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5  Ergebnisse

Zur Untersuchung der Erkrankung HD wurde das Proteom von Gehirn, Herz, Leber und Testes des Htt Exon 1 transgenen Mausmodells R6/2 und von Kontroll-Mäusen gleichen Geschlechts, Alters und genetischem Hintergrund mit Hilfe der Großgel 2D-Elektrophorese verglichen. Je nach Gewebe wurden vier, acht oder zwölf Gelpaare mit jeweils mehreren tausend Proteinspots pro Gel für jeden untersuchten Zeitpunkt ausgewertet. Die genaue Anzahl der Spots pro 2D-Muster unterschied sich zwischen den verschiedenen Geweben (Leber ca. 9.000, Gehirn ca. 8.000, Herz ca. 5.000 und Testes ca. 10.000). Zur Frage der Relevanz der Ergebnisse für den Menschen wurde das Proteom von drei Gehirnregionen beim Menschen, mit jeweils ca. 4.000 bis 5.000 Spots pro Gel, ausgewertet. Es wurden nur Spotunterschiede berücksichtigt, die in allen Gelpaaren eines untersuchten Zeitpunktes identisch waren oder, bei Ergebnissen mit menschlichem Probenmaterial, wo Abweichungen von diesem Kriterium anhand von zusätzlich erhobenen Daten geklärt werden konnten. Die Auswertung der Proteinmuster führte zum Nachweis von vier verschiedenen Proteinen aus drei Proteinfamilien, die in der HD-Maus abweichend von der Kontrolle exprimiert waren. Beim Menschen konnte die differentielle Expression eines Proteins im Falle der Krankheit bestätigt werden.

5.1 Untersuchung des Gehirnproteoms bei der Maus und beim Menschen

Nach Auswertung des Gehirnproteoms bei der Maus stellte sich heraus, dass erstaunlicherweise nur eine geringe Anzahl von Proteinen zwischen R6/2 und Kontrolle differentiell exprimiert wurden. Die Spotmuster waren bei den Probenpaaren selbst nahe dem Endstadium der Erkrankung kaum unterscheidbar. Nach Auswertung aller Proteinspots zeigten sich krankheitsrelevante, signifikante Unterschiede im Expressionslevel von nur drei Proteinen, wobei der Expressionsunterschied eines der Proteine nicht immer deutlich zu sehen war. Die Lokalisation der Proteinspots im 2D Gel, die Identifizierung und subzelluläre Verteilung sowie die Expression der Proteine im Verlauf der Erkrankung wird im folgenden beschrieben und die Frage geklärt, inwieweit die Ergebnisse auf den Menschen übertragbar sind.


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5.1.1  Differentielle Proteinexpression nahe dem Endstadium der Erkrankung im Gehirn bei der Maus

Zu Beginn der Studie wurde nach krankheitsspezifischen Unterschieden im Gehirnproteom nahe dem Endstadium der Erkrankung (zwölf Wochen) bei transgenen R6/2 Mäusen gesucht, einem Stadium der Erkrankung, bei dem die größten Unterschiede zwischen erkranktem und gesundem Gehirngewebe zu erwarten waren. Wie aus den Abbildungen 4 bis 11 zu ersehen ist, waren die Spotmuster im Mausgehirn sehr reproduzierbar. Um trotzdem vorhandene, leichte Variationen fast ganz auszuschließen, wurden nur 2D Gele von Probenpaaren miteinander verglichen, die sowohl in der ersten als auch in der zweiten Dimension parallel gelaufen waren.

5.1.1.1 R6/2 Mausgehirne zeigen keine Expression von α1-Antitrypsin 1-5 nahe dem Endstadium der Erkrankung

Drei verschiedene Fraktionen des Gehirns, mit Proteinen angereichert aus dem Zytoplasma, den Membranen oder dem Chromatin, wurden von zwölf Wochen alten R6/2- und Kontrollmäusen untersucht. Die Fraktionierung und separate Auftrennung der Proteinfraktionen im 2D Gel ermöglichte die Darstellung und Untersuchung einer größeren Anzahl von Proteinen, als dies bei der Untersuchung eines Gesamtextraktes möglich gewesen wäre. Die für die einzelnen Fraktionen erzielten Ergebnisse werden nun im Einzelnen dargestellt.

5.1.1.1.1 α1-Antitrypsin1-5 ist in der zytoplasmatischen Fraktion von R6/2 Mäusen nicht mehr nachweisbar

Im pH-Bereich von 3,5 bis 6 fehlten den R6/2 2D Gelen eine drei Spots umfassende Gruppe in allen acht untersuchten HD/Kontrolle Probenpaaren (Abb. 4, Tab. 6). Ein vierter Spot in der Nachbarschaft der Dreiergruppe fehlt im Endstadium der Erkrankung ebenfalls. Alle drei Proteinspots der Spotgruppe auf der sauren Seite wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert und gehören zu einer von fünf murinen Isoform des Serin-Protease-Inhibitors (SERPIN) α1-Antitrypsin, nämlich α1-Antitrypsin 1-5 (AAT 1-5) (Datenbankeintragung: alpha-1-antitrypsin 1-5 precursor; Swiss Prot. No.: Q00898). Der vierte Proteinspot war schwer zu identifizieren, da er selbst eine geringe Intensität besitzt und sehr nah bei einem anderen Spot mit höherer Intensität liegt (Abb. 4). Der beobachtete Isoelektrische Punkt von 5,3 für AAT 1-5 stimmt gut mit dem berechneten Isoelektrischen [Seite 61↓]Punkt von 5,4 überein. Das beobachtete Molekulargewicht von 61 kDa unterscheidet sich um 15 kDa von dem Berechneten (46 kDa).

Abb. 4: AAT 1-5 Expression im Gehirn bei R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion.

Gelausschnitte von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 4 und 6) von Mäusen im Alter von 12 Wochen werden gezeigt (Tab. 6). Drei Beispiele, welche zeigen, dass drei AAT 1-5 Spots in transgenen Mäusen nicht mehr nachweisbar sind.

5.1.1.1.2 α1-Antitrypsin in Membran- und Kernfraktion

Zusätzlich zur zytoplasmatischen Fraktion des Gehirns, wurden zwei weitere Fraktionen untersucht. Proteine, die durch Harnstoff und Detergenzextraktion (Fraktion 2) gewonnen wurden bildeten die Fraktion mit angereicherten Membranproteinen. DNA-bindende Proteine wurden durch DNAse Behandlung freigesetzt (Fraktion 3) und bildeten die Kernfraktion. Die Unterschiede in der Verteilung der Proteine zwischen den Fraktionen ist in Abb. 23 im Anhang dargestellt. In beiden Proteinfraktionen konnten keine weiteren Proteine gefunden werden, die sich zwischen R6/2 und Kontrollprobenpaaren unterschieden. AAT 1-5 konnte im Gegensatz zur zytoplasmatischen Fraktion (Abb. 4) in der Membranfraktion von Kontrollmäusen nur noch in geringen Mengen nachgewiesen werden, was entweder auf teilweise Membranassoziation oder auf geringfügige Überlappung der Proteinverteilung mit der zytoplasmatischen Fraktion zurückzuführen ist [Seite 62↓](Abb. 5). Das Protein war in der Kernfraktion bei Kontrollen nur noch in Spuren und bei R6/2 überhaupt nicht nachweisbar, was für eine überwiegend zytoplasmatische Lokalisation des Proteins spricht (Abb. 6).

Tab. 6: Expression von AAT 1-5 und ABC im Verlauf der Erkrankung

Tiere [a]

R6/2

Kontrollen

 

AAT 1-5

ABC

AAT 1-5

ABC

4 Wo.

1

++

+

-

+

2

++

+

+

+

3

++

+

+++

+

4

++

+

+

+

5

+

+

+

+

6

+

+

+

+

7

+

+

-

+

8

+

+

+

+

9

+

+

+

+

10

+

+

++

+

11

-

+

+

+

12

-

+

-

+

8 Wo.

1

++

+

+++

++

2

+

+

++

++

3

+

+

+++

++

4

+

+

++

++

5

+

+

+++

++

6

-

+

++

++

7

-

+

++

++

8

-

+

+++

++

12 Wo.

1

-

+

+++

+++

2

-

+

+++

+++

3

-

+

+++

+++

4

-

+

+++

+++

5

-

+

+++

+++

6

-

+

+++

+++

7

-

+

+++

+++

8

-

+

+++

+++

Erklärung der Symbole: +++ = Spot ist vorhanden (Spotintensität von Kontrollmäusen im Alter von 12 Wochen); ++ = Spot ist vorhanden, aber die Intensität ist vermindert; + = Spot ist vorhanden, aber die Intensität ist stark vermindert; - = Spot ist nicht nachweisbar; [a]Die Probenpaare (R6/2 and Kontrolltiere) sind so angeordnet, dass mit dem höchsten AAT 1-5 Expressionsniveau bei R6/2 Mäusen in der Tabelle begonnen wird.

5.1.1.2 Verminderte Expression von Contraspin im Gehirn von R6/2 Mäusen

Eine in der pH-Region von 3,5 bis 6 identifizierte Spotgruppe (siehe 5.2.2) mit einem Molekulargewicht von 70 kDa, welche dem Protein Contraspin zugeordnet werden konnte, zeigte eine im großen und ganzen verminderte Expression in der zytoplasmatischen Fraktion des Gehirns. Der Grad der Expressionsverminderung in R6/2 Gehirnen war jedoch auch nahe dem Endstadium der Erkrankung zwischen den Probenpaaren heterogen [Seite 63↓]

Abb. 5: Expression von AAT1-5 in der Membranfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.

Gelausschnitte von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 3 und 4) zeigen eine schwache Expression von AAT 1-5 bei 12 Wochen alten Kontroll-Mäusen.

Abb. 6: Expression von AAT 1-5 in der Kernfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.

Gelausschnitte von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 3 und 4) zeigen keine Expression von AAT 1-5 in R6/2- und Kontrollmäusen im Alter von 12 Wochen. Geringste Menge an AAT 1-5 in den Kontrollen der Probenpaare sind in den Gelausschnitten nicht zu sehen.


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und trat nicht immer auf (Tab.9A). Eine Expression des Proteins in der Membran- und Kernfraktion war nicht zu beobachten (Daten werden nicht gezeigt).

5.1.1.3 R6/2 Mausgehirne nahe dem Endstadium der Erkrankung zeigen eine reduzierte Expression von αB-Kristallin

5.1.1.3.1 Verminderte Expression von αB-Kristallin in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion

In der pH-Region von 6 bis 9,5 war ein quantitativer Unterschied in der Expression bei einem Spot in allen acht Probenpaaren zu sehen (Abb. 7, Tab. 6). Der Spot wurde dem Protein αB-Kristallin (ABC) mittels Massenspektrometrie zugeordnet (Datenbankeintragung: αB-crystallin; Swiss Prot. Nr.: P23927). Das Molekulargewicht von ungefähr 23 kDa, welches für ABC bestimmt wurde, unterscheidet sich um 2,5 kDa vom berechneten Wert von 20,5 kDa. Der isoelektrische Punkt wurde mit Hilfe des Gels auf 7,5 bestimmt. Dies ist ein Unterschied von 0,6 pH-Einheiten zum berechneten Wert. Beide zuvor genannten Veränderungen könnten darauf hindeuten, dass eine Modifikation des Proteins stattgefunden hat.

5.1.1.3.2 Geringere Expression von ABC nahe dem Endstadium der Erkrankung bei R6/2 Mäusen auch in der Membran- und Kernfrakion

ABC wurde auch in der Kern- und Membranfraktion gefunden. Die Expression in beiden Fraktionen nahm gegenüber der zytoplasmatischen Fraktion nicht ab. Die Expression von ABC bei R6/2 Mäusen war wie in der zytoplasmatischen Fraktion geringer als bei Kontrollmäusen. (Abb. 8 und 9).

5.1.2 Expression von AAT 1-5 und ABC während des Krankheitsverlaufes bei der Maus

Die Expression von AAT 1-5 und ABC in der zytoplasmatischen Fraktion von drei ausgewählten Krankheitsstadien, früh (vier Wochen), fortgeschritten (acht Wochen) und nahe dem Endstadium (zwölf Wochen) wurden nun untersucht um einen Überblick über die Expression im Krankheitsverlauf zu erhalten.


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Abb. 7: Expression von ABC im Gehirn von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion.

Gelausschnitte aus dem pH-Bereich von 6 bis 9,5 zeigen eine Zunahme der Expression in drei repräsentativen Probenpaaren (1, 4 und 6) nur in Kontrollmäusen.

Abb. 8: ABC Expression in der Membranfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.

Gelausschnitte von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 3 und 4) zeigen eine verringerte Expression von ABC in der Membranfraktion von 12 Wochen alten R6/2 Mäusen.


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Abb. 9: ABC Expression in der Kernfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.

Gelausschnitte von drei repräsentativen Probenpaaren (2, 3 und 4) zeigen eine verminderte Expression von ABC in der Kernfraktion von 12 Wochen alten R6/2 Mäusen.

5.1.2.1 Verminderung der Expression von AAT 1-5 mit dem Fortschreiten der Erkrankung

Im Frühstadium der Erkrankung im Alter von vier Wochen war bei R6/2 Mäusen AAT 1-5 heterogen exprimiert (Tab. 6). In einer R6/2 Maus war die AAT 1-5 Expression auf einem vergleichbaren Niveau wie bei zwölf Wochen alten Kontrollmäusen, wohingegen andere R6/2 Mäuse überhaupt keine nachweisbare Expression zeigten. Die Expression von AAT 1-5 bei vier Wochen alten Kontrollmäusen war jedoch genauso heterogen wie bei R6/2 Mäusen. Dies deutet darauf hin, dass AAT 1-5 bei R6/2 Mäusen anfänglich auf einem Niveau sehr ähnlich dem der Kontrollmäuse exprimiert wurde. Nach dem Fortschreiten der Erkrankung konnte im Alter von acht Wochen AAT 1-5 im Gehirn bei fünf von acht R6/2 Mäusen nur noch in geringen Mengen gefunden werden, wohingegen Kontrollmäuse im Alter von acht Wochen ein hohes Expressionsniveau des Proteins zeigten (Abb. 10 und Tab. 6). Die Expressionsabnahme der drei Spots erfolgte gleichzeitig, was auf eine Beteiligung aller drei Varianten im gleichen oder einem eng verknüpften Prozess hindeutet. Nahe dem Endstadium der Erkrankung im Alter von zwölf Wochen ist, wie unter 5.1.1.1 bereits dargestellt, keine Expression von AAT 1-5 bei R6/2 Mäusen mehr [Seite 67↓]nachweisbar. Die Expression bei Kontrollmäusen in diesem Alter war hoch (Abb. 4, 10 und Tab. 6). Das Expressionsmuster des vierten Proteinspots korreliert während des Krankheitsverlaufs nicht vollständig mit dem Dreispotmuster an den untersuchten Zeitpunkten, der Trend stimmt jedoch überein.

Abb. 10: AAT Expression im Verlauf der Erkrankung.

Gelausschnitte jeweils eines repräsentativen Probenpaares im Alter von 4, 8 und 12 Wochen von R6/2 und Kontrollmäusen werden gezeigt (Tab. 6). Eine Reduktion von AAT bei R6/2 Mäusen (Pfeile) erfolgt parallel zum Fortschreiten der Erkrankung.

5.1.2.2 Verminderung der Expression von ABC mit dem Fortschreiten der Erkrankung

Die Menge an exprimiertem ABC stieg bei Kontrollmäusen mit zunehmendem Alter stetig an. Die Zunahme war bei allen Mäusen gleich. Die Expression bei R6/2 Mäusen verblieb höchstens auf dem Level von vier Wochen (Abb. 11 und Tab. 6). Eine Heterogenität zwischen den Probenpaaren, wie bei AAT 1-5 (vier und acht Wochen), war nicht zu beobachten. Dies deutet darauf hin, dass das Protein im Verlauf der Erkrankung verbraucht oder/und in geringerem Maße produziert wurde.


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Abb. 11: ABC Expression im Verlauf der Erkrankung.

Gelausschnitte jeweils eines repräsentativen Probenpaares im Alter von 4, 8 und 12 Wochen von R6/2 und Kontrollmäusen werden gezeigt (Tab. 6). Die ABC Expression bei R6/2 Mäusen (Pfeile) nimmt während des Krankheitsverlaufs im Gegensatz zur Kontrolle nicht zu.

5.1.3 Untersuchung der Geschlechtsspezifität der Expression der differentiell exprimierten Proteine bei der Maus

In Vorversuchen mit C57Bl/6 Mäusen wurde nun die Geschlechtsspezifität der Expression von AAT 1-5 und ABC im Gesamtgehirn und einzelnen Gehirnregionen untersucht. An dieser Stelle ist es wichtig anzumerken, dass die 2D Gel Spotmuster von CBAxC57Bl/6 Mäusen (genetischer Hintergrund der transgenen R6/2 Mäuse und Kontrollmäuse) und C57Cl/6 Mäusen ziemlich gut miteinander übereinstimmen und die Positionen und Intensitäten der Spots (Kontrolltiere) der beiden Proteine von Interesse (AAT und ABC) in beiden Mäusestämmen identisch sind.

5.1.3.1 Geringere Expression von AAT 1-5 in weiblichen als in männlichen Mäusen

Die bisherigen Ergebnisse wurden ausschließlich unter Verwendung von männlichen Mäusen erzielt. Nun sollten auch Gehirne von weiblichen Mäusen untersucht werden. Auf der Ebene des Gesamtgehirns konnte keine AAT 1-5 Expression in weiblichen C57Bl/6 Mäusen nachgewiesen werden (Tab. 8A). Eine Untersuchung verschiedener Gehirnregionen, von drei weiblichen Mäusen ergab, dass AAT 1-5 in bestimmten [Seite 69↓]Regionen in mittlerer bis geringer Menge exprimiert wurde (Tab. 8B). Der Bereich mit der höchsten Expression war der Nervus Trigeminus, aber auch in anderen Regionen, wie der Hypophyse, dem Motorkortex, dem Hippocampus, den Bulbi Olfaktorii und dem Cerebellum wurde das SERPIN nachgewiesen (Tab. 8B). Der nicht geglückte Nachweis von AAT 1-5 auf der Ebene des Gesamtorgans, könnte auf Verdünnung zurückzuführen sein. Große Gehirnregionen wie der Kortex, das Mittelhirn und das Cerebellum exprimierten AAT 1-5 auf sehr geringem oder nicht nachweisbarem Niveau (Tab. 8B). Der Beitrag dieser Gehirnregionen zum Extrakt könnte das in anderen Gehirnregionen vorhandene AAT 1-5 soweit verdünnt haben, dass die Nachweisgrenze der Silberfärbung (2 ng) im Gesamtgehirn unterschritten worden sein könnte.

5.1.3.2 Gleiches Expressionsniveau von ABC in weiblichen und männlichen Mäusen

ABC wurde im Gehirn von männlichen und weiblichen Tieren exprimiert (Tab. 8A). Das Expressionsniveau von ABC in verschiedenen Gehirnregionen bei weiblichen Mäusen entsprach der Expression im Gesamtgehirn beim Männchen mit Ausnahme des Nervus Trigeminus (sehr hoch) und der Hypophyse (gering) (Tab. 8B und Abb. 15).

5.1.4 Veränderte Proteinexpression im Endstadium der Erkrankung beim Menschen

Die drei Proteine (AAT, CTS und ABC), deren Expression sich zwischen dem R6/2 Mausmodell und der Kontrolle HD-spezifisch unterschied, wurden nun in drei menschlichen Gehirnregionen von HD postmortem Gewebe und Blutplasma untersucht (Tab. 7).

5.1.4.1 Veränderte Expression von AAT bei HD postmortem Gehirnen

Eine Gruppe bestehend aus 6 Spots wurde auf der Gelhälfte mit niedrigem pH-Wert (3,5 – 6) gefunden, während in Kontrollgelen im gleichen Bereich nur drei Spots zu sehen waren (Abb. 12). Dies deutet auf Spotduplizierung hin, welche durch eine Erhöhung des Molekulargewichts oder durch eine Veränderung der Proteinstruktur hervorgerufen worden sein könnte. Diese veränderte Expression wurde im Striatum und Parietallappen von einer weiblichen und einer männlichen Person, welche von HD betroffen waren, gefunden (Abb.


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Tab. 7: Beschreibung der menschlichen HD und Kontrollgewebe und Blutplasmaproben

Gehirnbe-zeichnung

Herkunft des Gewebes

Gehirn-region

Pathologie-grad[a]

Alter zum Entnahme-zeitpunkt [Jahre]

Geschlecht

Postmor-teminterval [Stunden]

56[b]

LMU[c]

Str, Ptl;

2-3

56

w

56

93

LMU

Str; Ptl;

2-3

61

m

9

99

LMU

Str, Tha;

0

55

w

14

104

LMU

Str; Ptl;

0

59

m

?

B3703

HBTRC

AGC

4

61

w

25

B4226

HBTRC

AGC

4

62

w

28

B4356

HBTRC

AGC

4

61

w

24

B4381

HBTRC

AGC

4

55

w

23

B3700

HBTRC

AGC

0

62

w

16

B3813

HBTRC

AGC

0

58

w

20

B3959

HBTRC

AGC

0

59

w

18

B4625

HBTRC

AGC

0

53

w

24

“F”

CCM

Blut (Plasma)

?

 

m

-

“M”

CCVK

Blut (Plasma)

0

 

m

-

[a]Schweregrad der Erkrankung bestimmt nach den Kriterien von Vonsattel [54]; [b]Aus den Gehirnen 56 und 99 sowie 93 und 104 wurden Probenpaare gebildet; [c]Abkürzungen: LMU, Institut für Neuropathologie, „Ludwig Maximilian“ Universität München HBTRC, Harvard Brain Tissue Resource Center, McLean Hospital, Belmont, MA, USA; CCM, Klinik für Neurologie, Charite Campus Mitte, Berlin; CCVK, Institut für Humangenetik, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin; Str, Striatum; Ptl, Parietallappen; AGC, vorderer Gyrus Cinguli; w, weiblich; m, männlich.

Abb. 12: Expression von AAT in drei Regionen von Postmortem-Gehirnen beim Menschen.

Die Abbildung zeigt Gelausschnitte von drei Gehirnregionen, Striatum, Parietallappen und Gyrus Cinguli von Postmortem-Gehirnen von Individuen im Endstadium der Erkrankung und im Alter von ungefähr 60 Jahren (genaues Alter siehe Tab. 7). Die Striatum und Parietallappenproben stammen von den Patienten 93 (HD) und 104 (Kontrolle), die ACG Probe stammt von den Patientinnen B3703 und B3700 (siehe Tab. 7). Pfeile zeigen ein Sechsspotmuster in HD und ein Dreispotmuster in Kontrollgehirnen.

12). Zwei von vier Proben vom vorderen Gyrus Cinguli von weiblichen HD Patienten [Seite 71↓]zeigten das gleiche Muster (Abb. 12 und Abb. 13). Die vier am stärksten gefärbten Spots wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie als das SERPIN AAT identifiziert (Datenbankeintrag: α1-antitrypsin precursor; Swiss Prot. Nr.: P01009), das homologe Protein, welches auch im Mausmodell, unter anderem im Gehirn differentiell exprimiert wurde. Der pI der AAT-Spotgruppe lag bei 4,7 und das Molekulargewicht bei ungefähr 40 kDa. Die Spots unterschieden sich durch einen geringeren pI-Wert (0,6 pH-Einheiten) und einem niedrigeren Molekulargewicht (20 kDa) von denen die bei der Maus gefunden wurden. Diese Unterschiede deuten möglicherweise auf eine Prozessierung von AAT hin. Bei den vorderen Gyrus Cinguli Probenpaaren war die Spotduplizierung auch bei einem Kontrollgehirn zu sehen (Abb. 13). Dieses Gehirn war von einer frischen Blutung im zerebralen und subarachnoiden Raum und einer moderaten, akuten Enzephalopathie des hypoxisch-ischemischen Typs (Bericht der Neuropathologie bereitgestellt durch das „Havard Brain Tissue Resource Center“) betroffen. Bei dieser Gehirnregion wurde ein Anstieg der Expression des „Glial Fibrillary Acidic Protein“ (GFAP) festgestellt, was auf Gliose in dieser Gehirnregion schließen lässt. In zwei der drei verbleibenden Kontrollgehirne des vorderen Gyrus Cinguli wurden keine Abnormitäten diagnostiziert. Das dritte Gehirn zeigte einen schwach differenzierten Tumor, welcher mit den Kriterien für ein metastasierendes Melanom übereinstimmt (B4625; Bericht der Neuropathologie bereitgestellt durch das „Havard Brain Tissue Resource Center“). Dieses Kontrollgehirn zeigte jedoch keine Spotduplizierung und keine Erhöhung des Gliosemarkers GFAP (Abb. 13). Vorläufige Untersuchungen bei einer Blutplasmaprobe von einem HD Patienten („F“) zeigten eine leichte Erhöhung der AAT Konzentration (Abb. 14) im Blut. Es konnte jedoch kein Doppelspotmuster von AAT, wie bei den drei untersuchten menschlichen Gehirnregionen, Striatum, Parietallappen und Gyrus Cinguli, (Abb. 14 vs. Abb. 12 und 13), gefunden werden.


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Abb. 13: Expression von AAT im vorderen Gyrus Cinguli bei Postmortem-Gehirnen.

Die Probenpaare (HD/Kontrolle) 1 (B3703 und B3700), 2 (B4226 und B3813), 3 (B4356 und B3959) und 4 (B4381 und B4625) zeigen die Expressionen von AAT bei vier verschiedenen, weiblichen HD Patienten im vorderen Gyrus Cinguli und den entsprechenden dem Alter und Geschlecht angepassten Kontrollen. Das AAT Spotmuster ist mit einer Ellipse umrandet. Das Sechsspotmuster tritt nur bei zwei von vier Probenpaaren von HD (1 und 2) auf. Das Doppelspotmuster bei der Kontrolle im Probenpaar zwei geht mit erhöhter Expression von GFAP, einem Marker für Gliose, einher.

Abb. 14: Expression von AAT im Blut (Plasma) von einem HD Patienten während der Erkrankung

Die Gelausschnitte zeigen die Expression von AAT im Blut (Plasma) des HD Patienten “F” und in einer Kontrollperson „M“. Eine Erhöhung der AAT Expression ist beim HD Patienten zu erkennen.


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5.1.4.2  Expression von ABC ist im menschlichen Gehirn nicht nachweisbar

Die Isoform des Proteins ABC, welche sich bei der Maus im Verlauf der Erkrankung änderte, konnte in den untersuchten, menschlichen Gehirnregionen nicht gefunden werden (Resultate werden nicht gezeigt). Dies ist wahrscheinlich auf eine zu geringe Expression der bei der Maus gefundenen Isoform von ABC im menschlichen Gehirn zurückzuführen, da der Spot im menschlichen Herzen bereits gefunden wurde [102]. Der pI und das Molekulargewicht von ABC sind bei Mensch und Maus nahezu identisch [102].

5.2 Expression von krankheitsrelevanten Proteinen in verschiedenen Geweben

In R6/2 Mäusen wurden Proteinaggregate, die N-terminale Fragmente des HD-verursachenden Proteins Htt enthalten, in Form von nukleären Einschlüssen in verschieden Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems gefunden [63]. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob sich die Expression der im Gehirn gefundenen Proteine (AAT, CTS und ABC) auch in anderen Organen krankheitsspezifisch ändert. Mit der Untersuchung des Gehirns wurde ein Organ ausgewählt, welches hauptsächlich aus dem Ektoderm, einem der drei embryonalen Keimblätter, gebildet wird. Bei der Auswahl der weiteren, untersuchten Organe wurde nun je ein Vertreter des Mesoderms (Herz) und des Endoderms (Leber) ausgewählt. Da R6/2 Mäuse reproduktive Schwierigkeiten aufweisen [41] und die Testes von fünf in der Literatur bereits untersuchten Geweben (Muskel, Testes, Leber, Niere und Milz) den höchsten Atrophiegrad aufwiesen [63], wurden diese, als weiterer Vertreter des Mesoderms, untersucht.

5.2.1 Voruntersuchung zur Expression von AAT 1-5 und ABC in verschiedenen Geweben und Gehirnregionen

5.2.1.1 Expression von AAT 1-5 in unterschiedlichen Geweben

AAT 1-5 konnte im Herzen, in der Leber und den Testes von C57Bl/6 Mäusen nachgewiesen werden (Tab. 8A).


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Tab. 8: Verteilung von AAT 1-5 und ABC im Gewebe und in Gehirnregionen. Verteilung im Gewebe (Oben). : Verteilung in den Gehirnregionen von weiblichen Mäusen (Unten)

 

 

Gewebe

AAT 1-5

ABC

weiblich

männlich

weiblich

männlich

Gehirn

-

+++

+++

+++

Herz

+

+++

+++

+++

Leber

-

+++

-

-

Milz

-

n. d.[a]

-

-

Testes

n. v.

+++

n. v.

-

Gehirnregion[b]

AAT 1-5

ABC

Nervus Trigeminus

++

++++[c]

Hypophyse

++

+

Motorkortex

+

+++

Hippocampus

+

+++

Bulbi Olfaktorii

+

++

Cerebellum

-

+++

Striatum

-

+++

Frontaler Kortex

-

+++

Mittelhirn

-

+++

Rhombenzephalon

-

+++

Thalamus

-

+++

Septum

-

+++

[a]Erklärung der Symbole siehe Tab. 6; n. d. = nicht durchgeführt; n. v. = bei weiblichen Mäusen nicht vorhanden; [b]Der Motorkortex enthält die Amygdala und die Area Entorhinalis. Die Region, welche als Thalamus bezeichnet worden ist, enthält auch den Hypothalamus; [c] ++++ weist auf eine Expression von ABC in dieser Gehirnregion hin, als die höher ist als auf der Ebene des Gewebes im Gehirn und Herzen.

5.2.1.2 ABC Expression in unterschiedlichen Geweben

ABC wurde nur im Gehirn und Herzen von C57Bl/6 Mäusen detektiert (Tab. 8A; siehe auch Abb. 7, 8, 9, 11 und 15 (Gehirn); Abb. 18 (Herz)). Die Expression in den verschiedenen Gehirnregionen war gleichmäßig hoch mit Ausnahme des Nervus Trigeminus (sehr hoch) und der Hypophyse (niedrig) (Tab. 8B). Abb. 15 zeigt exemplarisch am Beispiel der Expression von ABC in verschiedenen Gehirnregionen, wie die Intensitätsunterschiede der ABC Spots verschiedenen Symbolen (+ - ++++) zugeordnet wurden. Die mit den Organen von gesunden Mäusen gewonnenen Daten für die Expression von AAT und ABC in verschiedenen Geweben bildeten nun die Grundlage für die Untersuchung der Expression von AAT 1-5 und ABC in Herz, Testes und Leber von R6/2 Mäusen.


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Abb. 15: Verteilung der ABC Expression in verschiedenen Gehirnregionen

Expression des Chaperons ABC in verschiedenen Gehirnregionen. Es wird eine Korrelation der Spotintensitäten zu den Intensitätssymbolen (+ bis ++++) in Tab. 8B gezeigt. Der Pfeil zeigt den ABC Spot in den verschiedenen Gelausschnitten aus der zytoplasmatischen Fraktion der verschiedenen Gehirnregionen.


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5.2.2  Untersuchung der differentiellen Proteinexpression im Herzen

Es wurde nun die zytoplasmatische/nukleoplasmatische Fraktion des Proteinextrakts aus dem Herzen von R6/2 Mäusen auf differentielle Proteinexpression der beiden im Gehirn gefundenen Proteine, AAT 1-5 und ABC, untersucht. Außerdem sollte geklärt werden, ob weitere Proteine in diesem Organ zwischen R6/2 und Kontrollmäusen krankheitsspezifisch differentiell exprimiert wurden.

5.2.2.1 Verringerte Expression von AAT im Herzen von R6/2 Mäusen

AAT 1-5 wurde auch im Herzen bei R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung stark vermindert exprimiert (Abb. 16 A). Die Anzahl der unterschiedlichen AAT 1-5 zugeordneten Spots erweiterte sich von drei im Gehirn auf mindestens fünf im Herzen (Abb. 16 A). Die im Herzen gefundene Dreispotgruppe (Abb. 16 A, rechte Seite) war wie auch schon im Gehirn nur in Kontrollgehirnen vorhanden. Neben der bereits identifizierten

Abb. 16: AAT und CTS Expression im Herzen nahe dem Endstadium der Erkrankung.

Gelausschnitte aus dem niedrigen pH-Bereich von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 2 und 3) aus zytoplasmatischen Extrakten des Herzens von 12 Wochen alten Mäusen zeigen Unterschiede in der Expression von AAT (AAT 1-5; A und AAT 1-4; B; alle 7 Spots verändert) und CTS (C und D). Das SERPIN CTS tritt in diesem Gewebe als 70 kDa, „C“ und 170 kDa „D“ Isoform auf.

AAT-Isoform AAT 1-5 (Abb. 16 A) wurde die Isoform AAT 1-4 (Abb. 16 B; [Seite 77↓]Datenbankeintragung: alpha1-antitrypsin 1-4 precursor, Swiss-Prot # Q00897) mit zwei Spots eindeutig identifiziert. Die Expression von AAT 1-4 war im Herzen bei R6/2 Mäusen geringfügig erniedrigt (Abb. 16 B). Wie bei AAT 1-5 wich das elektrophoretisch bestimmte Molekulargewicht von AAT 1-4 von ca. 60 kDa vom berechneten (46.0 kDa) deutlich (14 kDa) ab.

5.2.2.2 Verminderte Expression von Contraspin im Herzen von R6/2 Mäusen

Ein weiteres, bei HD in der Maus differentiell exprimiertes SERPIN, Contraspin (CTS) (Datenbankeintrag: contraspin; Swiss-Prot # Q62257), konnte neben dem Gehirn, auch im Herzen identifiziert werden (Abb. 16 (C und D) und 17). Spotgruppen von CTS wurden an zwei verschiedenen Orten im Gel gefunden. Die Gruppen besaßen einen gemeinsamen, beobachteten pI von ungefähr 5 und zwei unterschiedliche Molekulargewichte von 70 kDa (Gruppe mit 7 Spots; Abb. 16 C) und 170 kDa (Gruppe mit 6 Spots; Abb. 16 D und 17). Wie bereits bei AAT 1-4 und AAT 1-5 festgestellt, wich auch das Molekulargewicht der 70 kDa Isoform, welches mit Hilfe der Mobilität in der Großgel 2D-Elektrophorese bestimmt worden war, beträchtlich (23 kDa höher) von dem berechneten Wert (46,6 kDa) [103] ab.

Abb. 17: Expression der 170 kDa Isoform von CTS.

Die Vergrößerung der Gelausschnitte der drei Probenpaare aus Abb. 12 (D) zeigt ein Muster aus mindestens 6 Spots, welche bei 12 Wochen alten R6/2 Mäusen nicht mehr detektierbar sind.


[Seite 78↓]

5.2.2.3  Gleiche Expression von ABC in R6/2 – und Kontrollmäusen

ABC wird im Herzen bei R6/2 und Kontrollen auf hohem Niveau exprimiert. Die Lokalisation des einzelnen Spots im Gel war im Gehirn und Herzen identisch. Die Spotintensitäten sind auch im Alter von zwölf Wochen bei sehr weit fortgeschrittener Erkrankung nahezu identisch, d. h. es gibt keine differentielle ABC Expression im Herzen (Abb. 18).

Abb. 18: Unveränderte Expression von ABC im Herzen nahe dem Endstadium der Erkrankung.

Gelausschnitte der drei dargestellten, repräsentativen Probenpaare (1, 3 und 4) von 12 Wochen alten Mäusen zeigen in der zytoplasmatischen Fraktion eine unveränderte Spotintensität (Pfeil) von ABC.

5.2.2.4 Expression von AAT und CTS im Verlauf der Erkrankung

Im Herzen beginnt während der Erkrankung die Expression der SERPINE AAT und CTS (beide Isoformen) im Alter von acht Wochen abzunehmen, wobei eine ausgeprägte Expressionsverringerung erst im Alter von zwölf Wochen, nahe dem Endstadium der Erkrankung, zu sehen ist (Tab. 9 und 10).


[Seite 79↓]

Tab. 9: Differentielle Proteinexpression in verschiedenen Geweben. Expression von AAT 1-5 in verschiedenen Geweben[a] (Oben). Expression von MUPs im Krankheitsverlauf (Unten).

Tiere

R6/2

Kontrolle

 

Gehirn

Herz

Leber

Testes

Gehirn

Herz

Leber

Testes

8 Wo.

1

++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

2

+

+++

+++

+++

++

+++

+++

+++

3

+

n. d.[b]

++

++

+++

n. d.

+++

+++

4

-

n. d.

++

+++

++

n. d.

+++

+++

12 Wo.

1

-

-

-

-

+++

+++

+++

+++

2

-

-

-

-

+++

+++

+++

+++

3

-

-

-

-

+++

+++

+++

+++

4

-

-

-

-

+++

+++

+++

+++

Tiere

R6/2

Kontrolle

8 Wo.

1

+++

+++

2

+++

+++

3

+++

+++

4

+++

+++

12 Wo.

1

+

+++

2

+

+++

3

+

+++

4

+

+++

[a]im Gehirn identifiziertes Drei-Spot-Muster von AAT 1-5 (Fig. 4 und 10, Pfeile); für die Erklärung der Symbole siehe Tab. 6; +++ ist das Expressionsniveau in dem jeweiligen Gewebe bei 12 Wochen alten Kontrollmäusen.

5.2.3 Untersuchung der differentiellen Expression von AAT, CTS und ABC in den Testes

Nachdem im Gehirn und im Herzen die beiden SERPINE, AAT und CTS, im Krankheitsverlauf vermindert exprimiert worden waren, wurde nun deren Expression und die von ABC bei stark atrophischen Testes von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung auf eine krankheitsspezifische Veränderung untersucht. Der starke Gewichtsverlust der Testes parallel zum Fortschreiten der Erkrankung ließ auf die Identifizierung weiterer Proteine hoffen.


[Seite 80↓]

Tab. 10: Expression der beiden CTS Isoformen. 70 kDa Isoform in verschiedenen Geweben (Oben). 170 kDa Isoform im Herzen (Unten).

Tiere

R6/2

Kontrolle

 

Gehirn

Herz

Leber

Testes

Gehirn

Herz

Leber

Testes

8 Wo.

1[a]

[b]-

+++

++

++

++

+++

++

++

2

-

+++

++

++

++

+++

++

+

3

+

n. d.[c]

+

+

++

n. d.

++

++

4

++

n. d.

++

++

++

n. d.

++

++

12 Wo.

1

-

+

-

-

++

+++

++

++

2

++

+

-

+

+++

+++

++

++

3

-

+

-

+

++

+++

++

++

4

-

+

-

+

++

+++

++

++

Tiere

R6/2

Kontrolle

8 Wo.

1

+++

+++

2

++

+++

3

n. d.

n. d.

4

n. d.

n. d.

12 Wo.

1

-

+++

2

-

++

3

-

+++

4

-

+++

[a]Die Probenpaare (R6/2 and Kontrolltiere) sind so angeordnet, dass mit dem höchsten AAT Expressionslevel bei R6/2 Mäusen in der Tabelle begonnen wird;[b] Erklärung der Symbole: +++ = Spot ist vorhanden (Spotintensität von Kontrollmäusen im Alter von 12 Wochen); ++ = Spot ist vorhanden, aber die Intensität ist vermindert; + = Spot ist vorhanden, aber die Intensität ist stark vermindert; - = Spot ist nicht nachweisbar; [c] n. d., nicht durchgeführt. Die Intensität der Kontrollspots war im Gehirn bei Contraspin sehr niedrig.

5.2.3.1 Verminderte Expression von AAT in den Testes von R6/2 Mäusen

AAT war in den Testes, wie im Herzen bereits gezeigt, in mindestens sieben Spots differentiell exprimiert (Abb. 19). Auch hier wurden sowohl die Isoform AAT 1-4 (2 Spots, Abb. 19 B) als auch AAT 1-5 (5 Spots, Abb. 19A) gefunden. Bei allen Probenpaaren konnte eine differentielle Expression von AAT 1-5 nachgewiesen werden (Abb. 19). Eine differentielle Expression von AAT 1-4 war nur in drei von vier Probenpaaren zu beobachten (Abb. 19, Probenpaar 4 (B), kein Unterschied). Dies könnte dadurch zu erklären sein, dass die R6/2 Testes bei Probenpaar 4 im Gegensatz zu den [Seite 81↓]anderen Probenpaaren einen noch höheren Atrophiegrad aufwiesen. Diese wogen noch 20 mg, viel weniger als die Kontrolltestes mit 262 mg. Dies bedeutet, dass die R6/2 Testes nur noch 7,6 % (w/w) des Kontrollgewichtes besaßen, sodass also über 92 % (w/w) des Gewebes durch Atrophie verloren gegangen sind. Die Proteinzusammensetzung des Restgewebes bei R6/2 (Probenpaar 4) könnte durch diese starke Atrophie stark verändert worden sein. Möglicherweise besteht es nur noch aus Zellen mit höherem AAT Gehalt, welche als einzige überlebt haben könnten. Die Testes der R6/2 Maus des Probenpaares 3, bei dem der AAT 1-4 Expressionsunterschied noch detektierbar war, wog 34 mg, was ein 1,7-fach höheres Gewicht im Vergleich zu Probenpaar 4 (Abb. 19) bedeutet.

Abb. 19: Expression von AAT in Testes nahe dem Endstadium der Erkrankung

Gelausschnitte von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 3 und 4) zeigen eine unterschiedliche Expression von AAT (A und B, alle 7 AAT Spots verändert) und CTS (C und D). Die Expression der schon im Herzen gefundenen 170 kDa Isoform von CTS (D) ist nur bei zwei der drei Probenpaare in der Kontrolle nachweisbar.

5.2.3.2 Verminderte CTS Expression in den Testes von R6/2 Mäusen

CTS unterschied sich bei zwölf Wochen alten Mäusen auch in den Testes in der Expression bei der 70 kDa Isoform, wobei die quantitativen Unterschiede etwas geringer als im Herzen waren. (Abb. 19 vs. Abb. 16). Die 170 kDa Isoform konnte in drei von vier Probenpaaren bei der Kontrolle jedoch nicht bei R6/2 nachgewiesen werden, wobei die [Seite 82↓]Intensität der Spots außer bei Probenpaar 1 nahe an der Nachweisgrenze lag (Abb. 19). Bei den untersuchten R6/2-Kontroll-Probenpaaren war auch die Expression von der 70 kDa CTS Spotgruppe bei zwölf Wochen alten Kontrollmäusen in den Testes geringer als im Herzen (Abb. 19 vs. 16). Es konnten keine weiteren, differentiell exprimierten, Spots gefunden werden.

5.2.3.3 Verminderte Expression von AAT und CTS im Verlauf der Erkrankung

Während des Fortschreitens der Erkrankung begann die Expression von AAT und CTS im Alter von acht Wochen geringfügig abzunehmen. Eine ausgeprägte Expressionsverringerung war erst im Alter von zwölf Wochen zu sehen ist (Tab. 9 und 10). Die Expression der 170 kDa-Isoform von CTS war im Alter von acht Wochen in den Testes kaum nachweisbar, sodass keine verlässlichen Angaben über den zeitlichen Verlauf des Expressionsniveaus bei dieser Spotgruppe gemacht werden können (Daten werden nicht gezeigt).

5.2.4 Untersuchung der differentiellen Expression von AAT, CTS und ABC in der Leber

Durch die Untersuchung des Proteoms des Gehirns (Endoderm) und der aus dem Mesoderm stammenden Organe, Herz und Testes, wurden drei, im Krankheitsverlauf differentiell exprimierte Proteine, AAT, CTS und ABC identifiziert. Obwohl von einem hohen Gewichtsverlusts im Laufe der Erkrankung betroffen, fand sich in den Testes kein weiteres, krankheitsspezifisch verändert exprimiertes Protein. Dies lässt darauf schließen, dass die unterschiedliche Expression der gefundenen Proteine primär krankheitsspezifisch war, und nicht auf Sekundärprozesse wie z. B. Atrophie, zurückzuführen war. Die Untersuchung der Leber aus dem Endoderm rundet die Untersuchung der drei Keimblätter ab.

5.2.4.1 Verminderte Expression von AAT in der Leber von R6/2 Mäusen

AAT zeigte bei zwölf Wochen alten Mäusen in der Leber ein Expressionsniveau, welches geringer als im Herzen und ungefähr vergleichbar mit den Testes war (Abb. 20 vs. Abb. 16 und 19). AAT 1-5 war, wie in Herz und Testes, mit fünf Spots exprimiert. Zwei Spots mit differentieller Expression in Testes und Herz waren in der Leber nicht verändert (Abb. 19 [Seite 83↓]A und 16 A (Pfeile links) vs. Abb. 20 E). Die drei Spots von AAT 1-5 in „A“, die zuerst im Gehirn identifiziert wurden, waren bei R6/2 Mäusen im Alter von zwölf Wochen nicht exprimiert. Die Variante AAT 1-4 in „B“ zeigte Unterschiede in der Expression zwischen R6/2 und Kontrolle.

Abb. 20: Expression von AAT und CTS in der Leber während des Endstadiums der Erkrankung.

Bei den Gelausschnitten der dargestellten drei repräsentativen Probenpaare (1, 2 und 3) von 12 Wochen alten Mäusen ist die Expression von AAT 1-5 A und CTS (C) in R6/2 nicht mehr nachweisbar. Die AAT Variante in AAT 1-4 (B) zeigte eine mäßige Reduktion der Expression und Variante AAT 1-5 E war unverändert (5 Spots verändert; 7 Spots gesamt). Die 170 kDa Isoform von CTS war in der Leber nicht nachweisbar.

5.2.4.2 Verminderte CTS Expression in der Leber von R6/2 Mäusen

Eine Expression der 70 kDa Isoform von CTS (Abb. 20 C) war in R6/2 Mäusen im Alter von zwölf Wochen im Gegensatz zur Kontrolle nicht nachweisbar. Die 170 kDa Isoform von CTS war in der Leber im Gegensatz zu Herz und Testes auch in der Kontrolle nicht nachweisbar (Daten für Leber werden nicht gezeigt). Das allgemeine Expressionsniveau der 70 kDa Isoform von CTS war in der Leber von Kontrolltieren war geringer als im Herzen, aber vergleichbar mit den Testes und höher als im Gehirn.


[Seite 84↓]

5.2.4.3 Stark verminderte Expression von Major Urinary Proteins in der Leber von R6/2 Mäusen

Ein außergewöhnlicher, aber leberspezifischer Unterschied in der Proteinexpression, bestand aus einem Muster von mindestens neun Spots, welche als zu den Major Urinary Proteins (MUPs) zugehörig identifiziert wurden (Datenbankeintrag: MUP1_mouse, Swiss-Prot # P11588). Die exakte MUP-Isoform für jeden Spot konnte mit Hilfe der Massenspektrometrie nicht zugeordnet werden. Ein pI Wert im Bereich von 4,9 bis 5,3 und ein Molekulargewicht von 22 kDa wurde für die Proteine mit Hilfe der Gelmobilität bestimmt. Diese Werte korrelieren gut mit Literaturdaten für den pI von 4,6 bis 5,3 [104] und einem berechneten Molekulargewicht von ungefähr 21 kDa (Datenblätter zu den Swiss-Prot. Eintragen für murines MUPs). Die Expression dieser Proteine war in zwölf Wochen alten R6/2 Mäusen stark reduziert (Abb. 21).

Abb. 21: MUPs Expression in der Leber nahe dem Endstadium der Erkrankung

Die drei dargestellten, Gelausschnitten von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 2 und 3) zeigen eine sehr deutliche Reduktion der MUPs Expression in R6/2 Mäusen im Alter von 12 Wochen.

Eine stark verminderte Expression von MUPs wurde auch im Urin von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung gefunden (Abb. 22).


[Seite 85↓]

5.2.4.4 Expression von AAT, CTS und MUPs im Krankheitsverlauf

Im Krankheitsverlauf unterschied sich die Expression AAT, CTS und MUPs zwischen R6/2 und Kontrollmäusen erst im Alter von 12 nicht jedoch 8 Wochen (Abb. 20 und 21 sowie Tab. 9 und 10).

Abb. 22: Stark reduzierte MUPs Expression im Urin von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung

Ein repräsentatives Beispiel eines Gelausschnitts einer Urinprobe von zwölf Wochen alten R6/2 und Kontrollmäusen. Im Gegensatz zum Kontrolle wurde das R6/2 Gel bis zum Sichtbarwerden des Hintergrunds gefärbt, da keine Referenzspots, welche bei R6/2 und Kontrolle gleich exprimiert wurden als Anhaltspunkt für eine identische Färbung vorhanden waren.


[Seite 86↓]

5.2.5  Zusammenfassung der Ergebnisse aus der Untersuchung verschiedener Gewebe

Bei dieser Arbeit wurde Gewebe aus den drei Keimblättern, Ektoderm (Gehirn), Mesoderm (Herz und Testes) und Endoderm (Leber) untersucht. Eine wichtige Erkenntnis der Untersuchung dieser Gewebe ist, dass die AAT 1-5 Expression im Gehirn im Gegensatz zu den anderen drei Organen schon im Alter von acht und nicht erst mit zwölf Wochen signifikant erniedrigt war (Tab. 9A). Die Abnahme von CTS nahe dem Endstadium der Erkrankung (zwölf Wochen) ist im Gehirn und bei den Testes geringer als bei der Leber und im Herzen (Tab. 10A und Daten nicht gezeigt (Gehirn)). ABC war im Gehirn und Herzen und nicht in den Testes und der Leber nachweisbar (Tab. 8A) und nur im Gehirn von R6/2 Mäusen vermindert exprimiert (Tab. 6, Abb. 7, 9 und 11 vs. Abb. 18). Die Expression von AAT, CTS und MUPs ist bei männlichen viel höher als bei weiblichen Mäusen. Die Untersuchungen wurden deswegen an männlichen Mäusen durchgeführt. Es konnte somit eine Expressionsabnahme von Proteinen aus drei verschiedenen Proteinfamilien beobachtet werden – zwei SERPINE (AAT und CTS), ein Chaperon (ABC) und ein zur Lipocalinfamilie gehöriges Protein (MUPs, [105]). Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für Gewebe von zwölf Wochen alten Mäusen zeigt Tab. 11.

Tab. 11: Zusammenstellung des Expressionsniveaus von Proteinen, welche HD-spezifisch verändert wurden nahe dem Endstadium der Erkrankung[a]

Gewebe

Gehirn

Herz

Leber

Testes

AAT[b]

-[c]

-

-

(+)

CTS

nein

+

-

+

ABC

+

+++

nein

nein

MUPs

nein

nein

+

nein

[a]Mäuse im Alter von 12 Wochen; [b]die Anzahl der AAT Spots unterschied sich zwischen den Geweben; AAT und CTS Spots wurden in Gehirn, Leber auf der Organebene nur bei männlichen Mäusen gefunden; [c] Zeichenerklärung: +++ = Spot(s) ist (sind) im Gel nachweisbar (Spotintensität(en) wie bei 12 Wochen alten Kontrollmäusen); ++ = Spot(s) ist (sind) nachweisbar, aber die Expression ist reduziert; + = Spot(s) ist (sind) nachweisbar aber die Intensität stark reduziert; (+) = Spot(s) ist (sind) kaum nachweisbar; - = Spot(s) ist (sind) nicht nachweisbar; nein = Spot(s) wurde(n) in diesem Gewebe nicht gefunden.


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10.03.2005