Pro-Enzymrekrutierung, Oligomerisierung und nähe-induzierter Autokatalyse aktivieren. Darüber hinaus sind die Abläufe jedoch relativ verschieden. Der „intrinsische“ Pfad wirkt über das Mitochondrion als generellem Schadenssensor und ein wichtiges Kennzeichen ist die Ausbildung eines Komplexes, dem „Apoptosome“, mit Prokaspase 9, Cytochrom c und dem „Apoptotic Protease Activation Factor-1“, Apaf-1. Der „extrinsische“ Pfad überträgt Signale von extrazellulären Todesliganden, die zur Tumornekrosefaktor-Superfamilie gehören (z.B. CD95L). Diese binden an einen vorgeformten Rezeptorkomplex, welcher Kaspase 8, die auch bei HD eine Rolle spielen könnte [20], aktiviert. Bei einigen Zelltypen ist dieser Pfad unabhängig davon, ob mitochondriale Veränderungen stattfinden. Andere Zellen benötigen eine Wechselwirkung mit dem intrinsischen Pfad [43]. Beide Pfade konvergieren nun und aktivieren die Effektorkaspasen 3 und 7 [43]. Effektorkaspase 3 wird im Krankheitsverlauf auch beim HD Mausmodell R6/2 aktiviert [44]. Beim „intrinsischen“ Pfad wird während der Startphase nach Aktivierung des „Todessignals“ eine intrazelluläre Kaskade gestartet. Zu den bei der Kaskade ablaufenden Vorgängen gehören die Zunahme der Konzentration von Oxyradikalen und von Kalzium, die Produktion von Par-4 (prostate apoptosis response-4) und die Translokation von pro-apoptotisch wirkenden Mitgliedern der Bcl-2 Familie (Bax (Bcl-2-associated X-protein) und Bad (Bcl-associated death promotor)) an die mitochondriale Membran. Die Effektorphase beinhaltet einen Anstieg der mitochondrialen Kalzium- und der Oxyradikalen-Konzentration, die Bildung von „Permeability Transition Pores“ (PTP) in der mitochondrialen Membran und eine Freisetzung von Cytochrom c in das Zytosol [45, 46]. Cytochrom c bildet nun einen Komplex mit Apaf-1 und Kaspase 9. Aktivierte Kaspase 9 wiederum aktiviert Kaspase 3 und startet so die Abbauphase der Apoptose. Bei dieser werden strukturelle Komponenten mit Schlüsselfunktionen in der Zelle, wie z. B. beim Zytoskelett, Kernproteine und zahlreiche Proteine aus Signalkaskaden [24], sowie auch möglicherweise Htt [29, 30] zerschnitten, was zu charakteristischen Veränderungen in der Plasmamembran führt. Die Zellen schlagen Bläschen und präsentieren Phosphatidylserine auf der Zelloberfläche, was ein Signal für die Stimulation von Zellphagozytose durch Makrophagen und Mikroglia ist. Abschließend kondensiert und fragmentiert das nukleäre Chromatin [21]. Es gibt bereits Anhaltspunkte [Seite 21↓]für DNA-Fragmentierung bei HD [47, 48], die jedoch nicht immer bestätigt werden konnte [23]. Wichtige Kennzeichen für Apoptose, wie apoptotische Körperchen und Bläschenbildung, konnten im Kern und/oder Zytoplasma jedoch bisher nicht beobachtet werden, was genauso wie die Tatsache, dass die Organellen ihre ultrastrukturelle Integrität behalten, gegen einen rein apoptotischen Zelltod spricht [23]. Apoptotischer Zelltod findet außerdem in einem Zeitraum von Stunden bis Tagen statt. Neurodegenerative Erkrankungen entwickeln sich in einem Zeitraum von mehreren Jahren [23]. Diesen Kaskaden des Todes wirken Überlebenssignale entgegen, die Oxyradikale unterdrücken, die Kalzium Homöostase und die Funktion der Mitochondrien stabilisieren [21].

1.3.1.3 Mechanismen, die das Überleben der Zelle sichern

Ein großer Teil der strukturellen und funktionellen Komplexität des Nervensystems konnte entstehen, weil Neuronen sich nicht teilen. Die lange Lebensdauer der Neuronen erlaubt es dem Nervensystem, die kontinuierliche Funktion des Gehirns über lange Zeiträume zu gewährleisten und ein anhaltendes Gedächtnis zu kodieren. Aus diesem Grund wurde auf das Nervensystem während der Evolution ein beträchtlicher Druck ausgeübt, Mechanismen zu entwickeln, die vor Zelltod schützen. Die merklichen Symptome von neurodegenerativen Erkrankungen unterstreichen die Wichtigkeit von Mechanismen, welche die neuronale Plastizität und das Überleben der Neuronen gewährleisten. Neurotrophe Faktoren können Neuronen vor Apoptose schützen, indem sie Rezeptoren aktivieren, die über Kinasekaskaden die Produktion von Proteinen fördern, die das Überleben der Neuronen sichern [39]. Viele neurotrophe Faktoren wirken über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB [49]. Das Protein Htt sorgt für die vermehrte Produktion von BNDF, einem Neurotrophin, das sich positiv auf das Überleben von Neuronen auswirkt. Bei HD verliert Htt aufgrund der EPW diese Eigenschaft, was zu einem Mangel an BDNF bei den Neuronen und möglicherweise zu Neurodegeneration führt [15].

1.3.2 Neurodegeneration als Folge von verstärktem Widerstand von mutiertem Htt gegenüber Proteolyse

Neben der „toxischen Peptid“ Hypothese, existiert eine weiteres Modell für die Neurodegeneration bei HD, bei welchem man davon ausgeht, dass mutiertes Htt resistenter gegenüber Proteolyse ist. Es wird deswegen nicht von Proteasen abgebaut und kann [Seite 22↓]aggregieren [27]. Beide Prozesse generieren auf unterschiedliche Weise ein Signal oder Signale, welche(s) letztendlich Neurodegeneration hervorruft(en). Für den weiteren Verlauf des Untergangs der Neuronen gilt der ab 1.3.1.1 beschriebene Mechanismus. Eine Reihe von Studien konnte zeigen, dass Aggregate bestehend aus trunkiertem Htt mit EPW nicht zwangsläufig zytotoxisch sondern vielleicht sogar schützend wirken [36, 37, 50, 51, 52]. Studien, welche die Involvierung von toxischen N-terminalen Fragmenten postulierten, konnten nicht direkt nachweisen, dass das toxische Fragment tatsächlich von Htt mit EPW stammt [31, 35]. Eine bisher unbestätigte Studie zeigt, dass Htt mit EPW widerstandsfähiger gegenüber Proteolyse ist und dass N-terminale Spaltprodukte von Htt, welche in Inklusionen bei humanem postmortem Gehirnen gefunden wurden, nicht von Htt mit EPW stammten. Der Grad der Prozessierung von Htt war in von HD betroffenen und nicht betroffenen Gehirnregionen gleich [27]. Die unter 1.3.1 beschriebene positive Wirkung von Kaspase-Inhibitoren auf das Überleben von Zellen könnte auch dadurch zustande gekommen sein, dass diese eine allgemeinere, nicht HD-spezifische Art des Zelltodes mindern. Dies stimmt auch mit der Beobachtung überein, dass Kaspase-Inhibitoren den Zelltod zwar verzögern, aber nicht aufhalten können [37, 53]. Wenn toxische Peptide tatsächlich alleine die Ursache für den Zelltod bei HD wären, würde die Blockierung der Kaspasen den Beginn der Erkrankung verhindern [27]. Es gibt jedoch einige kritisch zu hinterfragende Punkte bei dieser Studie [27]. Die „verminderten Proteolyse“ wird bei der obigen Studie durch die Untersuchung von postmortem Gehirnen von HD Patienten mit PGW im Bereich von 40 bis 44 untersucht [27]. Die am besten untersuchten Gehirne besitzen 40 PGW und sind aufgrund der Schweregradbewertung, die von Vonsattel [54] eingeführt wurde, Grad 1 Gehirne. Grad 0 bezeichnet hierbei Gesunde und Grad 4, Gehirne im Endstadium der Erkrankung mit sehr starker Atrophie der von HD betroffenen Gehirnregionen, besonders dem Striatum. Mehrere Antikörper wurden für die Detektion von Htt verwendet, für das C-terminale, das N-terminale Ende und das Mittelstück von Htt. Ein Antikörper der speziell EPW erkennt fand ebenfalls Verwendung [55]. Dieser Antikörper detektiert spezifisch EPW ab einer Länge von 40. Die Sensitivität der Detektion ist jedoch sehr stark von der Anzahl der Wiederholungen abhängig. Der Unterschied der Sensitivität von 40 zu 80 Wiederholungen kann bis zu 80-fach betragen, ist jedoch mindestens 20-fach [55]. Die in der Studie zum Nachweis der „verminderten Proteolyse“ verwendete Probenmenge von 20 bis 35 µg Gehirnextrakt [27], bei welchem nicht alle Zellen Htt mit EPW in gleichem Maße exprimieren, ist viel geringer als die 50 [Seite 23↓]µg Extrakt aus lymphoblastoiden Zelllinien mit homogener Expression von EPW, die bei der Studie für die Charakterisierung des Antikörpers verwendet wurden und bei der EPW mit 40 Wiederholungen gerade noch nachweisbar waren [55]. Eine Beteiligung von N-terminalen Fragmenten von Htt mit EPW in den Aggregaten war durch diese Studie nicht auszuschließen. Es wird deutlich, dass eine genaue Bewertung des experimentellen Ansatzes und der verwendeten Werkzeuge zur Untersuchung des Pathomechanismuses bei HD sehr wichtig ist und wichtige Werkzeuge, wie z.B. Antikörper die PGW im Bereich ab 40, nicht jedoch unter 36, spezifisch mit gleichbleibender, hoher Sensitivität erkennen, immer noch fehlen.

1.3.3 Bewertung der „toxischen Peptid“ und der „verminderte Proteolyse“ Hypothese

Beide Hypothesen vermögen es, viele der bisher gemachten Beobachtungen bei der Pathologie von HD zu erklären. Beide erklären das Auftreten von Aggregaten, welche N-terminale Fragmente von Htt enthalten. Im Fall der „toxischen Peptid“ Hypothese ist die Akkumulation und möglicherweise auch Aggregation von N-terminalen Fragmenten von Htt mit EPW die Ursache für die Erkrankung. Bei der „verminderten Proteolyse“-Hypothese stammen die Fragmente von Htt ohne EPW. Die Fragmente mit EPW spielen bei der Entstehung der Pathologie keine besondere Rolle. Sie entstehen nur aufgrund der allgemeinen Prozessierung von Htt durch Kaspasen. Die Beteiligung von Kaspasen bei der Pathologie von HD hat auch einen unterschiedlichen Stellenwert. Bei der „toxischen Peptid“ Hypothese ist die Prozessierung von Htt durch Kaspasen die Ursache für die Entstehung der toxischen Fragmente, wohingegen bei der „verminderten Proteolyse“ Kaspasen nur nach der Akkumulation von Aggregaten und dem Wegfangen von verschiedenen im Stoffwechsel wichtigen Proteine durch die Aggregate, eine Rolle als „ausführende Instanz“ der Zelltodmaschinerie spielen. Obwohl beide Hypothesen die bisherigen Beobachtungen erklären können, bleibt die „toxische Peptid“ Hypothese, aufgrund der offenen Fragen bei der „verminderten Proteolyse“-Hypothese, weiterhin die am besten gestützte Theorie für die Pathologie von HD. Mausmodelle, welche ein Fragment von Htt mit EPW exprimieren sind somit ein gutes Modell für die Erkrankung [34, 41]. Nicht zuletzt die Untersuchung dieser Mausmodelle wird Aufschlüsse darüber geben, welche Prozesse beim Untergang von Neuronen in neurodegenerativen Erkrankungen wie HD im Einzelnen ablaufen, warum dieser Prozess so lange dauert und [Seite 24↓]wie stark dieser Prozess der Apoptose wirklich ähnelt. Tab. 1 fasst noch einmal die wichtigsten Bereiche der Erkrankung HD zusammen.

Tab. 1: Pathologie bei HD – Basis, Phänotyp, Pathologie und molekulare Grundlagen

Huntington Chorea

Bereich[a]

Beschreibung

  

Ursache

  • Vergrößerte Anzahl an CAG-Wiederholungen im ersten Exon des IT15 Gens
  • Expression des Genprodukts Huntingtin (Htt) mit erhöhter Anzahl der Aminosäure Glutamin
  • Funktion von Htt im Körper wird kontrovers diskutiert ist aber noch nicht genau geklärt

  

Funktion Htt im Organis-mus

  • Vesikeltransport[b]
  • Endosomaler-lysosomaler Stoffwechselweg
  • Regulation BDNF
  • Hemmung Histonazetylierung
  • Verhinderung von Zelltod durch Interaktion mit Hip-1

  

Klinischer Verlauf

  • Progression der Erkrankung meist innerhalb von 10 – 15 Jahren immer mit tödlichem Verlauf
  • Auftreten von Chorea[c], Rigidität (Steifheit), Demenz (geistiger Verfall) häufig verbunden mit Zuckungen;
  • Je größer die Anzahl der CAG Wiederholungen, desto früher bricht die Erkrankung aus und desto schwerer ist der Verlauf

  

Pathologie

  • Atrophie des Striatums; vor allem der Nukleus Kaudatum und das Putamen sind betroffen
  • Verlust von mittelgroßen, dornenförmigen Neuronen; Astrozytose [54]

  

Biochemie

  • Bildung von intranukleären Inklusionen und neuropilen Aggregaten die im Mausmodell im Krankheitsverlauf zunehmen
  • Aggregate beinhalten Proteine, welche für viele Stoffwechselwege wichtig sind

  

Neurodegeneration

  • Apoptose-ähnlicher Zelltod
  • Signal, welches zum Zelltod führt ist noch ungeklärt

[a]Eine genaue Erklärung der einzelnen Unterpunkte erfolgt im Text (1.1 bis 1.3.3). [b] Eine genaue Diskussion der Erkenntnisse erfolgt in 1.2.1. [c]Chorea: regellose, asymmetrische, plötzlich einschießende, kurzdauernde, distal betonte, unwillkürliche Bewegungen der Extremitäten; im Gesicht treten Grimassen und Schmatzen auf [56];


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1.4  Mausmodelle für die Erkrankung Huntington’s Chorea

1.4.1 Mausmodelle für HD mit „Knock in“ von „Full length“ IT15 mit expandiertem CAG

Es gibt unterschiedliche Mausmodelle für HD basierend auf zwei verschiedenen Ansätzen für deren Herstellung. Ein Ansatz besteht in der Inkorporation des gesamten IT15 Gens für Htt mit einer krankheitsverursachenden Anzahl von Glutaminen. Bei einem dieser Modelle mit erhöhter Anzahl von CAG Wiederholungen (eine Mauslinie mit 48 und eine mit 89) im Gen IT15 und somit der Aminosäure Glutamin im translatierten Protein, zeigen die Mäuse fortschreitende Verhaltensstörungen und Fehlfunktionen der Motorik mit einem Verlust an Neuronen und Gliose im Striatum, zerebralen Kortex, Thalamus und Hippocampus. Ein Merkmal dieses Modells ist das relativ späte Auftreten von Symptomen im Alter von ungefähr 24 Wochen. Außerdem war die Penetranz der Neuronen mit Inklusionen, einer wichtigen pathophysiologischen Eigenschaft von HD gering (~1%) [57]. In einem weiteren Modell mit gleichem Prinzip für HD wurde eine Polyglutaminsequenz von 92 bzw. 111 Aminosäuren an Stelle der 7 Aminosäuren bei der Maus als „knock in“ eingefügt. Im Verlauf der Erkrankung verändert sich die Lokalisation von „full-length“ Htt mit einer erhöhten Anzahl an Glutaminwiederholungen von zytoplasmatisch zu nukleär, bevor, in einem späteren Stadium der Erkrankung, Aggregate mit N-terminalen Fragmenten auftreten [58]. Auch bei diesem Mausmodell treten sichtbare Veränderungen, wie leichte motorische Störungen oder Neurodegeneration erst sehr spät auf und eine deutliche Ausprägung ist erst im Alter von zwei Jahren sichtbar [59]. Bei diesem Modell wird der Krankheitsprozess durch Koexpression von „knock in“ Transgen und kurzen Htt-Fragmenten mit EPW (82 Wiederholungen) beschleunigt. Im Alter von zwei Jahren treten Gliose und Neurodegeneration im Striatum dieser transgenen Mäusen auf. Die Translokation von Htt in den Nukleus der transgenen Mäusen wird durch das N-terminale Fragment ebenfalls beschleunigt.

1.4.2 Mausmodelle generiert durch verkürzte Fragmente von IT15 mit expandierten CAG Wiederholungen

Ein anderer experimenteller Ansatz basiert auf der Inkorporation eines verkürzten [Seite 26↓]Fragments des IT15 Gens. Bei einem dieser Mausmodelle führt die Translation dieses Htt-Fragments mit EPW zu einem Protein mit 82 Glutaminen und 171 Aminosäuren. Die Expression erfolgte über einen murinen Prionprotein-Promotor. Die Mäuse zeigen Verhaltensauffälligkeiten wie Verlust der Koordinationsfähigkeit, Zittern, Hypokinese und abnormalem Gang, bevor sie vorzeitig im Alter von 16 bis 52 Wochen, je nach erzeugter Mauslinie, versterben. Außerdem weisen die Mäuse im Krankheitsverlauf intranukleäre Inklusionen und neuropile Aggregate auf, welche wahrscheinlich das toxische Htt-Fragment mit EPW enthalten [34]. Ein weiteres Mausmodell mit verkürztem Htt-Fragment ist R6/2. R6/2 exprimiert unter dem humanen Htt-Promotor einen Teil des Exon 1 (144 Glutamine und weitere 69 Aminosäuren des ersten Exons) des humanen HD Gens, welches eine stark vergrößerte Anzahl, nämlich 144 PGW, enthält und einen fortschreitenden neurologischen Phänotyp mit vielen Ähnlichkeiten zu HD entwickelt [41]. Dieser Phänotyp beinhaltet motorische Fehlfunktionen [60], Beeinträchtigung des Unterscheidungslernens [61], abnorme synaptische Plastizität und eine beeinträchtigte räumliche Wahrnehmung [62]. Beeinträchtigung des Lernens, manifestiert durch abnorme synaptische Plastizität, beeinträchtigte räumliche Wahrnehmung [62] und Unterscheidungsfähigkeit, können bereits 3 Wochen nach der Geburt beobachtet werden [61], die Gehirngewichtsabnahme beginnt nach 4 Wochen [33] und die motorischen Fehlfunktionen treten im Alter von 5 Wochen auf [60]. In der vorliegenden Untersuchung wurde dieses R6/2 Mausmodell verwendet, da es eines der am besten charakterisierten Mausmodelle für HD ist [23, 33, 40, 41, 44, 53, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66]. Der relativ schnelle Verlauf der Erkrankung in einem Zeitraum von ungefähr 12 Wochen [41] lässt bei guter Annäherung des Verlaufs an die Erkrankung beim Menschen [41, 61, 62, 67] eine Vielzahl unterschiedlicher Experimente in einem überschaubaren Zeitraum zu, im Gegensatz zu Mausmodellen, wo das gesamte IT15 Gen in das Genom integriert wurde.

1.4.3 Expressionsveränderung auf RNA Niveau bei R6/2 Mäusen

Die Untersuchung von Veränderungen auf der RNA Ebene bei R6/2 Mäusen hat Einblicke in die Pathologie von HD gewährt. Früh im Krankheitsprozess ist der mRNA Level von spezifischen Glutamat-, Dopamine- [40], und Cannaboidrezeptoren [68], Proteinen im Dopamin Signaltransduktionspfad [69] und met-enkephalin erniedrigt. Diese Veränderungen des Transkriptionsniveaus wurden auch in Gehirnen von HD Patienten [Seite 27↓]gefunden [70, 71, 72]. Genexpressions Mikroarrays bestätigten diese Ergebnisse und zeigten, dass Gene, welche unter anderem bei G-Protein gekoppeltem Rezeptor Signalpfaden, Kalzium-Homöostase und Retinioiden Signalwegen eine Rolle spielen, nach 6 Wochen im Striatum von R6/2 Mäusen herunterreguliert waren [73] (Abb. 1).

Abb. 1: Neurotransmitterrezeptoren bei HD

Die unterschiedlichen Neurotransmitterrezeptoren, deren differentielle Expression bei HD in R6/2 Mäusen eine Rolle spielen werden gezeigt. Die Abbildung ist der Veröffentlichung von Luthi-Carter et. al. entnommen (Abb. 4; [73]). Das Expressionsniveau der Produkte der differentiell exprimierten Gene in mittelgroßen, dornenförmigen Neuronen des Striatums im Vergleich zu Kontrollmäusen ist dargestellt. Die fette Schriftart symbolisiert Genprodukte, die in vier/vier Genchip-Experimenten differentiell exprimiert wurden oder deren Expression durch eine andere, unabhängige Methode bestätigt wurden (einzelner Stern). Die Farbe jedes dargestellten Elements zeigt die Richtung der Expressionsveränderung an. Rote Elemente zeigen einen Anstieg, Blaue eine Verminderung und graue Elemente eine entweder unveränderte, nicht den Auswahlkriterien entsprechende oder nicht untersuchte Expression an. Einfache Linien mit dreieckigen Pfeilen repräsentieren sequentielle Ereignisse oder positive Regulation. Stumpfe Enden entsprechen negativer Regulation. Pfeile mit unterbrochenen Linien zeigen den Fluss von Ionen. Zweifache Sterne zeigen mRNA, die nach weniger strengen Kriterien (drei/vier Chips) differentiell exprimiert war. Für die übersichtliche Darstellung wurden nur repräsentative Mitglieder des Proteinphosphatase 1/DARPP-32 Regulationsstoffwechselweges gezeigt. Einen gründlichen Übersichtartikel zu diesem Stoffwechselweg findet man an anderer Stelle [74].

1.4.4 Veränderung bei R6/2 Mäusen auf der Proteinebene

Bei der Untersuchung der Erkrankung auf der Translationsebene zeigte sich, dass sowohl HD Patienten als auch R6/2 Mäuse intranukleäre Einschlüsse (NII) im zerebralen Kortex und dem Striatum entwickeln [13, 31, 33]. NII sind in R6/2 Mäusen bereits im Alter von 4 Wochen gegenwärtig und ihre Zahl steigt nur in geringem Umfang bis kurz vor dem Endstadium der Erkrankung (zwölf Wochen). Im Gegensatz dazu, nimmt die Anzahl der neuropilen Aggregate im Zytoplasma um das vierzehnfache während des Krankheitsverlaufes zu [22]. Aggregate könnten bei neurodegenerativen Erkrankungen vielleicht durch die Rekrutierung von Faktoren zelltoxisch wirken, die normalerweise für die Funktion, Vitalität und Struktur der Zelle wichtig sind [75, 76, 77]. Diese Hypothese wird durch die Beobachtung gestützt, dass bis jetzt schon bestimmte Komponenten des Proteasoms [78], Transkriptionsfaktoren [79, 80], Chaperone [81, 82] und Kaspasen [38] als Aggregatkomponenten identifiziert worden sind. Es wurde bereits gezeigt, dass zwei Mitglieder der Familie der kleinen Hitzeschockproteine (Hsp), die Chaperone Hsp40 und Hsp70, die Aggregation von verkürzten Polyglutaminproteinen in amyloidartige Fibrillen „in vitro“ hemmen [83]. Ein weiteres Mitglied der kleinen Hsp Familie, αB-Kristallin (ABC) ist während der reaktiven Gliose [84, 85], eine neuropathologische Eigenschaft von HD [54], hochreguliert. Es wurde gezeigt, dass die Überexpression von ABC, Aggregation, die durch die Überexpression des „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP) in Astrozyten verursacht wird, reduziert [82]. Diese Beobachtung spricht für eine Mitwirkung von ABC in einem Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung der Intermediärfilamentstruktur verantwortlich ist. ABC wurde auch als eine Komponenten der Plaques bei der Alzheimer Krankheit nachgewiesen [86].

1.5 Durchführung einer Proteomics Studie für HD

Einige Überlegungen zu den Eigenschaften und Möglichkeiten einer Proteomics Studie helfen bei deren korrekten Planung und Durchführung.


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1.5.1 Allgemeine Grundlagen für eine Proteomics Studie

Das Proteom eines zu untersuchenden Gewebes besteht aus allen Proteinen, die in diesem Gewebe im Laufe der Zeit exprimiert werden [87]. Diese Expression ist abhängig vom Entwicklungsstadium des untersuchten Gewebes und bei Erkrankungen auch davon, ob das Gewebe krank oder gesund ist. Um Aussagen über den Zustand eines erkrankten Gewebes machen zu können, ist das Vorhandensein einer Referenz wichtig, das gesunde Gewebe. Die Beurteilung über die Durchführbarkeit einer Proteomics Studie bei Erkrankungen richtet sich aus diesem Grund am Vorhandensein der Zustände „krank“ und „gesund“ aus. Absolute Aussagen nach ausschließlicher Untersuchung des erkrankten Gewebes lassen sich nicht machen, da eine absolute Quantifizierung der Proteine in der Probe nicht möglich ist. Der Proteomics Ansatz ist somit ein vergleichender Ansatz.

1.5.2 Eingrenzung der Vielfalt bei der Proteomics Studie

Bei der Auswahl des zu untersuchenden Spezies muss man sich über die Vorteile und Limitierungen der einzelnen Spezies, vor allem im Hinblick auf die mögliche Aussagefähigkeit der durch eine Proteomics Studie zu erzielten Resultate im klaren sein. Bei der Untersuchung einer Erkrankung, z. B. HD, an Geweben vom Menschen ist eine direkte Relevanz der Ergebnisse gewährleistet. Histologische und morphologische Untersuchungen liefern aufgrund ihrer überschaubaren Komplexität gute Ergebnisse mit menschlichem Probenmaterial. Werden die Proteine aus einem Gewebe jedoch mittels Großgel 2D-Elektrophorese aufgetrennt, kann man mehrere tausend Proteinspots mit sehr unterschiedlicher Intensität auf dem 2D Gel unterscheiden. Die nach dem Vergleich von zwei Gelen auftretenden Unterschiede können verschiedenartigste Ursachen haben. Proteinpolymorphismen, z. B. durch Mutation, veränderte Struktur und posttranslationale Modifizierungen bilden eine Gruppe der möglichen Ursachen für diese Unterschiede. Physiologische, aufgrund von ablaufenden Stoffwechselvorgängen, oder methodische Unterschiede bilden zwei weitere Kategorien. Schließlich besteht noch die Möglichkeit, dass die Unterschiede ihre Ursache in der untersuchten Erkrankung haben. Vor allem durch die posttranslationale Prozessierung und Modifizierung ist die Vielfalt auf der Protein- gegenüber der RNA-Ebene um ein vielfaches höher. Beim Menschen erhöht sich die Proteinvielfalt noch durch die Heterogenität innerhalb der Spezies. Dieses Problem der [Seite 30↓]hohen Variabilität der Proteinexpression innerhalb der Spezies Homo Sapiens, selbst bei guter Reproduzierbarkeit der Methode, tritt bei Tiermodellen, wo häufig Inzucht die Regel ist, nicht auf, da diese ein homogenes Genom besitzen. Die Unterschiede zwischen zwei zu vergleichenden Proteomen sind meist quantitativer (Spotintensität) und nicht qualitativer (Spot ist vorhanden oder nicht) Natur. Dies ist eine Beobachtung die auch für die Heterogenität der Expression zwischen den Individuen einer Spezies gilt. Auch hier treten meist quantitative Unterschiede bei Proteinspots auf. Die Heterogenität innerhalb einer Spezies kann also krankheitsrelevante Unterschiede, durch zuvor schon existente Spotintensitätsunterschiede eines Proteins zwischen den Individuen, maskieren. Die Heterogenität innerhalb der Spezies lässt sich also durch die Verwendung eines Krankheitsmodells mit ingezüchteten Versuchstieren umgehen und die nicht gewollte Variabilität zwischen zwei untersuchten Proben kann so reduziert werden.

1.5.3 Auswahl eines geeigneten Modellsystems für HD

Ein weiterer Nachteil ist, dass Humanproben nicht im Rahmen eines Experimentes manipuliert werden können, was eine Überprüfung von komplexen Hypothesen sehr schwierig macht. Ein wichtiger Punkt war nun die Auswahl eines geeigneten Modellsystems für die Untersuchung von HD. Bei der Auswahl des Systems muss die experimentelle Fragestellung berücksichtigt werden. Bei der Untersuchung einer neurodegenerativen Erkrankung wie HD ist es wichtig, dass das Gehirn des Modelltieres dem des Menschen ziemlich nahe kommt, ohne jedoch dessen Generationszeit zu besitzen. Bei der vorliegenden Studie erwies sich die Maus als guter Kompromiss. Abb. 2 zeigt deutlich die Ähnlichkeit beider Spotmuster, in vergleichbaren Gelausschnitten, zwischen den Spezies Maus (Mus Musculus ) und Mensch (Homo Sapiens). Die Mäuse können im Gegensatz zum Menschen gezielt experimentell manipuliert werden, was eine Überprüfung von aufgestellten Hypothesen vereinfacht. Ingezüchtete Mäuse weisen eine gute Reproduzierbarkeit bei Kontrolltieren und transgenen Tieren auf (Abb. 2). In der vorliegenden Studie gab es zwischen Kontrolle und erkrankter Maus selbst krankheitsspezifische Unterschiede nur in geringem Maße. Anders verhielt es sich dagegen bei einem Vergleich von Individuen des Menschen. Die Proben wiesen viele Unterschiede zwischen HD und Kontrolle auf, die nach Quervergleich von mehreren Probenpaaren unspezifisch und auf die Heterogenität innerhalb der Spezies zurückzuführen waren (Abb. 2 und Tab. 12 und 13 im Anhang). Außerdem gab es beim Menschen zwischen den [Seite 31↓]jeweiligen Kontrollen bzw. HD 2D Gelen ähnlich viele Unterschiede wie zwischen HD und Kontrolle. Eine Limitierung des Modellsystems besteht jedoch in der Tatsache, dass die Ergebnisse immer noch mit Ergebnissen aus dem humanen System untermauert werden müssen.

Abb. 2: Speziesübergreifende Ähnlichkeit der Spotmuster und Vergleich der Reproduzierbarkeit bei der Spezies Maus und Mensch

Ausschnitte von der Seite mit hohem pH (6 – 9,5) von 2D Gelen, eines repräsentativen Probenpaares der Spezies Mensch und Maus zeigen eine deutliche Ähnlichkeit der Musterstrukturen in den Gelausschnitten. Große Unterschiede sind zwischen HD- und Kontroll-Spots beim Menschen nicht aber bei der Maus zu sehen. Das Probenpaar bei der Maus stammt von 8 Wochen alten Mäusen. Das Probenpaar vom Menschen stammt aus dem vorderen Globus Cinguli von zwei Postmortem-Gehirnen (HD, B3703 und Kontrolle, B3700). Zum Zeitpunkt des Todes war Patient B3703, 61 und B3700, 62 Jahre alt (Tab. 7).

1.5.4 Verfügbarkeit der Proben bei Maus und Mensch

Der Zugang zu geeignetem menschlichem Gewebematerial stellt im Gegensatz zu Blut oder Urin ebenfalls ein Problem dar. Genetische Erkrankungen, wie z. B. Huntington’s [Seite 32↓]Chorea sind selten, sodass die Anzahl der zur Verfügung stehenden Proben begrenzt und das Material kostbar ist. Anfragen nach Proben aus dem menschlichen Gehirn werden von Gehirnbanken nur bei Nachweis spezifischer, vielversprechender Vorstudien mit Tiermodellen berücksichtigt. Die größte Zahl der Proben ist vom Endstadium der Erkrankung erhältlich. Die Zahl der geeigneten Proben verringert sich noch dadurch, dass menschliches Gewebe oft vor dem Einfrieren lange Zeit bei 4 °C gelagert, danach mit Formalin konserviert und erst dann eingefroren wird. Die dadurch entstehenden Proteinmodifizierungen wirken sich negativ auf das Spotmuster im Gel aus. Zeitverlaufsstudien sind aufgrund der geringen Zahl der Proben aus frühen Stadien, meist von Unfallopfern mit der Erkrankung, kaum oder nicht möglich. Interessante Proben, wie z.B. bei HD aus „juvenile Onset“ Fällen, also HD Fällen von Jugendlichen und Kindern, mit schwerem Verlauf und somit auffälligen Änderungen bei der Proteinexpression sind sehr selten. Nach diesen Fällen besteht aber eine sehr große Nachfrage. Aufgrund strenger ethischer Richtlinien bedarf die Arbeit mit Humanmaterial der besonderen Genehmigung durch eine Ethikkommission der wissenschaftlichen Hochschule. Diese Genehmigung ist mit hohem Aufwand an Verwaltung und Zeit verbunden, ohne die Gewährleistung von aussagekräftigen Ergebnissen. Aufgrund der Möglichkeit zur im Prinzip unbegrenzten Nachzucht und der zeitnahen Sicherung des Probenmaterials durch sofortiges Einfrieren des Gewebes nach Entnahme aus der frisch getöteten Maus, ist eine Begrenzung des Probenmaterials bei der Maus kaum zu erwarten. Die Genehmigung von Tierversuchen ist sehr viel unproblematischer als die Anträge auf Probenakquisition beim Menschen. Die Aufzucht der Mäuse erfolgt unter für das Krankheitsmodell und die Kontrolltiere identischen, definierten Bedingungen.

1.5.5 Erkenntnisgewinn aus einer Proteomics Studie

Vor der Durchführung einer Proteomics Studie muss man sich auch über die zu erwartenden Ergebnisse im klaren sein. Nach der Untersuchung des Proteoms zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf einer Erkrankung, erhält man die zeitlich aufgelöste Expression vieler, unterschiedlicher Proteine. Untersuchung verschiedener Gewebe liefert ein Bild über die Gewebsexpression. Die Fraktionierung der Proben vor der Auftrennung im 2D Gel gibt nähere Auskunft über die mögliche Lokalisation der untersuchten Proteine in der Zelle (Zytoplasma, Membran oder Kern) [88]. Die Untersuchung des Proteoms gibt also einen ersten Anhaltspunkt über die bei der Pathogenese beteiligten Proteine und deren [Seite 33↓]Expression. Diese Untersuchung bildet die Grundlage für weitere, klassische, biochemische Untersuchungsmethoden zur Aufklärung der Funktion der als krankheitsrelevant identifizierten Proteine. Bei der Proteomics Studie handelt es sich um einen wichtigen, breit angelegten, nicht hypothesenbestimmten Ansatz um auch krankheitsrelevante Proteine zu identifizieren, die sich nicht direkt von Wechselwirkungen mit dem krankheitsverursachenden Protein ableiten lassen. Mit dieser Vorgehensweise können also neue Ansatzpunkte für bereits existierende molekularbiologische und biochemische Methoden gefunden werden.


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10.03.2005