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4  Materialien und Methoden

4.1 Tiere und Gewebe

Gewebe von 4, 8 und 12 Wochen alten, transgenen R6/2 Mäusen sowie CBA x C57Bl/6 Kontrollmausgewebe wurden in unseren Studien verwendet. Diese wurden im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Dr. Gillian P. Bates, Guy’s Hospital, London, UK, aus deren Mäusezucht bereitgestellt. R6/2 Mäuse wurden durch Rückkreuzung auf (C57Bl/6 x CBA)F1 Mäuse vermehrt. Die Genotypisierung und die Bestimmung der Länge der CAG-Wiederholungen wurde wie bereits beschrieben durchgeführt [65]. C57Bl/6 Mäuse wurden von Charles River, Deutschland, erworben. Menschliche Gehirnproben wurden von verschiedenen Quellen erworben. Striaten und Parietallappen von einem Huntington Chorea Patienten und einer Patientin, wie auch die in Alter und Geschlecht übereinstimmenden Kontrollen, waren ein Beitrag vom Institut für Neuropathologie der „Ludwig Maximilian“ Universität München. Proben des vorderen Globus Cinguli (Brodmann Bereich 24) von Grad 4 Gehirnen [54] und die in Alter und Geschlecht übereinstimmenden Kontrollen wurden vom Harvard Brain Tissue Resource Center, MA, USA bereitgestellt (Aufstellung der Proben, Tab.7).

4.2 Gewinnung von Gehirnregionen und anderen Geweben

Mausgehirne wurden präpariert wie an anderer Stelle bereits beschrieben [88]. Mäuse wurden enthauptet, das Fell entfernt, der Schädel geöffnet und das Gehirn vollständig entnommen. Das Rückenmark wurde am Rhombenzephalon abgetrennt. Das Gehirn wurde in eine auf Eis gelagerte Petrischale, welche mit 0,9 % (w/v) Kochsalzlösung (NaCl, Merck, Darmstadt, Deutschland) gefüllt war, verbracht. Am Gehirn verbliebenes Blut wurde durch vorsichtiges spülen mit der Kochsalzlösung entfernt. Das Gehirn wurde nun mit Kimwipes® (Kimwipes® Lite; Hakle-Kimberly, Mainz, Deutschland) trockengetupft, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C für den weiteren Gebrauch gelagert. Die folgenden Gehirnregionen wurden von einem Pathologen mit großer Erfahrung mit der Handhabung von Mausgehirnen von drei weiblichen, 20,5 Wochen alten, C57Bl/6 Mäusen präpariert: Nervus Trigeminus, Hypophyse, Motor Kortex (mit [Seite 36↓]Amygdala und Area Entorhinalis), Hippocampus, Bulbi Olfaktorii, Cerebellum, Striatum, Frontaler Kortex, Mittelhirn, Rhombenzephalon, Thalamus (mit Hypothalamus) und das Septum. Leber, Herz und Testes wurden auf gleiche Wiese präpariert wie das Gehirn. Die Leber wurde zum Entfernen des Blutes mit 0,9 % (w/v) Kochsalzlösung perfundiert.

4.3 Herstellung von Proteinproben

4.3.1 Konzept

Die Methode zur Extraktion von Proteinen wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben [88]. Bei der Prozedur wurden gefrorene Gewebeteile von Organen mechanisch in kleine Stücke zerkleinert und dann chemisch und enzymatisch weiter zerteilt. Maximal drei Fraktionen wurden von jeder Gewebeprobe hergestellt: die erste Fraktion enthält die pufferlöslichen Proteine (Proteine hauptsächlich aus dem Zytoplasma), die Zweite beinhaltet die Harnstoff/Detergenz (CHAPS) löslichen Proteine (Membranfraktion). Diese Fraktion beinhaltet Proteine, welche in Membranen und anderen Strukturen der Zelle und allen Organellen, eingebettet sind. Die dritte Fraktion, das Restpellet, ist eine Kernfraktion, die hauptsächlich aus Chromatin besteht. Durch DNAse Behandlung werden die chromosomalen Proteine (Histone u. a.) freigesetzt. Ein wichtiges Kennzeichen dieses Verfahrens ist es, dass mit den drei Fraktionen das gesamte Spektrum von Proteinen abdeckt wurde, welches in einer Gewebeprobe vorhanden ist. Jeder selektive Verlust von Proteingruppen wurde wegen dem Fehlen von Reinigungsschritten vermieden. Die Proteinkonzentrationen in den Extrakten sind fast mit der „in vivo“ Konzentration identisch, was den Verlust von Proteinklassen durch Aggregation nahezu ausschließt. Die Komponenten, welche zu den jeweiligen Geweben während der Extraktionsprozedur zugegeben wurden, basierten immer auf dem Gewicht, womit Unterschiede in der Proteinkonzentration aufgrund von Gewebsgewichtsunterschieden zwischen R6/2 und Kontrollmäusen ausgeschlossen wurden. Eine zusätzliche Kontrolle für die gleiche Proteinkonzentration in beiden Proben ist die Tatsache, dass die meisten der Proteinspots auf R6/2- und Kontroll-2D-Gelen mit der gleichen Intensität exprimiert wurden und diese somit als interner Standart für gleiche Proteinkonzentrationen in beiden Proben dienten. Die Reproduzierbarkeit der Extraktionsprozedur wurde streng kontrolliert indem errechnete Referenzwerte mit Standardwerten verglichen wurden ([88], Seite 83 Note 4 und dort befindliche Referenzen). Durch die Fraktionierung erhöht sich die Anzahl der [Seite 37↓]durch die 2D Gelelektrophorese nachweisbaren Proteine indem diese über drei Gele verteilt wurden. Bei der Proteinextraktion diente Harnstoff als chaotrophes Agens, das Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb und zwischen den Peptidketten bei den Proteinen zerstört. Hohe Harnstoffkonzentrationen waren notwendig um eine komplette Denaturierung von Proteinen mit Disulfitbrücken zu gewährleisten. Harnstoff muss auch während der IEF vorhanden sein um zu gewährleisten, dass die Proteine nicht erneut renaturieren. Der Vorteil der Verwendung von Harnstoff ist, dass er die intrinsische Ladung der Proteine nicht beeinflusst und so die IEF nicht stört. Ein Überschuss an DTT ist sehr wichtig um die Disulfitbrücken innerhalb der Proteine zu reduzieren und somit aufzubrechen. Diese würden sonst der Denaturierung entgegenwirken und die Absättigung der Proteine mit SDS während der SDS-PAGE in der zweiten Dimension der Elektrophorese stören. Bei der Membranfraktion sorgten CHAPS und Harnstoff für das Herauslösen von Proteinen aus zellulären Strukturen. Die Benzonase-Behandlung bei der Kernfraktion setzt DNA-gebundene Proteine frei.

4.3.2 Durchführung der Proteinextraktion

4.3.2.1 Plasmatische Fraktion

Bei -80 °C eingefrorene Proben, mit einem vom Gewebe abhängigen Gewicht (bis ca. 500 mg), wurden so schnell wie möglich gewogen um die Kondensation von Wasser auf dem gefrorenen Gewebe zu vermeiden. Kondenswasser würde das Gewicht der Probe vergrößern und die auf dem Probengewicht basierenden Berechnungen zur Puffer und Inhibitorenzugabe verfälschen. Nach dem Wiegen wurden die Probe in vorgekühlten Mörser aus Halbedelstein (WITA, Berlin, Deutschland) verbracht, der sich, ungefähr zur Hälfte in flüssigem Stickstoff getaucht, in einer Styropor® Box befand. Probenpuffer P1 (keine Zugabe von P1 bei Gehirn und Testes zu diesem Zeitpunkt) und Proteasehemmerlösungen H1 und H2 wurden zum Gewebe zugegeben, wobei die benötigten Mengen mit Hilfe des Probengewichts bestimmt wurden (Tab. 2). P1 bestand aus 50 mM TRISMA®Base (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland), 100 mM KCl (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 20 % (w/v) Glyzerin (Merck, Darmstadt, Deutschland). H1 bestand aus den Protease-Inhibitoren Pepstatin A (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) und PMSF (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland). Das Ansetzen des Hemmers erfolgte in Chargen von 19 ml. Hierzu wurden 0,0048 g Pepstatin [Seite 38↓]A in 50 mL Ethanol (reinst) (Merck, Darmstadt, Deutschland) bei 37 °C und 0,174 g PMSF in 10 ml Ethanol (reinst) gelöst. Die beiden Lösungen wurden dann zu gleichen Teilen (9,5 ml) gemischt und in Portionen zu je 200 µl aliquotiert und bei -80 °C gelagert. H2 bestand aus einer Tablette Complete® (Roche, Mannheim, Deutschland), welche in 2 ml P1 gelöst wurde. Es erfolgte eine Aliquotierung zu je 100 µl und eine Lagerung bei –80 °C. Die zugebenen Volumen wurden anhand des Probengewichtes wie in Tab. 2 beschrieben, berechnet.


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Tab. 2: Zusammenfassung der Arbeitsschritte für die Proteinextraktion in verschiedenen Geweben

Arbeitsschritt[a]

Gewebe

Gehirn[b]

Leber

Herz

Zytoplasma

 

Homogenisieren 1

PG

220 - 250 mg

220 - 250 mg

100 – 150 mg

P1

 

PG x 1,5

PG x 1,0

 

PG

∑1 = PG + P1[c]

∑1 = PG + P1

H1

PG x 0,02

∑1 x 0,02

∑1 x 0,02

H2

PG x 0,08

∑1 x 0,08

∑1 x 0,08

 

∑1 = PG + H1 + H3

∑2 = ∑1 + H1 + H3

∑2 = ∑1 + H1 + H3

Ultraschall

Anzahl Kugeln

 

∑2 x 0,034

∑2 x 0,034

Wiederholungen

 

6 x 10 sec

12 x 10 sec

Zentrifugation 1

Bedingungen

TI50 Rotor, 50000 rpm, 30 min, 4°C

TI50 Rotor, 50000 rpm, 30 min, 4°C

TI50 Rotor, 50000 rpm, 30 min, 4°C

Überstand Ü1

Einfrieren

Einfrieren

Einfrieren

Pe1

Wiegen

Wiegen

Wiegen

Homogenisieren 2

P1

Pe1 x 0,5

Pe1 x 2,0

Pe1 x 1,0

 

∑2 = Pe1 + P1

∑3 = Pe1 + P1

∑3 = Pe1 + P1

H1

∑2 x 0,02

∑3 x 0,02

∑3 x 0,02

H2

∑2 x 0,08

∑3 x 0,08

∑3 x 0,08

 

∑3 = ∑2 + H1 + H3

  

Ultraschall

Anzahl Kugeln

∑3 x 0,034

  

Wiederholungen

6 x 10 sec

  

Rühren

4°C, 45 min

4°C, 45 min

4°C, 45 min

Zentrifugation 2

Bedingungen

TI50 Rotor, 50000 rpm, 30 min, 4 °C

TI50 Rotor, 50000 rpm, 30 min, 4 °C

TI50 Rotor, 50000 rpm, 30 min, 4 °C

Ü1 + Ü2

Wiegen

Wiegen

Wiegen

Pe2

Wiegen

Wiegen

Wiegen

KF A

 

(Ü1 + 2)/PG

(Ü1 + 2)/PG

(Ü1 + 2)/PG

1D-Lauf

Aliquot Al (aus Ü1 + 2)

50 µl

50 µl

50 µl

Ha

Al x 1,08 (= 54 mg)

Al x 1,08 (= 54 mg)

Al x 1,08 (= 54 mg)

DTT

Al x 0,1 (= 5 µl)

Al x 0,1 (= 5 µl)

Al x 0,1 (= 5 µl)

Servalyte 2-4

Al x 0,1 (= 5 µl)

Al x 0,1 (= 5 µl)

Al x 0,1 (= 5 µl)

Verdünnung

 

1:2 (20 µl + 20 µl)

1:2 (20 µl + 20 µl)

Auftragsmenge

6 oder 9 µl

6 µl

6 µl

 

Membran

 

P2

Pe 3 x 1,4

Pe 3 x 1,6

Pe 3 x 2,2

 

∑4 = Pe 3 + P2

∑4 = Pe 3 + P2

∑4 = Pe 3 + P2

H3

∑4 x 0,08

∑4 x 0,08

∑4 x 0,08

 

∑5 = ∑4 + H3

∑5 = ∑4 + H3

∑5 = ∑4 + H3

Rühren

4°C, 60 min

4°C, 60 min

4°C, 60 min

Ha

∑5 x 0,56

∑5 x 1,08

∑5 x 0,25

Rühren

RT, 45 min

RT, 45 min

RT, 45 min

DTT

∑5 x 0,1

∑5 x 0,1

∑5 x 0,1

Servalyte 2-4

∑5 x 0,1

∑5 x 0,1

∑5 x 0,1

Zentrifugation 3

Bedingungen

TI50 Rotor, 50.000 rpm, 30 min, 17 °C

TI50 Rotor, 50.000 rpm, 30 min, 17 °C

TI50 Rotor, 50.000 rpm, 30 min, 17 °C

KF B

 

Ü3/Pe3

Ü3/Pe3

Ü3/Pe3

Auftragsmenge

10 µl

10 µl

10 µl

 

Kern

 

P3

Pe4 x 1,0

Pe4 x 1,0

Pe4 x 1,0

 

∑6 = Pe3 + P3

∑6 = Pe3 + P3

∑6 = Pe3 + P3

Ben

∑6 x 0,025

∑6 x 0,025

∑6 x 0,025

Rühren

4°C, 30 min

4°C, 30 min

4°C, 30 min

 

∑7 = ∑6 + Ben

∑7 = ∑6 + Ben

∑7 = ∑6 + Ben

Ha

∑7 x 1,08

∑7 x 1,08

∑7 x 1,08

DTT

∑7 x 0,1

∑7 x 0,1

∑7 x 0,1

Rühren

RT, 30 min

RT, 30 min

RT, 30 min

Servalyte 2-4

∑7 x 0,1

∑7 x 0,1

∑7 x 0,1

Summe

∑8 = ∑7 + Ha + DTT

∑8 = ∑7 + Ha + DTT

∑8 = ∑7 + Ha + DTT

KF C

 

∑8/Pe4

∑8/Pe4

∑8/Pe4

Auftragsmenge

10 µl

10 µl

10 µl

[a]Die genaue Erklärung des Ablaufes der einzelnen Arbeitsschritte erfolgt im laufenden Text. [b]Testesgewebe wurde wie Gehirngewebe aufgearbeitet. [c]Bei Berechnungen wird immer das Gewicht der angegebenen Summe (å) oder Komponente, z. B. von P1 oder H1 eingesetzt. Abkürzungs- und Begriffserklärungen: ∑, Summe aus verschiedenen Komponenten; Ben, Benzonase; Ha, Harnstoff; HX, Hemmer X; Kern, durch Benzonase Behandlung (DNA-Verdau) freigesetzte Proteine; KF X, Kontrollfaktor X; Membran, Harnstoff/Detergenz (CHAPS) lösliche Proteine aus den Membranen der Zelle und der Organellen; PeX, Pellet X; PG, Probengewicht; PX, Puffer X; Zytoplasma, gepoolter erster und zweiter Überstand der zytoplasmatischen und nukleoplasmatischen Fraktion; ÜX, Überstand X.

Das Gewebe wurde nun mit einem Stößel zusammen mit P1, H1 und H2 zu einem feinen Puder zermahlen. Bei Leber und Herz wurde der Gewebepuder nun vorsichtig in ein 2 ml Eppendorfgefäß verbracht und eine genau berechnete Anzahl Glaskugeln (Tab. 2) zugegeben (2,5 ± 0,05 mm Durchmesser; Worf Glaskugeln GmbH, Deutschland) und einer [Seite 40↓]Ultraschallbehandlung zugeführt. Bei Gehirn und Testes erfolgte die Ultraschallbehandlung erst nach dem zweiten Mörsern der Probe (Tab. 2). Hierzu wurde ein Ultraschallbad (Sonorex RK 31; Bandelin, Berlin, Deutschland), gefüllt mit Eiswasser, verwendet. Die Ultraschallbehandlung erfolgte jeweils für 10 s, die verbleibende Zeit bis 60 s wurde für die Probenkühlung im Eiswasser verwendet, wobei das Homogenat zum besseren Wärmetausch mit einem dünnen Platindraht gerührt wurde. Bei einer länger als 10 s dauernden Ultraschallbehandlung würde die Probe zu warm, sodass die Proteine geschädigt werden könnten. Anschließend wurde die Probe für 60 s auf Eis gelagert. In dieser Zeit wurde eine zweite Probe bearbeitet. Auf diese Weise war es möglich, immer von zwei Proben, jeweils abwechselnd, Proteine zu extrahieren. Die Zahl der Wiederholungen der Ultraschallbehandlung war stark vom Gewebe abhängig. Gewebe mit niedrigem Muskelanteil, wie z. B. Gehirn, wurden sechs mal und das mit hohem Muskelanteil (Herz), zwölf mal behandelt. Im Anschluss an die Ultraschallbehandlung wurden die Glaskugeln durch Zentrifugation entfernt. Hierzu wurde das Eppendorfgefäß mit der Probe dicht verschlossen und auf den Kopf gestellt. Anschließend wurde mit einer Nadel ein Loch, mit ca. 1,5 mm Durchmesser, an die tiefste Stelle des gewölbten Bodens gestochen. Das Eppendorfgefäß wurde nun auf ein Zweites gesteckt und bei 3500 UPM (Varifuge® 3,0 R; Kendro, Hanau, Deutschland) eine Minute lang zentrifugiert. Auf diese Weise erfolgte die nahezu verlustfreie Abtrennung der Glasskugeln aus dem Homogenat. Das Homogenat wurde nun im zweiten Eppendorfgefäß in flüssigen Stickstoff gefroren, wobei dieses im 45° Winkel gehalten wurde. Diese Schräglage erleichterte das Entfernen des nun gefrorenen Homogenats aus dem Gefäß durch Klopfen mit dem Griffende eines plastikverkleideten Schraubenziehers. Das Homogenat wurde in noch gefrorenem Zustand in ein Ultrazentrifugenröhrchen (16 x 76 mm, 13,5 ml; Nalgene Company, Rochester, NY, USA) verbracht und dann bei 4°C unter rühren aufgetaut und schließlich bei 226.0000 g, 30 min. bei 4°C zentrifugiert (CENTRICON T-2060; Kontron, Eching, Deutschland; Rotor: TFT 50.13; Kontron, Eching, Deutschland). Nach der Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig mit einer über einem Bunsenbrenner „ausgezogenen“ Pasteurpipette entfernt und in einem NUNC® (1,8 ml) Röhrchen gesammelt und sofort in flüssigem Stickstoff gefroren, um die vielleicht noch trotz der zugegebenen Hemmer verbliebene Restaktivität von Proteasen zu unterbinden. Das Pellet wurde ebenfalls in flüssigem Stickstoff eingefroren und gewogen. Durch Klopfen mit dem Schraubenzieher wurde das tiefgefrorene Pellet in den vorgekühlten Mörser verbracht (siehe oben) und es wurden [Seite 41↓]erneut P1 (zum ersten Mal bei Gehirn und Testes), H1 und H2, abhängig von Gewicht und bearbeitetem Gewebe, zugegeben (Tab. 2) und wie bereits beschrieben, gemörsert. Bei den Testes und beim Gehirn erfolgte erst jetzt die Ultraschallbehandlung. Bei Herz und Leber wird das nach dem Mörsern entstandene Pulver direkt in das Ultrazentrifugenröhrchen mit Mikrorührfisch (Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland) verbracht, bei 4 °C unter Rühren aufgetaut und danach weitere 45 min. gerührt. Die zweite Zentrifugation erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie die Erste (Tab. 2). Nach Abnahme des Überstandes wurde dieser mit dem Ersten gepoolt und beide zusammen gewogen. Die Kontrolle der Reproduzierbarkeit der Extraktionsprozedur erfolgte indem das Gewicht der beiden gepoolten Überstände durch das am Anfang eingesetzte Gewebegewicht geteilt wurde. Dieser Wert wurde mit Standartwerten aus bereits durchgeführten Proteinextraktionsprozeduren des gleichen Gewebes verglichen. (Tab. 2 und [88], Seite 83 Note 4 und dort befindliche Referenzen). Nun wurde ein Aliquot der ersten beiden Überstände mit 9 M Harnstoff (Biorad, Hercules, CA, USA), 70 mM Dithiothreitol (DTT, Biorad, Hercules, CA, USA) und 2 % (v/v) Servalyte 2,0 – 4,0 (Serva, Heidelberg, Deutschland)(Endkonzentrationen in der Probe!) versetzt. Je nach Gewebeart wurde die Probe noch verdünnt (Leber und Herz) oder nicht (Testes und Gehirn). Der Probenverdünnungspuffer bestand aus 9 M Harnstoff, 0,07 M DTT, 2% (v/v) Servalyte pH 2,0 – 4,0 und bidestilliertem Wasser. Dieser Schritt diente zur Vorbereitung des Probenauftrags auf die isoelektrische Fokussierung (IEF). Das zweite Pellet (Pe2) wurde sofort nach der zweiten Überstandsabnahme in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

4.3.2.2 Membranfraktion

Das Pellet, welches bei der Extraktion der zytoplasmatischen und nukleoplasmatischen Proteine zurückblieb (Pe2), wurde mit Puffer 2 (P2), in welchem das Detergenz CHAPS gelöst war und Hemmer 3 (H3) zusammengebracht (Tab. 2) und wie in 4.3.2.1 beschrieben, gemörsert. P2 bestand aus 200 mM KCl, 20% (w/v) Glyzerin und Phosphatpuffer (ca. 33 ml 200 mM NaH2PO4 (Merck, Darmstadt, Deutschland) + 67 ml 200 mM Na2HPO4 (Merck, Darmstadt, Deutschland) ergab pH = 7,2) mit einem Pufferendvolumen von 90 ml und einem pH von 7,1. H3 wurde wie H2, jedoch mit P2 anstatt P1, hergestellt. 77 mg CHAPS (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 27 µl bidestilliertes Wasser wurden zu 900 µl P2 zugegeben. Die zuzugebenden Mengen von P2 [Seite 42↓]mit CHAPS wurden, wie in Tab. 2 beschrieben, berechnet. Nach dem Mörsern wurde der entstandene Puder mit einem Spatel in ein Ultrazentrifugenröhren überführt wo sich bereits ein kleiner Magnetrührfisch befand. Es wurde darauf geachtet, dass kein Puder im Mörser zurückblieb. Nun wurde, nach dem Auftauen bei 4 °C, die Suspension bei dieser Temperatur 60 min. lang gerührt, um CHAPS Zeit zu geben, strukturelle Komponenten der Zelle zu zerstören und Membranproteine herauszulösen. Nun wurde Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 9 M zugegeben und die Suspension nochmals 45 min. bei RT gerührt, damit der Harnstoff seine chaotrope Wirkung entfalten konnte. Nach einigen Minuten, wenn der Harnstoff fast vollständig gelöst war, wurde bis auf eine Endkonzentration von 70 mM, DTT zugegeben, um Disulfitbrücken in den herausgelösten Proteinen aufzubrechen. Nach dem Rühren wurde der Magnetrührfisch möglichst ohne Probenverlust entfernt und die Suspension bei 17 °C, 30 min lang, bei 226.0000 g zentrifugiert (Tab. 2). Danach wurde der Überstand vollständig entfernt und in ein vorher beschriftetes und gewogenes NUNC® Röhrchen verbracht. Nun wurde der Überstand mit 2 % (v/v) Servalyte 2-4 (Endkonzentrationen in der Probe!) versetzt. Der Überstand war nun zum Auftrag auf die IEF bereit. Das Pellet wurde im Zentrifugenröhrchen eingefroren, danach aus dem Röhrchen entfernt und bei – 80 °C gelagert.

4.3.2.3 Kernfraktion

Das Pellet, welches nach der Fraktionierung der Membranproteine übriggeblieben war, wurde nun zusammen mit Puffer 3 (P3), wie unter 4.3.2.1 beschrieben, gemörsert. P3 besteht aus 50 mM TRIZMA®Base und 0,49 g/l MgSO4 x 7 H2O (Ferak, Berlin, Deutschland) in bidestilliertem Wasser. Der pH-Wert des Puffers wurde mit 1 M HCl (Merck, Darmstadt, Deutschland) auf 8,0 bei Raumtemperatur korrigiert. Das benötigte P3 Volumen wurde nach Tab. 2 bestimmt. Der Puder wurde nun mit einem Spatel, ohne Materialverlust, in ein Zentrifugenröhrchen mit kleinem Rührfisch überführt. Nun wurde der Puder bei 4 °C aufgetaut, Benzonase nach Maßgabe des Herstellers (Merck, Darmstadt, Deutschland) zugegeben und 30 min. lang bei 4 °C gerührt, damit die Benzonase die DNA verdauen und so die daran assoziierten Proteine freisetzen konnte. Nun wurde Harnstoff für eine Endkonzentration von 9 M in der Probe zugegeben und die Suspension bei RT weitere 30 min. gerührt. Die sofortige Harnstoffzugabe würde die Benzonase denaturieren und ihre Aktivität inhibieren. Während des Rührens, nachdem Teile des Harnstoffs gelöst waren, wurden 70 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 % (v/v) Servalyte 2,0 – 4,0 [Seite 43↓](Endkonzentrationen in der Probe!) zugegeben. Nun konnte die Suspension auf die IEF aufgetragen oder eingefroren und bei –80 °C gelagert werden.

4.3.2.4 Körperflüssigkeiten

Blutproben wurden mit Servalyte pH 2,0 - 4,0 , 9 M Harnstoff und 70 mM DTT versetzt, 1 : 4 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt und danach auf die 1D Gele aufgetragen. Urinproben wurden nach der gleichen Verfahrensweise, aber unverdünnt, aufgetragen [88].

4.4 Großgel 2D-Elektrophorese

Proteine wurden durch hochauflösende, Großgel 2D-Elektrophorese aufgetrennt, eine Technik, die in unserem Labor entwickelt und erst kürzlich detailliert beschrieben wurde [89, 90]. Obwohl die „Lauf zu Lauf“-Unterschiede mit dieser Technik sehr gering sind, wurden durch zufällige Auswahl aus einem Pool von Proben von Mäusen des gleichen Gewebes, genetischen Hintergrunds, Geschlechts und Alters, Paare, bestehend aus jeweils einem R6/2 und einem Kontrollgewebe, gebildet, sogenannte Probenpaare. Beim Menschen wurde auf die Verwendung von Gewebe aus der gleichen Gehirnregion geachtet, dass sich im Alter möglichst wenig unterschied. Alle Probenpaare hatten das gleiche Geschlecht. Die genetische Heterogenität innerhalb der Spezies Mensch konnte nicht ausgeglichen werden. Probenpaare wurden nun immer parallel beiden Elektrophoreseprozeduren unterzogen. Die erste Dimension (1D), die IEF, basiert auf der „Carrier Ampholyte Technik“, bei welcher der pH-Gradient während des Laufs erzeugt wird. Die Trennstrecke betrug 40 cm. Bei der Herstellung von 2D Gelen für die Spotdetektion oder Identifikation hatten die 1D Gele einen Durchmesser von 0,9 mm oder 1,5 mm und ein Probenvolumen von 6 µl - 10 µl (Tab. 2) oder 50 µl. Nach Beendigung des 1D Laufes wurden die 1D Gele halbiert und jede Hälfte separat zusammen mit der passenden Hälfte (niedriger oder hoher pH-Bereich) des Probenpaares der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) als zweiter Dimension unterzogen. Der pI-Wert wurde, wie vor kurzem im Detail an anderer Stelle beschrieben, bestimmt [90]. Das 1D Gel (mit Probe) wurde nach dem Lauf entlang der Trennstrecke in 80, 0,5 cm lange, Stücke zerschnitten. Die Gelstücke wurden danach einzeln in 1,5 ml Eppendorfgefäßes gefüllt mit 40 µl bidestilliertem Wasser, welches durch Kochen und Vakuum entgast wurde, verbracht. Während des gesamten Prozesses wurden die Eppendorfgefäße unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Die dicht verschlossenen [Seite 44↓]Gefäße mit den Gelstückchen wurden nun 15 min. lang in Eiswasser mit Ultraschall behandelt. Der pH für jedes zweite Segment wurde mit Hilfe einer Mikro-pH-Elektrode gemessen. Der komplette Gradient wurde bestimmt indem die einzelnen Messungen in ein pH-Profil über die Trennstrecke zusammengesetzt wurden. Der pI für bekannte Proteinspots wurde nun identifiziert, indem die 1D Trennstrecken mit dem pH-Profil verglichen wurden. Diese Proteine wurden als Referenzpunkte verwendet um pI-Werte von unbekannten Spots in weiteren 2D Läufen zu bestimmen. Das Molekulargewicht wurde durch die relative Mobilität im Vergleich zu Markerproteinen in der zweiten Dimension bestimmt. Die Trenndistanz bei der 2D beträgt 28 cm. Um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen wurden, wenn möglich, identische 1D und 2D Kammern und die dazu gehörigen Spannungsgeräte für alle Läufe verwendet.

4.4.1 Die erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Bei der isoelektrischen Fokussierung werden Proteine nach ihrem Isoelektrischen Punkt (pI), bei dem ihre Nettoladung gleich null ist, aufgetrennt.

4.4.1.1 Reinigung der 1D Gelröhrchen

Zur Herstellung eines Gels werden zylindrische Glasröhrchen (Schott Glas, Mainz, Deutschland) mit einer durchgängigen zentralen Bohrung mit einem Innendurchmesser von 0,9 mm (analytische Gele, Spotdetektion) und 1,5 mm (präparative Gele, Spotidentifizierung) und einer Länge von 44,8 cm verwendet (Abb. 3). Grosse Sorgfalt wurde darauf verwendet, sicherzustellen, dass die Gelröhrchen vor dem Lauf absolut sauber waren, um so eine gleichmäßige Anhaftung des Gels an das Glas zu gewährleisten und um Kontaminationen durch Fremdprotein zu vermeiden. Die Reinigung erfolgte durch das Einweichen der Glasröhrchen in erhitzter (50 °C) 6 % (v/v) Deconex®-12-Lösung (Borer Chemie, Zuchwil, Schweiz). Danach wurden sie auf 90 °C in einer 0,1 M HCl (Merck, Darmstadt, Deutschland) Lösung erhitzt. Abschließend wurden die Röhrchen vorsichtig mit deionisiertem Wasser gespült und unter Verwendung von Druckluft getrocknet.

4.4.1.2 Herstellung der 1D Gele

Fünf Glasröhrchen wurden senkrecht in einen Gelröhrchenständer eingespannt und mit Nylonziehfäden (Angelschnur; Ertner super, 0,70 mm, 100 m, Deutschland), welche [Seite 45↓]absolut dicht mit den Bohrungen abschließen, versehen. Zur Herstellung der Dichtigkeit wurden die Nylonziehfäden über einer Flamme leicht angesengt und sofort durch ein 0,9 mm 1D Röhrchen gezogen. Das untere Ende jedes Röhrchens wurde in eine Giesschiene gestellt. Die Nylonfäden wurden soweit nach unten gedrückt, dass sie genauso wie die Gelröhrchen an die Gießschiene anstießen. Nun wurde mit Hilfe der Fäden bidestilliertes Wasser in die Röhrchen aufgezogen. Das Trenngel und das Capgel wurden in einem auf 30 °C erhitzen Wasserbad 30 min. lang inkubiert bis der Harnstoff in beiden Gellösungen vollständig gelöst war. Danach wurden beide Gellösungen 5 min. lang mit einer Wasserstrahlpumpe entgast. Das Entgasen vermeidet die Blasenbildung während des Gelgießens und stellt eine reproduzierbare Polymerisierungsgeschwindigkeit sicher. Nun wurde das Wasser aus den Glasröhrchen entfernt, die Röhrchen durch Druckluft getrocknet und die Nylonziehfäden wieder einsetzt und nach unten gedrückt bis sie an die Gießschiene anstoßen. Für fünf Gele mit 0,9 mm Bohrungsdurchmesser wurden 50 µl einer 0,8 % (w/v) Ammoniumpersulfat (APS, Biorad, Hercules, CA, USA) Lösung zu 1.950 µl des Separationsgels (Herstellung siehe Tab. 3) zugegeben und die Lösung danach sanft mit einem dünnen Glasstäbchen gerührt.

Tab. 3: Chemische Zusammensetzung des Separationsgels

Komponente

Stammlösung

Lösung

Endkonzentration

Acrylamid[a]

3,5 g

10 ml

3,5 % (w/v)

PDA

0,3 g in 20 ml

 

0,3 % (w/v)

Carrier Ampholyt Mix[b]

 

5 ml

4 % (v/v)

Harnstoff

 

27 g

54 % (w/v) = 9 M

Glyzerin

14,3 g in 50 ml

8,75 ml

5 % (w/v)

TEMED

60 µl

5 ml

0,06 % (v/v)

Persulfat

0,08 g in 10 ml

[b]50 µl

0,02 % (w/v)

[a]Acrylamid, PDA (Piperazine Diacrylamide), TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin, N,N,N',N'-Di-(dimethylamino)ethan oder N,N,N',N'-Tetramethyl-1-,2-diaminomethane (alles Synonyme)) (Biorad, Hercules, CA, USA) Zur Herstellung der Gellösung wurde Harnstoff höchstmöglicher Reinheit verwendet; [b]Der Carrier Ampholyt Mix besteht aus einem Teil Servalyte pH 2,0 – 11 (Serva, Heidelberg, Deutschland), einem Teil Pharmalyte pH 3,5 – 10, 3 Teilen Pharmalyte pH 4,0 – 6,5, 2 Teilen Pharmalyte pH 5,0 bis 8,0 und einem Teil Pharmalyte pH 6,5 – 9,0 (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland). Alle Lösungen wurden unter Verwendung von bidestilliertem Wasser hergestellt. Das Endvolumen der Gellösung betrug 48,75 ml; jedes Aliquot enthielt 1.950 µl. [b]Die Zugabe erfolgte zu einem 1.950 µl Aliquot des Trenngels.

Ohne große Verzögerung wurde die Lösung in die Giesschiene gefüllt. Nun wurden die Nylonfäden 40 cm nach oben gezogen. Es musste hierbei gewährleistet sein, dass die Separationsgellösung ohne Luftblasenbildung mit nach oben gezogen wurde. Anschließend wurde die Giesschiene mit der restlichen Gellösung entfernt und eine neue Schiene eingesetzt. Danach wurden 20 µl APS Lösung zu 780 µl Capgellösung zugegeben und [Seite 46↓]verrührt, sodann ohne Verzögerung in die Giesschiene gegossen. Nun wurde das Capgel unterhalb des Separationsgels 0,8 cm nach oben gezogen. Es durften unter keinen Umständen Luftblasen zwischen Trenn- und Capgel entstehen. Die Giesschiene wurde sodann entfernt und die verbliebene Gellösung am Röhrchenende vorsichtig mit Kimwipes® luftblasenfrei entfernt. Die Gellösungen im Röhrchen wurden jetzt weitere 0,5 cm nach oben gezogen, sodass eine kleiner Luftspalt am unteren Ende des Röhrchens entstand. Nun wurde das 1D Gel 25 min. zum Polymerisieren bei Raumtemperatur (RT) stehen gelassen bevor die Nylonfäden entfernt werden konnten. Die Gele wurden mindestens 3 Tage, besser 5 Tage im voraus hergestellt um ihnen genug Zeit zu geben vor dem 1D Lauf vollständig auszupolymerisieren. Um eine Dehydrierung der Gele während dieser Zeit zu verhindern, wurde eine Tropfen bidestilliertes Wasser in jede der beiden Öffnungen eines Röhrchens gegeben und danach die Enden dicht mit Parafilm M® (Pechiney Plastic Packaging, Neenah, WI, USA) verschlossen. Die chemischen Zusammensetzungen des Separations- und Capgels werden in Tab. 3 und 4 gezeigt. Bei 1D Röhrchen mit 1,5 mm Durchmesser wurden für 4 Röhrchen die doppelten Mengen an Separations- und Capgel wie für die fünf 0,9 mm 1D Röhrchen eingesetzt.

Tab. 4: Chemische Zusammensetzung des Capgels

Komponente

Stammlösung

Lösung

Endkonzentration

Acrylamid

6,0 g

4,4 ml

12 % (w/v)

PDA

0,065 g in 10 ml

 

0,13 % (w/v)

[a]Carrier Ampholyt Mix

 

2,2 ml

4 % (v/v)

Harnstoff

 

11,88 g

54 % (w/v) = 9 M

Glyzerin

14,3 g in 50 ml

3,85 ml

5 % (w/v)

TEMED

60 µl

2,2 ml

0,06 % (v/v)

Persulfat

0,08 g in 10 ml

[b]20 µl

0,02 % (w/v)

[a]Die Komponenten des Carrier Ampholyt Mixes sind in der Legende zu Tab. 3 genau beschrieben. Alle Lösungen wurden unter Verwendung von bidestilliertem Wasser hergestellt. Das Endvolumen der Gellösung betrug 21,45 ml; jedes Aliquot enthielt 780 µl. [b]Die Zugabe erfolgte zu einem 780 µl Aliquot des Capgels.

4.4.1.3 Probenauftrag und IEF Lauf

Für die erste Dimension der Elektrophorese wurden meist fünf Gelröhrchen in die IEF Elektrophoresekammer (Wita, Berlin, Deutschland) mit dem Capgel nach unten eingespannt (Abb. 3A, 1D Kammer). Hierbei dienten vier der Aufnahme der Proben für zwei Probenpaare (2 HD und 2 Kontrollen) und das fünfte Röhrchen diente als Ersatz für den eventuell fehlgeschlagen Probenauftrag in einem der anderen Röhrchen. Die Gelröhrchen wurden durch eine Gummidichtung frei beweglich in Bohrungen gehalten, die [Seite 47↓]sich im Boden der oberen Kammer (Anodenkammer) befinden. Es wird so vermieden, dass diese durch zu starres Einspannen brechen oder am Boden der 1D Kammer anstoßen. Die nicht verwendeten Löcher (insgesamt acht, deswegen meist drei) wurden mit passenden
Abb. 3: Großgel 2D Elektrophorese: Erste und zweite Dimension

A: Schema der 1D und 2D Kammer mit den IEF und SDS PAGE Gelen, gezeigt während des jeweiligen Laufs: 1. Probe auf IEF Gel; 2. IEF Gel; 3. Glasröhrchen für die 1D; 4. Kammer für die erste Dimension (IEF); 5. Kammer für die 2D (SDS-PAGE); 6. IEF Gel aus der ersten Dimension auf dem SDS-PAGE Gel der 2D; 7. Spacer der zweiten Dimension (0,75 mm oder 1,0 mm dick); 8. Jeweils 2 Gele pro 2D Kammer. B: Auflegen von IEF Gel auf SDS-PAGE Gel: 9. Probe; 10. Sephadexschutzschicht; 11. IEF Gel; 12. IEF Gel liegt auf SDS PAGE Gel auf. Die Plastikklammern, welche die SDS-PAGE Gele zusammenhalten werden in A + B nicht gezeigt.

Glasstopfen verschlossen. Die untere Kammer (Kathodenkammer) wurde mit 400 ml Ethylendiaminlösung (5 % (v/v) Ethylendiamine (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, [Seite 48↓]Deutschland), 9 M Harnstoff (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 5 % (w/v) Glyzerin in bidestilliertem Wasser) befüllt (Abb. 3A, 1D Kammer unten). Im Gegensatz zu den IEF Gellösungen wurde für die Laufpuffer, aufgrund der großen verwendeten Mengen, Harnstoff einer geringeren, aber immer noch sehr hohen, Reinheit verwendet. Die Ethylendiaminlösung wurde auch dazu verwendet, die 0,5 cm langen Aussparungen vor dem Capgel in den 1D Röhrchen luftblasenfrei zu befüllen (Abb. 3A, 1D Kammer Röhrchen unten). Nun wurden die Röhrchen in die Lösung eingetaucht. Ein zwischen die Anoden- und Kathodenkammer eingesetzter, röhrenförmiger Abstandhalter gewährleistete eine konstante Entfernung zwischen diesen (Abb. 3A). Anschließend wurde das obere Ende der Gelröhrchen mit sehr schmalen (< 0,9 mm breit) Filterpapierstreifchen trockengetupft. Eine nun aufgetragene, ca. 2 mm breite Sephadexlage (Abb. 3B, Schicht unterhalb der Proteinprobe (9)), bildete eine Schutzschicht für das nun trockene 1D Gel. Die zähflüssige Masse enthielt Sephadex-G-200 Superfine (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland), welches in bidestilliertem Wasser fünf Stunden lang bei 90 °C quellen gelassen wurde. Dann wurde mit einer Lösung aus 25 % (w/v) Glyzerin gewaschen und das Sephadex schließlich mit 9 M Harnstoff, 70 mM DTT und 2 % (v/v) Carrier-Ampholyt Mix (Zusammensetzung siehe Tab. 3 Legende) vermischt (Alle drei Komponenten wurden im darunterliegenden Trenngel in gleicher Konzentration verwendet). Die Sephadexschicht diente zum Auffangen von Proteinen, die zu Beginn des Laufs präzipitieren oder aggregieren könnten, also zu einem Zeitpunkt, an dem sich diese hochkonzentriert am Anodenende des Gels befanden, und diente somit zur Vermeidung der Verstopfung der Geloberfläche. Die Proteinproben wurden oberhalb der Sephadexschicht mit Hilfe von Hamilton®-Spritzen (10 µl; Hamilton, Bonaduz, Schweiz) appliziert (Abb. 3B (9)). Die aufgetragene Probenmenge war stark vom Gewebe und vom Durchmesser des Gelröhrchens (0,9 mm, Tab.2; 1,5 mm, 50 µl) abhängig. Um die Proben vor der Präzipitation durch den sauren, Anodenpuffer zu schützen, wurden die Proben mit einer ca. 0,5 cm dicken Schicht Schutzlösung versehen (Abb. 3B, Raum oberhalb der Probe (9)). Zur Herstellung der Schutzlösung dienten 6 g Harnstoff und 1 g Glyzerin, welche in 19 ml bidestilliertem Wasser gelöst wurden. Von dieser Lösung wurden 7,6 ml mit 0,4 ml Servalyte, pH 2,0 – 4,0 gemischt und die nun fertige Schutzlösung in 50 µl Portionen aliquotiert und bei – 80 °C bis zum Gebrauch gelagert. Die restlichen 2,7 cm des 1D Röhrchens wurden jetzt luftblasenfrei mit oberen Anodenpuffer befüllt. Dieser besteht aus 7,27 % (v/v) Phosphorsäure (ortho-Phosphorsäure 85 %; Merck, Darmstadt, Deutschland) [Seite 49↓]und 3 M Harnstoff in bidestilliertem Wasser. Das benötigte Volumen betrug 500 ml. Mit dem restlichen Laufpuffer wurde nun die Anodenkammer befüllt (Abb. 3A; 1D, oberste Kammer). Das Verbinden der oberen Kammer mit der Anode und der unteren Kammer mit der Kathode des Spannungsgerät startete die IEF. Das Spannungsgerät (EPS 3500XL; Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurde auf eine schrittweise, stufenförmige Spannungszunahme programmiert bis zu einer Gesamtfokussierungszeit bei RT von 25 h und 40 min. . Die Elektrophoresebedingungen setzten sich im Einzelnen wie folgt zusammen: 1 h bei 100 V, 1 h bei 300 V, 23 h bei 1.000V, 30 min. bei 1.500 V und 10 min. bei 2.000 V. Mit den Stromstärke- und Leistungsregulatoren des Spannungsgeräts wurden die Maximalwerte von 10 mA bzw. 10 W festgelegt. Zur Vorbereitung auf die Äquilibrierung des IEF Gels nach dem Lauf, wurde der Äquilibrierungspuffer bei 30 °C 30 min. lang aufgetaut und auf acht Petrischalen (100 mm x 20 mm; Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) (20 ml/Schale) kurz vor dem Abbruch des IEF Laufes verteilt. Der Äquilibrierungspuffer enthält 125 mM TRIZMA®Hydrochlorid (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland), 40 % (w/v) Glyzerin, 3 % (w/v) SDS (99 % Reinheit; Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) und 5 % (w/v) DTT. Nach der Elektrophorese wurde die Gellänge abgemessen und die halbe Gellänge auf den Röhrchen vermerkt. Die Markierung erfolgte gegenüber dem Ende, von dem das Gel mit einer dicht abschließenden Nylonschnur in die vorbereiteten Petrischalen ausgestoßen wurde. Sobald die Nylonschnur an der Markierung angekommen war, wurde das Gel am Röhrchenende mit einer scharfen Pinzette abgeschnitten. Abhängig davon, ob von der kathodischen oder anodischen Seite ausgestoßen wurde, war dies entweder die saure (pH 3,5 – 6,0) oder basische Seite (pH 6,0 – 9,5) des Gels. Die im Röhrchen verbleibende Seite wurde in die nächste Petrischale ausgestoßen. Die Gele wurden genau 10 min. (0,9 mm Bohrungsdurchmesser im Röhrchen) oder 15 min. (1,5 mm Bohrungsdurchmesser im 1D Röhrchen) unter sanftem Schütteln inkubiert. Eine längere Inkubationszeit hätte unweigerlich zu einem Verlust von immer mehr Protein aus dem 1D Gel geführt, besonders von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht. Die wichtigste Funktion der Äquilibrierung ist, so viel wie möglich proteinassoziierten Harnstoff durch SDS zu ersetzen. Die angegebenen Inkubationszeiten sind empirisch gefundene, gute Kompromisse zwischen diesen beiden gegenläufigen Anforderungen. Exakt nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Gelhälften in eine Glaspipette mit 0,9 mm bzw. 1,5 mm aufgesaugt und in die Vertiefungen von Gelvorratsleisten gelegt. Die Gele wurden nun mindestens über Nacht bei – 80 °C gelagert.


[Seite 50↓]

4.4.2  Die zweite Dimension: Großgel SDS-PAGE

Bei der Großgel SDS-PAGE wurden Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Das Masse der Proteine in der Probe wurde mit Hilfe von Markerproteinen bekannten Molekulargewichts bestimmt, welche zusammen mit der eigentlichen Probe aufgetrennt wurden.

4.4.2.1 Gießen der Separationsgele

Wie bei den IEF-Gelen wurde sorgfältig darauf geachtet, dass die für die Gelkammern verwendeten Glasplatten in sehr sauberem Zustand waren, um eine gute Anhaftung des Gels auf der gesamten Glasoberfläche zu gewährleisten. Vor dem Gebrauch wurden die Glasplatten sorgfältig mit destillierten Wasser gespült und mit in 70 % (v/v) Ethanol (Herbeta-Arzneimittel, Berlin, Deutschland) getauchten Kimwipes® abgerieben. Die 2D Gele wurden einen Tag vor ihrem Gebrauch bereitgestellt. Die Standartgröße der Gele betrug 28 cm (Trennlänge) x 23,2 cm (Breite) x 0,75 mm (Geldicke für analytische Gele). Eine Geldicke von 1,0 mm wurde nur für präparative Gele zur Spotidentifizierung mit Hilfe der Massenspektrometrie verwendet. Zwei Behälter mit Gellösung (je 67,5 ml für 0,75 mm Plastikabstandhalter; Zusammensetzung siehe Tab. 5) wurden 30 min. lang bei 40 °C in einem Wasserbad aufgetaut. In der Zwischenzeit wurden die Kammern für die 2D zusammengebaut. Die Gießform bestand aus zwei zuvor gereinigten Glasplatten und zwei Plastikabstandhaltern (Abb. 3A (7)). Die Abstandhalter sorgten dafür, dass die Glasplatten in einem festgelegten Abstand voneinander gehalten wurden. Sie mussten über ihre gesamte Länge gleichmäßig dick sein, damit sie guten Kontakt zu den Glasplatten hatten und die entstehenden Gele gleichmäßig dick waren. Die Abstandhalter waren 0,9 cm breit und 30 cm lang. Die breite Seite wurde vor dem Zusammenbau mit einer geringen Menge Silikonpaste (GE Bayer Silicones, Baysilone Paste; Bayer, Leverkusen, Deutschland) dünn bestrichen um die Dichtigkeit der Gelkammer zu gewährleisten. Die Glasplatten wurden mit Plastikklammern aus einem Stück zusammengehalten, welche an den Längsseiten (Trennstrecke) der Gelkammer angebracht wurden. Das untere Ende der Gießform wurde durch die Verwendung eines Systems verschlossen, welches die Gießform gegen eine Gummidichtung auf einem Gießständer presst. Es wurde nun mit einer Wasserwaage sichergestellt, dass der Gießständer waagrecht aufgestellt war, damit die Gele eine Auftragsfläche, die rechtwinklig zur Trennstrecke verläuft, besitzen würden. Zu 67,5 ml Gellösung wurden 4,5 ml einer 1,28 % (w/v) APS Lösung zugegeben und beide [Seite 51↓]Komponenten unter leichtem Schwenken gut gemixt. Danach wurde die Gellösung, möglichst ohne Luftblasenbildung, zügig von oben in die Gießform gegossen. Kleine Luftblasen, welche so gut wie immer entstehen, wurden mit Hilfe eines langen, dünnen Edelstahldrahtes entfernt. Ohne große Verzögerung erfolgte eine Unterschichtung des Gels mit 1,2 ml (analytische Gele) oder 2,4 ml (präparative Gele) einer 40 % (w/v) Glyzerinlösung. Dies wurde vorsichtig ausgeführt um einer Vermischung mit der Gellösung zu vermeiden. Bei einer Vermischung würde eine nicht klar definierte Grenzschicht mit geringerer Acrylamidkonzentration entstehen, wodurch die Trennschärfe an dieser Stelle vermindert werden würde. Der durch die Unterschichtung entstehende Spalt dient später als Auftragungsort für das 1D Gel (Abb. 3). Zwei 2D Gele wurden pro Gießständer gegossen. Nach einer Polymerisationszeit von 25 min. wurde die Gelzelle auf den Kopf gestellt. Das Glyzerin wurde abgeschüttet und die Geloberfläche mit Spüllösung (375 mM TRIZMA®Hydroclorid, 0,1 % (w/v) SDS) gereinigt und überschichtet. Nun wurde der ca. 0,5 cm hohe Spalt mit Parafilm M® versiegelt und die Gele 1 h bei RT polymerisiert. Nach nochmaliger Spülung und Überschichtung der Geloberfläche erfolgte eine Abdichtung mit Parafilm M® und eine Lagerung im Gießständer über Nacht bei 4°C zur weiteren Polymerisation.

Tab. 5: Chemische Zusammensetzung von SDS-PAGE Gelen

Komponente

Stammlösung

Lösung

Endkonzentration

Acrylamid 4x

498 g +

 

15 % (w/v)

Bisacrylamid[a]

6,64 g in 1.660 ml

1.660 ml

0,2 % (w/v)

TEMED

960 µl +

 

0,03 % (v/v)

SDS

3,2 g +

 

0,1 % (w/v)

TRIZMA®Base

110,408 g +

 

375 mM

TRIZMA®Hydrochlorid

45,44 g in 1.400 ml

1.400 ml

375 mM

Persulfat

6,4 g in 500 ml

4,5 ml

0,08 % (w/v)

[a] Acrylamid 4x und Bisacrylamid (Serva, Heidelberg, Deutschland). Aliquots von 67,5 ml wurden aus der hergestellten Gellösung abgefüllt und bei –20 °C gelagert. Kurz vor dem Gießen des SDS Gels wurden 4,5 ml der Persulfatlösung zugegeben um die Gelpolimerisation zu starten. Für die Herstellung aller Lösungen wurde bidestilliertes Wasser verwendet. Das Endvolumen der Gellösung betrug 3.000 ml. Vor dem Aliquotieren wurde die fertige Lösung 1 h mit dem Ionenaustauscher Amberlite® IRN-150 (18 g/l; Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) behandelt, um unvernetzte Acrylamidmonomere zu entfernen.

4.4.2.2 SDS-PAGE Lauf

Elf Liter Elektrophoresepuffer wurden frisch hergestellt und in das untere Pufferreservoir (die Anodenkammer) der 2D Gelelektrophorese Einheit gefüllt (Abb. 3A) und auf 15 °C vorgekühlt. Der Puffer enthielt 25 mM TRIZMA®Base, 192 mM Glyzine (Serva [Seite 52↓]Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland) und 0,1 % (w/v) SDS in vollentionisiertem Wasser. Der gemessene pH Wert beträgt im allgemeinen 8,7 bei 16 °C und 8,55 bei 29 °C (RT während des Laufs). Um den pH-Wert konstant bei 8,7 zu halten, war eine Kühlung also unbedingt erforderlich. Für die obere Kathodenkammer (Abb. 3A; 2D obere Kammer) wurden 1,5 l eines Puffers der gleichen Zusammensetzung, jedoch mit bidestilliertem Wasser hergestellt und mit 500 µl Bromphenolblaumarker gemischt (50 mg Bromphenolblau (Biorad, Hercules, CA, USA) in 150 ml bidestilliertem Wasser gelöst). Da dieser Puffer durch das SDS-PAGE Gel wandert ist hier besonders auf Reinheit der Komponenten zu achten. Die während des Laufs im Gel entstehende Bromphenolblaubande befand sich kurz hinter der Lauffront und diente zur Bestimmung des Endpunktes des Laufs. Die Oberflächen der beiden SDS-PAGE Gele wurden zur Vorbereitung für den Lauf von der Spüllösung befreit und nochmals mit Spüllösung gereinigt. Anschließend wurde die Spüllösung vollständig entfernt. Das SDS-PAGE Gel war nun bereit, das IEF Gel aus der ersten Dimension aufzunehmen. Zwei IEF Gelhälften (saure Seite HD und Kontrolle bzw. basische Seite HD und Kontrolle) wurden aus der Tiefkühltruhe (- 80 °C) genommen und von der Lagerungsschiene auf je ein SDS-PAGE Gel zwischen die Glasplatten transferiert (Abb. 3A oben und B). Hierbei wurde mit dem Auftragen des Gels von einer Seite begonnen und das IEF Gel nach und nach mit Hilfe eines gebogenen Drahts vorsichtig und luftblasenfrei auf SDS-PAGE Gel gelegt. Luftblasen verhindern den Transfer der Proteine vom IEF in das SDS-PAGE Gel. Der Transfer geschah ohne dass das 1D Gel dabei gestaucht oder gestreckt wurde. Nun wurden die Gele mit Agaroselösung luftblasenfrei überschichtet (125 mM TRIZMA®Hydroclorid; 0,1 % (w/v) SDS; 1% (w/v) Agarose (Biorad, Hercules, CA, Deutschland)) um ein „Aufschwimmen“ der 1D Gele während der Pufferzugabe in die obere Kammer zu verhindern. Jedes Probenpaar wurde zusammen an einem Tag bearbeitet, sodass zwei Laufkammern, bestehend aus je zwei Gelen, die zusammen in die Kammer (Desaphor VA300, Desaga, Deutschland) getaucht wurden, benutzt wurden. Nun wurde der obere Laufpuffer in die Kathodenkammer (Abb. 3A; obere Kammer der 2D) gegossen. Es wurde sichergestellt, dass eine luftblasenfreie Verbindung zwischen der das IEF Gel bedeckenden Agaroseschicht und dem Kathodenpuffer bestand. Die 2D Kammer wurde nun mit dem Spannungsgerät verbunden (EPS 3500XL, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) und die Anfangsstromstärke auf 65 mA für analytische 1D Gele mit 0,9 mm Innendurchmesser (130 mA für präparative 1D Gele mit 1,5 mm Innendurchmesser) [Seite 53↓]festgelegt. Nach 15 Minuten wurde die Stromstärke in einem Schritt stufenförmig auf 95 mA (150 mA für präparative Gele) verstärkt und für den Rest der Laufzeit konstant gehalten. Die anfängliche, niedrigere Stromstärke diente zum vorsichtigen Transfer der Proteine vom IEF- in das SDS-PAGE-Gel. Die Puffertemperatur wurde während des Laufs konstant auf ungefähr 15 °C gehalten. Nachdem die Bromphenolblaubande eine Markierung erreicht hatte, welche sich 2 cm oberhalb der unteren Kante der Glasplatten der 2D Gele befand. wurde der Lauf abgebrochen. Sofort nach dem Lauf wurden die Gele aus der Kammer entfernt, indem die Klammern abgenommen und die Glasplatten mit einem halbkeilförmigen Spatel auseinandergedrückt wurden. Die Diffusion von Proteinen im Gel, welche die Trennschärfe der Spots negative beeinflussen würde, setzte sich nach Abbruch des Laufes fort, sodass die Proteine sofort nach dem Lauf fixiert werden mussten. Die Fixierung der analytischen Gele zur Silberfärbung verlief über Nacht in 50 % (v/v) Ethanol, 10 % (v/v) Essigsäure (Merck, Darmstadt, Deutschland) und bidestilliertem Wasser. Präparative Gele wurden über den gleichen Zeitraum in 50 % (v/v) Methanol (J. T. Baker, Deventer, Holland) und 2 % (v/v) Phosphorsäure fixiert. Für eine Gelhälfte wurde ein Liter Fixierer verwendet. Jeweils 2 Gele wurden in einer Plastikwanne fixiert. Die Fixierung immobilisiert im günstigsten Fall die Proteine, sie sorgte jedoch zumindest dafür, dass deren Diffusion im Gel zu einem sehr großen Teil reduziert wurde. Die Glasplatten wurden vom randständigen Silikon mit 100 % (v/v) Ethanol befreit und danach mit Scheuermilch (Rilan; Henkel Ecolab; Düsseldorf, Deutschland) abgerieben um die Gelreste zu entfernen. Nun wurden die Platten mit deionisiertem Wasser gespült. Zur Regeneration wurden die Glasplatten in 0,2 % (w/v) NaOH (Merck, Darmstadt, Deutschland) untergetaucht. Am nächsten Tag erfolgte eine erneute Reinigung der Platten mit Scheuersand. Nach dem Spülen mit deionisiertem Wasser trockneten die Glasplatten in einem geeigneten Ständer und waren bereit für den nächsten Lauf. Die Abstandhalter wurden mit Kimwipes® abgewischt und mit 96 % (v/v) Ethanol vom restlichen Silikon befreit.

4.5 Anfärbung der Proteine

Um Proteine in SDS-PAGE Gelen anzufärben wurden zwei verschiedene Färbemethoden verwendet, eine saure Silberfärbung und die Anfärbung mit Hilfe des Farbstoffes Coomassie Brillant Blue G250. Für die Sichtbarmachung möglichst vieler Proteine im Gel wurde die Silberfärbung verwendet, da diese Methode die höchste Empfindlichkeit zum [Seite 54↓]Proteinnachweis besitzt, die für diese Art der Anwendung zur Verfügung steht. Dieser Vorteil wiegt die mangelnde Linearität der Färbung und die proteinidentifizierungshemmende Quervernetzung der Proteine durch Glutaraldehyd bei weitem auf. Gele zur Proteinidentifikation mit Hilfe der Massenspektrometrie wurden mit Coomassie Brillant Blue G250 gefärbt.

4.5.1 Saure Silberfärbung zur Spoterkennung

Proteinspots wurden durch saure Silberfärbung zur Beurteilung der differentiellen Expression sichtbar gemacht. Diese Methode ist ausführlich und detailliert an anderer Stelle beschrieben worden und wurde in dieser Arbeit leicht modifiziert durchgeführt [89, 91, 92]. Nach der Fixierung über Nacht waren Substanzen, die die Färbung negativ beeinflussen könnten, wie z. B. SDS oder Glyzine, weitgehend entfernt worden. Alle nun folgenden Arbeitsschritte wurden mit Gelen ausgeführt, die sich horizontal liegend einzeln in Plastikwannen befanden. Für eine hohe Effizienz aller Schritte war die schnelle und gute Benetzung der Gele mit den Färbelösungen notwendig. Aus diesem Grund wurden die Färbewannen auf einen sich mit hoher Geschwindigkeit bewegenden Schüttler positioniert. Es war darauf zu achten, dass das Gel nicht an die Färbewanne ankleben würde, da dieses sonst durch das Schütteln beschädigt werden könnte. Der schnelle Wechsel der Lösungen wurde durch Wannentausch der Gele gewährleistet. Die 2D Gele wurden aus dem Fixierer genommen und einzeln in einem Liter Inkubationslösung pro Gelhälfte und Wanne für eine Stunde quellen gelassen. Die Inkubationslösung bestand aus 30 % (v/v) Ethanol, 0,5 % (v/v) Glutaraldehyd (Glutaraldehydlösung 25 %, Darmstadt, Deutschland), 4,1 % (w/v) Natriumazetat (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 0,2 % (w/v) Natriumthiosulfat (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland). Die Gele wurden anschließend zweimal 20 min. lang in 2 l bidestilliertem Wasser pro Gel gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation in 1 l Silbernitratlösung (0,1 % (w/v) Silbernitrat (Merck, Darmstadt, Deutschland), 0,01 % (v/v) Formaldehyd (Formaldehydlösung min. 37 % Merck, Darmstadt, Deutschland)) für 30 min. Anschließend wurden die Gele kurz mit 1 l bidestilliertem Wasser gewaschen und danach 45 s in 1 l Vorentwickler (2,5 % (w/v) Natriumcarbonat (Merck, Darmstadt, Deutschland)) entwickelt. Die eigentliche Entwicklung erfolgte in 2,5 % (w/v) Natriumcarbonat und 0,01 (w/v) Formaldehyd. Die gesamte Entwicklungszeit war stark von der Menge an aufgetragenem Protein und dem verwendeten Gewebe abhängig. Der Färbeprozess wurde durch die Zugabe von Stoplösung [Seite 55↓](0,05 M Titriplex®III (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 0,02 % (w/v) Thimerosal (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) beendet. Es konnten so bei einer Färbung zwischen vier und sechs Gelhälften gefärbt werden. Im verwendeten Silberfärbungsprotokoll wurde Glutaraldehyd verwendet, welches die Proteine unumkehrbar quervernetzt. Aus diesem Grund kann diese Methode nicht für die Proteinidentifikation mit Hilfe der Massenspektrometrie verwendet werden.

4.5.2 Coomassie Brillant Blue G250 Färbung zur Spotidentifizierung

Zur Spotidentifizierung wurde eine Färbung unter Verwendung von Coomassie Brillant Blue (Brillant Blau G250, Roth, Karlsruhe, Deutschland)) benützt, welche für die Verwendung zusammen mit Massenspektrometrie bereits gut etabliert, jedoch weniger empfindlich ist als die saure Silberfärbung. Die Färbung wurde leicht modifiziert nach einem bereits publizierten Protokoll durchgeführt [93, 94]. Die Gele wurden 30 Minuten lang in 1 l bidestilliertem Wasser pro Gel und Wanne gewaschen. Der Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Jeweils zwei Gele wurden nun in zwei Litern 34 % (v/v) Methanol, 2 % (v/v) Phosphorsäure und 17 % (w/v) Ammoniumsulfat (Merck, Darmstadt, Deutschland) in einer Stahlwanne inkubiert. Nach 1 Stunde wurden 0,66 g/l Coomassie Brillant Blue G250 zugegeben. Die Gele wurden 5 Tage lang unter kräftigem Schütteln bei Raumtemperatur gefärbt. Nach dem Ende der Inkubationszeit wurden die Gele einzeln mindestens drei Mal in bidestilliertem Wasser gewaschen um überschüssige Coomassie Farbpartikel und Methanol zu entfernen. Danach wurden die Gele einzeln in Plastikfolie verschweißt und bei 4 °C aufbewahrt oder sofort weiterverarbeitet. Für eine gute Identifizierbarkeit der Spots war es sehr wichtig, diese möglichst schnell auszustechen und bei –80 °C zu konservieren. Aus diesem Grunde erfolgte das Ausstechen mit dem Skalpell, wenn möglich am gleichen, spätestens aber am nächsten Tag nach der Beendigung der Färbung. Die Gelstücke hatten einen Durchmesser von ca. 1,5 mm. Beim Ausstechen war darauf zu achten, dass möglichst dunkel angefärbte Partien des Spots mit hoher Proteinkonzentration ausgewählt wurden.

4.6 Trocknung der 2D Gele

Zur Konservierung der Ergebnisse der analytischen 2D Läufe wurden die silbergefärbten Gele getrocknet. Zu diesem Zweck wurde das silbergefärbte Gel flach auf eine [Seite 56↓]Zellophanfolie (Alba-Einmachhaut, Gehring & Neidweiser GmbH & Co KG, Bielefeld, Deutschland) gelegt, welche zuvor über Nacht in deionisiertem Wasser eingeweicht worden war. Diese wiederum befand sich auf 10 Lagen gut gewässertem Filterpapier (Blotting Papier, 580 mm x 580 mm; Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) und dieses lag luftblasenfrei auf einer gelochten Metallplatte. Das Gel wurde nun noch mit Zellophanfolie bedeckt. Das Filterpapier wurde so zurechtgeschnitten, dass ein mindestens 5 mm breiter Rand gegenüber den Kanten der gelochten Metallplatte frei blieb. Die Folie wurde so zurechtgeschnitten, dass sie mit dem Filterpapier abschloss. Es wurden nun noch verbliebene Luftblasen zwischen allen beschriebenen Schichten mit einem 5 cm breiten halbkeilförmigen Spachtel aus Kunststoff durch Glätten entfernt, sodass das Gel luftblasenfrei zwischen den Folien auf dem Filterpapier lag und überschüssiges Wasser entfernt wurde. Nun wurde das Gel in einen zu diesem Zweck veränderten Trockenschrank (Memmert-Wärmeschrank UL 60; Th. Karow GmbH, Berlin, Deutschland) eingesetzt und mit einer 1 mm dicken Silikonmatte luftdicht abgedeckt, sodass sich ein Vakuum ausbilden konnte. Eine angeschlossene Vakuumpumpe (Jet-1 Automatic; Genser Scientific Instruments, Rothenburg, Deutschland) entfernte das noch verbliebene Wasser und die ca. zweistündige Trocknung bei ca. 80 °C lieferte trockene Gele, welche beschriftet und in großen C3 Umschlägen aufbewahrt wurden. Die Trocknung erfolgte genau solange bis die Gele zwar trocken nicht aber spröde und rissig waren.

4.7 Spoterkennung

Die silbergefärbten 2D Gele wurden visuell bewertet, indem die beiden Gelhälften eines Probenpaares auf einem Leuchtkasten (BIOTEC-FISCHER, Reiskirchen, Deutschland) miteinander verglichen wurden. Veränderungen der Spots wurden anhand folgender Gesichtspunkte in Betracht gezogen: vorhanden/nicht vorhanden, quantitative Veränderung oder Mobilitätsveränderung; die Mobilitätsvariante definiert einen Spot oder Spots, die sich im Gel an eine andere Position „bewegen“ und damit einen Shift des Isoelektrischen Punktes und/oder des Molekulargewichts anzeigen [95].

Durchführung der massenspektrometrischen Arbeiten

Alle massenspektrometrischen Proteinbestimmungen und die dafür notwendigen in den Punkten 4.8 bis 4.11 beschriebenen Arbeiten, wurden von Herrn Dipl. Biochemiker Daniel C. Chamrad, PROT@GEN AG, Emil-Figge-Str. 76 A, 44227 Dortmund, durchgeführt.


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4.8  In-Gel Verdau

Die interessanten Proteinspots wurden herausgeschnitten und abwechselnd dreimal mit 10 µl Verdaupuffer (10 mM NH4HCO3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland)) und 10 µl modifiziertem Verdaupuffer (10 mM NH4HCO3 / Azetonitril (Merck, Darmstadt, Deutschland) 1 : 1) gewaschen. Danach wurden die Gelstücke in 10 µl Azetonitril geschrumpft und in 2 µl Proteaselösung (0,05 µg/ml Trypsin; Promega, Madison, WI, USA) quellen gelassen. Der Verdau fand in einem Zeitraum von 10 bis 12 Stunden bei 37 °C statt. Der gewonnene Überstand wurde in eine saubere Quarzküvette überführt und die Gelstücke wurden noch zwei Mal mit je 5 µl Verdaupuffer extrahiert. Die Überstände wurden gepoolt. Eine von zwei verschiedenen Methoden wurde für die MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) Target Präparation verwendet. Bei der ersten Methode handelt es sich um die konventionelle, „trockene Tropfen“ Technik, mit der Aufkonzentrierung der Probe mit Hilfe von Poros 10 R1 Beads (Perseptive BioSystems, Cambridge, England) [96]. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels, wurden die Proben mit den Poros Beads in 1 µl Matrixlösung (HCCA (α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure; Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland) in Azetonitril / 0,1 % (v/v) TFA 1:1 v/v) aufgenommen und auf ein konventionelles MALDI Target transferiert. Eine weitere Probenaufbereitungsmethode verwendet die AnchorChip® Technologie. AnchorChips® (Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland) sind mit hydrophilen Patches („Anker“) in einer hydrophoben Umgebung ausgestattet, sodass der relativ hydrophile Analyt sich auf den „Ankern“ konzentriert. Ein ein µl Tropfen des gepoolten Überstands wurde auf jeden „Anker“ (386/Target) mit 400 µm Durchmesser appliziert. Nachdem die Tropfen auf die Größe des „Ankers“ geschrumpft waren, wurden 0,5 µl HCCA (0,2 g/l Azetonitril/0,1 % (v/v) TFA (Trifluoressigsäure; Merck, Darmstadt, Deutschland) 1 : 1) zugegeben.

4.9 MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Zur Analyse und Identifikation der tryptischen Peptide wurde MALDI-TOF Massenspektrometrie [97] mit einem Bruker Reflex III Massenspektrometer (Bruker-Daltonik, Bremen, Deutschland) mit einer SCOUT 384 Ionenquelle verwendet. Die Beschleunigungsspannung betrug 25 kV und die Reflektorspannung wurde anfänglich auf 21.6 kV festgesetzt. Die interne Kalibrierung basierte auf tryptischen Peptiden (842,510 Da; 2211.105 Da). „Post Source Decay“ (PSD) Spektren wurde mit einer „Parent“-Ionen [Seite 58↓]Auswahl von ± 30 Da erhalten. Die Reflektionsspannung wurde in 14 Schritten von 21 kV auf 0,65 kV reduziert. Das Zusammenfügen der 14 Einzelspektren basierte auf einer Kalibrierung mit Peptiden aus dem Adrenocorticotrophen Hormon (ACTH). Die Spektren wurden manuell gelabelt. Die Datenaufnahme erfolgte mit einem Sun Ultra Computer unter Zuhilfenahme der XACQ Software, Version 4.0. Die Nachbearbeitung der Daten erfolgte mit Hilfe der XMASS Software.

4.10 Datenbanksuche auf Grundlage der Peptidmassenfingerabdruck-Spektren

Die Peptidmassenfingerabdruck-Spektren wurden unter Zuhilfenahme der nicht-redundanten NCBI Proteindatenbank mit Hilfe von ProFound (http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound, V 4.8.2) analysiert [98].

4.11 Automatische Interpretation der Fragmentionen Spektren:

Zur automatischen Interpretation der Fragmentionenspektren wurde der SEQUEST Algorithmus [99, 100, 101] Version 2 während des Screenens der NCBI Datenbank verwendet.


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10.03.2005