[Seite 87↓]

6  Diskussion

Beim Vergleich des Proteoms von HD Exon 1 transgenen Mäusen und Kontrollmäusen traten nahe dem Endstadium der Erkrankung nur wenige, aber krankheitsspezifische Unterschiede im Proteinmuster auf. Der größte Teil der exprimierten Proteine war identisch. Mit Hilfe der gefundenen Expressionsunterschiede konnte zum ersten Mal auf Proteinebene gezeigt werden, dass AAT und ABC in ihrer Expression im Gehirn eines Mausmodells für HD während des Krankheitsverlaufs abnehmen. Nahe dem Endstadium der Erkrankung sinkt die Expression von AAT bis unterhalb der Nachweisgrenze einer Silberfärbung von 2 ng ab. Die ABC Expression ist zu diesem Zeitpunkt im Gehirn stark reduziert. Ein weiteres SERPIN, CTS, war in einigen Probenpaaren nahe dem Endstadium im Expressionsniveau erniedrigt. Die Untersuchung der Organe Herz, Testes und Leber zeigte, dass das Expressionsniveau von AAT und im Gegensatz zum Gehirn, CTS, nahe dem Endstadium der Erkrankung stark vermindert ist. Die AAT Expression im Gehirn war im Gegensatz zu den anderen untersuchten Geweben schon im Alter von 8 und nicht erst mit 12 Wochen deutlich erniedrigt. Außer den drei genannten Proteinen war bei HD Mäusen ein weiteres Protein betroffen, MUPs. Die Herunterregulierung des leberspezifischen MUPs Proteins deutet darauf hin, dass zumindest im Mausmodell das Huntingtin Transgen auch die Expression von Proteinen beeinflusst, die im Gehirn nicht vorkommen. Untersuchungen am Menschen mit HD wurden für verschiedene Gehirnregionen durchgeführt (Striatum, der Parietallappen und der vordere Gyrus Cinguli). Ein für Huntington’s Chorea charakteristisches abnormes Spot Muster, welches dem Protein AAT zugeordnet werden konnte, wurde in drei Postmortem Gehirnregionen festgestellt. Diese Beobachtung bildet den Brückenschlag zwischen dem Mausmodell und der Erkrankung beim Menschen.

6.1 Verhinderung von Zelltod durch AAT

6.1.1 Aufgabe von AAT im Organismus

AAT ist ein Protein, das hauptsächlich in der Leber produziert wird und bei der Akutphasenantwort mitwirkt [106], d. h. es wird in dem Bestreben sekretiert, bleibenden Gewebeschaden nach Beschädigung des Gewebes zu vermeiden [106]. Im Gehirn wird [Seite 88↓]AAT hauptsächlich von Astrozyten produziert [107].

6.1.2 Charakterisierung und Bewertung der AAT Expression bei HD bei Maus und Mensch

AAT nimmt in der Expression bei Maus und Mensch während des Krankheitsverlaufes ab.

6.1.2.1 Maus

Gestützt auf die Literaturdaten über das Fortschreiten der Erkrankung [22, 60, 61], scheint die Abnahme von AAT im Alter von acht Wochen (Abb. 10 und Tab. 6) im Gehirn ein späterer Vorgang zu sein, welcher mit einer Zunahme des Schweregrades der Erkrankung einhergeht. Die Anzahl der unterschiedlich stark exprimierten AAT Spots und der Gesamtanzahl der AAT Spots (unterschiedlich/gesamt) unterscheidet sich in Gehirn (3/3), Leber (5/7), Testes (7/7) und Herz (7/7) und es scheinen im Mausmodell mehrere Isoformen beteiligt zu sein (AAT 1-4 und AAT 1-5). Trotz der unterschiedlichen Zahl der exprimierten Spots ist festzustellen, dass die Expression von allen Isoformen und Spots im Verlauf der Erkrankung abnimmt. Die Abnahme der Expression des SERPINS CTS könnte, da es mit AAT zumindest eine gemeinsame Spezifität besitzt [108] und eine 44 %ige Sequenzidentität aufweist [109], die gleichen Ursachen haben wie die von AAT.

6.1.2.2 Mensch

Es konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass sich die AAT Expression im Striatum und dem Parietallappen zwischen postmortem HD-, im Endstadium der Erkrankung, und Kontrollgehirnen unterschied (Abb. 12). Dies steht in Einklang mit der Beobachtung, dass bei HD, mit fortschreitender Erkrankung, vor allem das Striatum von einem Verlust an Neuronen und Atrophie betroffen ist [54, 110]. Die Untersuchung eines früheren Stadiums der Erkrankung könnte nun Aufschluss über den zeitlichen Verlauf der Erkrankung geben. Ein frühes Stadium der Erkrankung kann durch den vorderen Gyrus Cinguli simuliert werden. Es hat sich gezeigt, dass dieser selbst bei Grad 3 und 4 Gehirnen (Tab. 7) nach makroskopischer Begutachtung (Untersuchung durchgeführt am: Harvard Brain Tissue Resource Center) morphologisch nicht von Atrophie betroffen war. Er bildet somit ein Modell für mögliche pathologische Veränderungen, die bei der Proteinexpression vor allem im Striatum zu Beginn der Erkrankung auftreten. Es konnte in dieser Studie nachgewiesen werden, dass nur zwei von vier der untersuchten vorderen Gyrus Cinguli [Seite 89↓]Probenpaare ein verändertes AAT Expressionsmuster wie im Striatum aufwiesen (Abb. 12, Abb. 13 und Tab. 7). Dies deutet darauf hin, dass die Expressionsveränderung von AAT mit stärkerer Ausprägung der Erkrankung im Gewebe zunimmt. Der Rückgriff auf ein Modell wurde notwendig, da Gehirngewebe aus frühen Stadien der Erkrankung beim Menschen selten und schwer zugänglich ist, sodass eine ausreichende Probenanzahl nicht gewährleistet werden konnte.

6.1.3 Differentielle Expression unterschiedlicher AAT Varianten bei Mensch und Maus

6.1.3.1 Zwei Proteinisoformen von AAT bei Maus und Mensch repräsentieren zwei Zustände im gleichen Prozess

AAT wurde in der Maus und im Menschen mit unterschiedlichem pI und Molekulargewicht identifiziert. Das bei der Maus differentiell exprimierte AAT besitzt ein Molekulargewicht von 61 kDa. Es handelt sich wahrscheinlich um die unprozessierte Form des Proteins mit 46 kDa und 413 Aminosäuren. Die Ursache für das um 15 kDa erhöhte Molekulargewicht in der SDS-PAGE ist wahrscheinlich die globuläre Konformation von AAT. Diese Konformation führt zu einer verminderten Bindung von SDS und demzufolge zu einer geringeren Mobilität bei der SDS PAGE [111]. Das sechs AAT-Spots umfassende Muster beim Menschen besitzt einen um 0,6 pH Einheiten niedrigeren pI Wert und ein ungefähr um 20 kDa geringeres Molekulargewicht. Selbst die Entfernung der angenommenen Signalsequenz bei AAT, welche aus den Aminosäuren 1 – 24 besteht, durch Prozessierung des Proteins, würde nur zu einer geringfügigen Molekulargewichtsverminderung des Proteins auf 43 kDa und keiner signifikanten pI-Wert Änderung führen [103]. Die für die geringere SDS Bindung verantwortliche Proteinstrukturelemente würden durch die Abtrennung der Signalsequenz somit wahrscheinlich kaum oder gar nicht verändert, sodass die beobachtete Masse von ca. 60 kDa ungefähr gleich bleiben sollte. Die Erklärung für das in der PAGE beobachtete Molekulargewicht von 40 kDa muss also eine andere sein. Es ist in der Literatur bereits beschrieben worden, dass AAT in Gegenwart von Heparin und Glukose gespalten wird. Das Protein Fragment, welches nach der Spaltung auftrat, hatte ein Molekulargewicht von 45 kDa (durch SDS-PAGE bestimmt) [112] was im Bereich des gefundenen 40 kDa Proteins liegt. Beim Menschen könnte also eine Prozessierung oder Abbau von AAT durch [Seite 90↓]Proteasen im Verlauf der Erkrankung stattfinden, deren genauer Mechanismus jedoch unbekannt ist. Obwohl das Spotmuster von AAT sich bei der Erkrankung beim Menschen und dem R6/2 Mausmodell unterschieden, bedeutet dies nicht zwangsläufig, dass bei den beiden Spezies AAT auf unterschiedliche Weise wirkt. Aufgrund des unterschiedlichen Zeitrahmens, in dem die Erkrankung bei den beiden Spezies abläuft (Maus 8 Wochen; Mensch 10 bis 15 Jahre), könnte sich die Kinetik der AAT Expression unterscheiden. Es besteht die Möglichkeit, dass die 61 kDa Isoform beim Menschen, aufgrund einer langsameren AAT Abnahme, unverändert hoch exprimiert wird. Die beim Menschen gefundene kleinere AAT Isoform könnte in der kurzen Krankheitsdauer bei der Maus in zu geringen Mengen gebildet werden, damit eine veränderte Expression nachweisbar ist. Das Doppelspotmuster wurde auch bei einer Kontrolle (B3813) des vorderen Gyrus Cinguli gefunden. Bei dieser Kontrolle wurde eine frische Einblutung im zerebralen und subarachnoiden Raum und eine moderat akute Enzephalopathie des hypoxisch-ischämischen Typs mit erhöhter GFAP Expression (Abb. 13) diagnostiziert. Es scheint deswegen vorstellbar, dass das Auftreten dieses AAT Musters bei Mäusen und Menschen möglicherweise zu einem allgemeineren Mechanismus des Gehirns gehört, vielleicht eine akutphasenartige Antwort, um mit übermäßigem Stress und Gewebeschädigung fertig zu werden.

6.1.3.2 Gemeinsamer Wirkmechanismus für AAT in humanem und murinem HD trotz unterschiedlicher Anzahl an AAT Proteinen zwischen den Spezies

Im Gegensatz zu einem einzelnen menschlichen AAT Gen wurde gezeigt, dass Mäuse, die zur Spezies Mus Musculus gehören, mindestens fünf Gene besitzen [113]. In C57Bl/6 Mäusen befinden sich sowohl zwei „orthodoxe“ Gene, mit dem Menschen gleichender Aminosäuresequenz im reaktiven Zentrum, als auch drei „unorthodoxe“ Gene mit abweichender Sequenz, auf Chromosome 12. Das reaktive Zentrum eines SERPINS ist die Region wo die Serinprotease zwischen der variablen Aminosäure an Position P1’ und dem konservierten Serin an Position P1 schneidet, bevor sie einen unauflöslichen, hemmenden Komplex mit dem SERPIN formen kann [113, 114]. Die Aminosäure an Position P1’ variiert zwischen Methionin (einzige beim Menschen an dieser Position vorkommende Aminosäure, darum „orthodox“) Thyrosin oder Leuzin (beide nicht menschähnlich, deshalb nicht orthodox) [113]. Die in der Studie gefundenen AAT Varianten, AAT 1-4 und [Seite 91↓]AAT 1-5, gehören zu Genprodukten der unorthodoxen Gene. Die abweichenden Sequenzen im reaktiven Zentrum lassen vermuten, dass es Unterschiede in der Proteasespezifität zwischen dem menschlichen und dem murinen AAT geben könnte [115] und die Proteine an zwei unterschiedlichen Prozessen in HD beteiligt sind. Es gibt jedoch Anhaltspunkte, dass dies nicht so ist. In der vorliegenden Studie wurde, neben AAT, die Verminderung der Expression eines weiteren SERPINS, CTS, in vier Geweben von R6/2 (Gehirn, Herz, Testes und Leber) nachgewiesen. Die verminderte Expression von zwei verschiedenen SERPINEN, wie AAT und CTS deutet darauf hin, dass eine sich überschneidende hemmende Aktivität oder ein anderer, beiden SERPINEN gemeinsamer Mechanismus im pathologischen Prozess von HD gestört ist, der nicht an eine bestimmte SERPIN Spezifität im reaktiven Zentrum gebunden ist. Außerdem konnte bereits gezeigt werden, dass beide Inhibitoren ein gemeinsames hemmendes Potential gegenüber einer Protease, Trypsin, aber nicht anderen Proteasen, Elastase aus dem Schwein, Trypsin aus dem Rind und Chymotrypsin, besitzen [108]. Dies könnte auch auf humanes und murines AAT zutreffen.

6.1.4 Mechanismus der Zelltodhemmung durch AAT

Nachdem nun nachgewiesen werden konnte, dass die Expression von AAT bei HD sich im Verlauf der Erkrankung ändert war es interessant zu untersuchen welche Rolle AAT bei der Erkrankung spielen könnte. AAT wurde bereits mit der Pathologie von Alzheimer, eine weitere schwerwiegende, neurodegenerative Erkrankung, in Zusammenhang gebracht. Es kommt in senilen Plaques vor und schützt vor der Toxizität von amyloiden Peptiden [107, 116]. AAT schützt die Tumorzellinie I5, welche aus Inselzellen des Pankreas der Ratte hervorgegangen ist, in Gegenwart der Peptide Aβ1-42, Aβ1-40 und Aβ25-35, deren fehlgeleitete Generierung bei Alzheimer toxisch wirkt, vor Zelltod. Zur Aufrechterhaltung der Schutzfunktion war die protease-hemmende Wirkung wichtig [116]. Die Zelltod-hemmende Wirkung von AAT könnte darauf beruhen, dass dieses den Abbau der extrazellulären Matrix (gezeigt bei vaskulären, glatten Muskelzellen) hemmt. Dies wiederum verhindert die Aktivierung von Kaspasen und verringert so den Zelltod [117]. Es gibt noch weitere Hinweise, dass bei der Zelltodverhinderung durch AAT, die indirekte Hemmung von Kaspasen, die bei Apoptose eine wichtige Funktion haben [24], eine Rolle spielt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass hohe Konzentrationen von AAT, die Aktivierung der Kaspasen 1 und 3 in einem Ischämie/Reperfusions-Experiment in der [Seite 92↓]Niere [118] und Kaspasen 3 und 7 bei einem experimentell mit D-(+)-Galaktosamine induzierten Hepatitis Modell [119], hemmen konnten. Die Kaspasen 1 und 3 waren im Gehirn von R6/2 Mäusen im Alter von 7 Wochen hochreguliert [44], ungefähr zu einem Zeitpunkt, bei dem die AAT Expression bei R6/2 Mäusen abnimmt (Abb. 10 und Tab. 6). Auch der Gewichtsverlust beim Gehirn von R6/2 Mäusen [33] begann ungefähr zur gleichen Zeit wie die verminderte AAT Expression (Abb. 10 und Tab. 6). AAT kann nicht direkt „upstream“ oder „downstream“ von Prokaspase 3 oder 7 wirken, da das Protein kein hemmendes Potential für rekombinante Kaspasen besitzt und auch keine hemmende Wirkung bei TNF Zytotoxizitätsassays zeigte [120]. Die Relevanz der Kaspasehemmung bei HD wird dadurch unterstrichen, dass Kaspasen in R6/2 Gehirnen differentiell reguliert sind [44, 53]. In HD Gehirnen wurden Anzeichen für apoptosetypische DNA Fragmentierung gefunden [47, 48]. Huntingtin mit einer pathologischen Anzahl von Glutaminwiederholungen verursacht Apoptose „in vitro“ [36]. Bis jetzt gibt es jedoch noch keine „in vivo“ Daten, welche dies für HD im Mausmodell oder beim Menschen bestätigen [23] (siehe auch 1.3). Außerdem wurde bereits in einer Studie festgestellt, dass Neuronen sowohl in R6/2 Mäusen als auch in „juvenile Onset“ HD Fällen an einer weder Nekrose noch Apoptose zuzuordnende Art von Zelltod sterben [23].

6.2 Verminderte ABC Expression im Verlauf der Erkrankung

In der vorliegenden Untersuchung geht die stark verringerte ABC Expression im Alter von acht Wochen (Abb. 11 und Tab. 6) mit dem verstärkten Auftreten von neuropilen Aggregaten bei R6/2 Mäusen einher [22]. Es ist interessant, dass diese Verminderung von ABC im Gehirn, nicht aber im Herzen beobachtet werden konnte (Abb. 11 und Tab. 6 vs. Abb. 18). Dies könnte einerseits damit zusammenhängen, dass der Verlauf der Erkrankung in verschiedenen Organen unterschiedlich ist oder dass der Expressionslevel von ABC im Herzen viel höher als im Gehirn ist (Abb. 18 vs. Abb. 7 und 11). Abb. 18 zeigt jedoch nicht zu unterscheidende Spotintensitäten bei drei repräsentativen Probenpaaren im Herzen bei R6/2 und Kontrolle. Die Intensitäten der umgebenden Spots zeigen auch keine Unterschiede, sodass die organspezifische Abnahme der Expression sehr viel wahrscheinlicher ist. Es konnte auch bereits gezeigt werden, dass die Konzentration von ABC bei kardiovaskulären Erkrankungen im Herzen ansteigt und es möglicherweise zu schnellen posttranslationalen Modifizierung kommt [121]. Da Erkrankungen im [Seite 93↓]Allgemeinen Stress für das betroffene Gewebe bedeuten, ist es möglich, dass auch bei Gehirnerkrankungen die Expression von ABC aufgrund des Stresses ursprünglich ansteigt, das Protein in seinem Bestreben Aggregation zu verhindern, jedoch von den gebildeten Aggregaten weggefangen wird. Die sich unterscheidende ABC Isoform konnte nicht in allen untersuchten Geweben nachgewiesen werden. Sie wurde im Gehirn (Abb. 7, 11, Tab. 6 und 9 A) und Herzen, aber nicht in Milz, Leber und Testes gefunden (Tab. 8A und 9 A). Der Unterschied im isoelektrischen Punkt von 0,6 pH-Einheiten zum berechneten Wert wurde bereits bei humanem Myokardiumgewebe aus dem Atrium [102] mit Hilfe der 2D Gelelektrophorese gefunden. Diese Werte wurden mit der gleichen Methode in myokardialen Proteinen aus der Ratte bestätigt [122]. Auch das gefundene Molekulargewicht von ungefähr 22 kDa wurde in diesen Studien bestätigt. Die pI-Veränderung könnte aufgrund einer posttranslationalen Modifikation mit einer Ladungsveränderung (z. B. Phosphorylierung) zustande gekommen sein. Aus der Literatur ist bereits bekannt, dass ABC als Chaperon [123] fungiert und durch Hitze und andere Stressfaktoren induziert werden kann. Dies geschieht, um die Hitzetoleranz von Zellen zu erhöhen, wie das auch andere Proteine, die zur Gruppe der kleinen Hsp gehören, vermögen [124]. Auf mRNA Ebene wird ABC in vielen verschiedenen Geweben exprimiert [125]. Im gesunden Gehirn wird ABC von Zellen in den tieferen Schichten der weißen Materie exprimiert [85]. Nach TNF-α Stimulation von humanen Astrozyten ist eine Expression von ABC zu beobachten [126]. Eine Hochregulation der Expression von ABC wurde auch bei pathologischen Veränderungen, wie z.B. Gehirntumoren, gefunden [127]. ABC wurde aufgrund seiner „Entwirrungseigenschaften“ mit der frühen Abwehr gegenüber beschädigten oder in Unordnung geratenen intermediäre Filamenten, welche zur Bildung von Inklusionen führen können, in Zusammenhang gebracht [82]. Es könnte möglich sein, dass dieses Protein dafür verantwortlich ist, Proteine wie das N-terminale Fragment von Huntingtin von der Präzipitation in intranukleäre, neuronale Einschlüsse abzuhalten [22, 31, 33]. Der Mangel an ausreichend ABC, welcher spätestens ab dem Alter von 8 Wochen bei R6/2 Mäusen im Gehirn auftrat (Abb. 11 und Tab. 6), könnte aus diesem Grund zur vermehrten Bildung von Aggregaten beitragen wie dieser bei R6/2 Mäusen ab dem Alter von ungefähr vier Wochen beobachtet wurde [22, 33]. Dieser Mangel könnte auf einen schnelleren Verbrauch von ABC durch die Aggregate und/oder eine geringere Expression bei erhöhtem Schweregrad der Erkrankung, zurückzuführen sein. Bei anderen, kleinen Hsp, wie zum Beispiel Hsp 70 und Hsp 40 konnte bereits gezeigt werden, dass sie das [Seite 94↓]Auftreten von fibrillären Strukturen, gebildet durch Htt, hemmen [83]. Eine kürzlich veröffentlichte Studie mit den kleinen Hsp Hsp40, Hsp70 und NSF (n-ethylmaleimide sensitive factor) zeigt, dass diese kleinen Hsp Kaspase 3 und 9 hemmen, obwohl nur Hsp40 die Bildung von Aggregaten signifikant inhibierte [128]. Ein kaspasehemmendes Potential wurde auch bei AAT gefunden, was einen möglichen synergistischen Effekt beider Proteine bei der Verhinderung von Zelltod bei HD nahe legt [118, 120].

6.3 Veränderte MUPs Expression bei transgenen R6/2 Mäusen

Die Expression einer Gruppe von Isoformen eines Proteins, die Major Urinary Proteins (MUPs), von denen kein homologes Protein beim Menschen bekannt ist, war in der Leber (Abb. 21 und Tab. 9B) und im Urin (Abb. 22) von Mäusen im Alter von 12 Wochen stark reduziert. Es ist bereits bekannt, dass dieses Protein leberspezifisch exprimiert wird [129]. Die Expression ist in männlichen beträchtlich höher als in weiblichen Mäusen [130]. Die Proteinisoformen von MUPs haben ein Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa, und bilden eine β-Barrel Struktur aus, welche einen hydrophoben Hohlraum umschließt [131]. Dieser Hohlraum dient zum Beispiel als Bindungsstelle für 3,4-Dehydro-Exo-Brevicomin und 2-Sec-Butyl-4,5-Dihydrothiazole [132]. Das Binden an MUPs erlaubt es diesen leicht flüchtigen Liganden, über einen längeren Zeitraum von getrocknetem Urin freigesetzt zu werden [132]. Die Freisetzung dieser Liganden vermittelt den Aggressivitätsstatus eines Männchens an andere Männchen [133] und stimuliert den Eisprung bei Weibchen [134]. Daraus lässt sich ableiten, dass R6/2 Männchen nahe dem Endstadium der Erkrankung nicht länger die Aufmerksamkeit von Weibchen durch Duftmarken auf sich ziehen können, was ihren Erfolg bei der Reproduktion zusätzlich zur Testesatrophie [63] stark vermindert [41]. Erkennung der Individualität bei Mäusen scheint auch vom Vorhandensein der MUPs Proteine abzuhängen, so dass eine Verringerung in der Konzentration dieser Proteine im Urin das Sozialverhalten der Mäuse beeinträchtigen könnte [133]. Es ist bereits bekannt, dass das Gewicht der Testes in transgenen Mäusen beginnt ab dem Alter von ca. acht Wochen abzunehmen [63], was ungefähr mit dem Beginn der Abnahme der MUPs Konzentration im Urin zusammenfällt. Es konnte bereits bei Ratten gezeigt werden, dass die MUPs-Expression, bei einem experimentellen Modell für Schlaganfall, herunterreguliert war [135]. Dies könnte bedeuten, dass dieses Protein empfindlich gegenüber vielfältigen krankhaften Veränderungen bei Mäusen und Ratten ist und dafür [Seite 95↓]sorgt, dass sich kranke Tiere nicht weiter vermehren können. MUPs ist leicht für die Analyse durch Urinprobenentnahme zugänglich. Aus diesem Grund könnten dieses Protein als Marker bei R6/2 Mäusen verwendet werden, um pharmakologische Substanzen auf ihre Wirksamkeit für die Behandlung von HD zu screenen.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
10.03.2005