Veränderungen im Proteom von Maus und Mensch durch Huntington’s Chorea

D i s s e r t a t i o n

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

Von
Dipl. Ing. Claus Zabel
geboren am 18. März 1970 in Marktoberdorf

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Mlynek

Dekan:
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. rer. nat. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. Harald Saumweber
2. Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. Joachim Klose
3. Prof. Dr. rer. nat. Hanspeter Herzel

Tag der mündlichen Prüfung: 17. Januar 2003

Zusammenfassung

Die Erkrankung Huntington’s Chorea ist eine autosomal dominant vererbte Erkrankung, die gewöhnlich im mittleren Lebensabschnitt beginnt und unausweichlich zum Tode führt. In unserem Bestreben, Proteine zu identifizieren, welche an Prozessen „Upstream“ oder „Downstream“ des krankheitsverursachenden Proteins Huntingtin beteiligt sind, wurde das Proteom eines sehr gut etablierten Mausmodells mit Hilfe der Großgel 2D-Elektrophorese untersucht. Es konnte zum ersten Mal auf Proteinebene nachweisen werden, dass die Expression von zwei Serinproteasehemmern, α1-Antitrypsin und Contraspin und darüber hinaus eines Chaperons, αB-Kristallin, im Verlauf der Erkrankung abnimmt. Reduzierte Expression von α1-Antitrypsin und Contraspin konnte in Gehirn, Leber, Herz und Testes nahe dem Endstadium der Erkrankung nachgewiesen werden. Hier ist es wichtig festzustellen, dass die Expressionsabnahme von α1-Antitrypsin im Gehirn der Abnahme in der Leber im Herzen und in den Testes vorangeht. Eine verminderte Expression des Chaperons αB-Kristallin wurde nur im Gehirn gefunden. Für ein weiteres Protein, das Major Urinary Protein, wurde eine verminderte Expression in der Leber und im Urin von betroffenen Mäusen festgestellt. Damit konnte demonstriert werden, dass die Erkrankung auf Proteinebene auch ein Protein, das im Gehirn von transgenen Mäusen nicht vorkommt, beeinflusst. Bei Untersuchungen am Menschen wurde in drei Gehirnregionen von Postmortem-Gehirnen von Huntington’s Chorea Patienten eine veränderte Expression von α1-Antitrypsin festgestellt. Wenn gewährleistet werden kann, dass die Konzentration von α1-Antitrypsin und αB-Kristallin während Huntington’s Chorea im Gewebe nicht absinkt, könnte dies vielleicht neuronalen Zelltod verhindern und somit bei der Verzögerung des Krankheitsverlaufs nutzbringend eingesetzt werden.

Eigene Schlagworte: α1-Antitrypsin, Contraspin, αB-Kristallin, Huntington’s Chorea, R6/2, Chaperon, Serin-Protease-Hemmer, MUPs, Großgel 2D-Elektrophorese

Abstract

Huntington disease is an autosomal dominantly inherited disease that usually starts in midlife and inevitably leads to death. In an effort to identify proteins involved in processes upstream or downstream of the disease causing huntingtin, the proteome of a well-established mouse model was studied by large-gel 2D electrophoresis. It could be demonstrated for the first time at the protein level that two serin protease inhibitors, α1-antitrypsin and contraspin and the chaperone αB-crystallin decrease in expression over the course of disease. Importantly, the α1-antitrypsin decrease in the brain precedes that in liver, heart and testes in mice. Reduced expression of α1-antitrypsin and contraspin could be detected in the brain, liver heart and testes close to terminal disease. Decreased expression of the chaperone αB-crystallin was found exclusively in the brain. Reduced expression of the liver specific major urinary proteins not found in the brain, was seen in affected mice, demonstrating that the disease exerts its influence on a protein not present in the brain of transgenic mice at the protein level. When investigating three human brain regions obtained post-mortem from Huntington’s disease patients, α1-antitrypsin expression was also altered. Maintaining α1-antitrypsin and αB-crystallin availability during the course of Huntington’s disease might prevent neuronal cell death and therefore could be useful in delaying the disease progression.

Keywords: α1-antitrypsin, contraspin, αB-crystallin, Huntington’s disease, R6/2, chaperone, serine protease inhibitor, MUPs, large-gel 2D electrophoresis

Widmung

Für Christina

Inhaltsverzeichnis

• Vorwort
• 1  Einleitung
  • 1.1 Neurodegenerative Erkrankungen hervorgerufen durch verlängerte Poly-Glutamin-Wiederholungen
  • 1.2 Die Erkrankung HD
  • 1.3  Ursache der Neurodegeneration bei HD
    • 1.3.1  Zelltod bei Neuronen durch toxische Peptidfragmente
      • 1.3.1.1 Toxische Peptidfragmente sind nur eines von vielen Signalen die Apoptose in der Zelle auslösen können
      • 1.3.1.2  Verlauf der Apoptose in der Zelle
      • 1.3.1.3 Mechanismen, die das Überleben der Zelle sichern
    • 1.3.2 Neurodegeneration als Folge von verstärktem Widerstand von mutiertem Htt gegenüber Proteolyse
    • 1.3.3 Bewertung der „toxischen Peptid“ und der „verminderte Proteolyse“ Hypothese
  • 1.4  Mausmodelle für die Erkrankung Huntington’s Chorea
    • 1.4.1 Mausmodelle für HD mit „Knock in“ von „Full length“ IT15 mit expandiertem CAG
    • 1.4.2 Mausmodelle generiert durch verkürzte Fragmente von IT15 mit expandierten CAG Wiederholungen
    • 1.4.3 Expressionsveränderung auf RNA Niveau bei R6/2 Mäusen
    • 1.4.4 Veränderung bei R6/2 Mäusen auf der Proteinebene
  • 1.5 Durchführung einer Proteomics Studie für HD
    • 1.5.1 Allgemeine Grundlagen für eine Proteomics Studie
    • 1.5.2 Eingrenzung der Vielfalt bei der Proteomics Studie
    • 1.5.3 Auswahl eines geeigneten Modellsystems für HD
    • 1.5.4 Verfügbarkeit der Proben bei Maus und Mensch
    • 1.5.5 Erkenntnisgewinn aus einer Proteomics Studie
• 2 Zielsetzung
• 3 Ergebnisse der Dissertation im Überblick
• 4  Materialien und Methoden
  • 4.1 Tiere und Gewebe
  • 4.2 Gewinnung von Gehirnregionen und anderen Geweben
  • 4.3 Herstellung von Proteinproben
    • 4.3.1 Konzept
    • 4.3.2 Durchführung der Proteinextraktion
      • 4.3.2.1 Plasmatische Fraktion
      • 4.3.2.2 Membranfraktion
      • 4.3.2.3 Kernfraktion
      • 4.3.2.4 Körperflüssigkeiten
  • 4.4 Großgel 2D-Elektrophorese
    • 4.4.1 Die erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung (IEF)
      • 4.4.1.1 Reinigung der 1D Gelröhrchen
      • 4.4.1.2 Herstellung der 1D Gele
      • 4.4.1.3 Probenauftrag und IEF Lauf
    • 4.4.2  Die zweite Dimension: Großgel SDS-PAGE
      • 4.4.2.1 Gießen der Separationsgele
      • 4.4.2.2 SDS-PAGE Lauf
  • 4.5 Anfärbung der Proteine
    • 4.5.1 Saure Silberfärbung zur Spoterkennung
    • 4.5.2 Coomassie Brillant Blue G250 Färbung zur Spotidentifizierung
  • 4.6 Trocknung der 2D Gele
  • 4.7 Spoterkennung
  • 4.8  In-Gel Verdau
  • 4.9 MALDI-TOF-Massenspektrometrie
  • 4.10 Datenbanksuche auf Grundlage der Peptidmassenfingerabdruck-Spektren
  • 4.11 Automatische Interpretation der Fragmentionen Spektren:
• 5  Ergebnisse
  • 5.1 Untersuchung des Gehirnproteoms bei der Maus und beim Menschen
    • 5.1.1  Differentielle Proteinexpression nahe dem Endstadium der Erkrankung im Gehirn bei der Maus
      • 5.1.1.1 R6/2 Mausgehirne zeigen keine Expression von α1-Antitrypsin 1-5 nahe dem Endstadium der Erkrankung
        • 5.1.1.1.1 α1-Antitrypsin1-5 ist in der zytoplasmatischen Fraktion von R6/2 Mäusen nicht mehr nachweisbar
        • 5.1.1.1.2 α1-Antitrypsin in Membran- und Kernfraktion
      • 5.1.1.2 Verminderte Expression von Contraspin im Gehirn von R6/2 Mäusen
      • 5.1.1.3 R6/2 Mausgehirne nahe dem Endstadium der Erkrankung zeigen eine reduzierte Expression von αB-Kristallin
        • 5.1.1.3.1 Verminderte Expression von αB-Kristallin in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion
        • 5.1.1.3.2 Geringere Expression von ABC nahe dem Endstadium der Erkrankung bei R6/2 Mäusen auch in der Membran- und Kernfrakion
    • 5.1.2 Expression von AAT 1-5 und ABC während des Krankheitsverlaufes bei der Maus
      • 5.1.2.1 Verminderung der Expression von AAT 1-5 mit dem Fortschreiten der Erkrankung
      • 5.1.2.2 Verminderung der Expression von ABC mit dem Fortschreiten der Erkrankung
    • 5.1.3 Untersuchung der Geschlechtsspezifität der Expression der differentiell exprimierten Proteine bei der Maus
      • 5.1.3.1 Geringere Expression von AAT 1-5 in weiblichen als in männlichen Mäusen
      • 5.1.3.2 Gleiches Expressionsniveau von ABC in weiblichen und männlichen Mäusen
    • 5.1.4 Veränderte Proteinexpression im Endstadium der Erkrankung beim Menschen
      • 5.1.4.1 Veränderte Expression von AAT bei HD postmortem Gehirnen
      • 5.1.4.2  Expression von ABC ist im menschlichen Gehirn nicht nachweisbar
  • 5.2 Expression von krankheitsrelevanten Proteinen in verschiedenen Geweben
    • 5.2.1 Voruntersuchung zur Expression von AAT 1-5 und ABC in verschiedenen Geweben und Gehirnregionen
      • 5.2.1.1 Expression von AAT 1-5 in unterschiedlichen Geweben
      • 5.2.1.2 ABC Expression in unterschiedlichen Geweben
    • 5.2.2  Untersuchung der differentiellen Proteinexpression im Herzen
      • 5.2.2.1 Verringerte Expression von AAT im Herzen von R6/2 Mäusen
      • 5.2.2.2 Verminderte Expression von Contraspin im Herzen von R6/2 Mäusen
      • 5.2.2.3  Gleiche Expression von ABC in R6/2 – und Kontrollmäusen
      • 5.2.2.4 Expression von AAT und CTS im Verlauf der Erkrankung
    • 5.2.3 Untersuchung der differentiellen Expression von AAT, CTS und ABC in den Testes
      • 5.2.3.1 Verminderte Expression von AAT in den Testes von R6/2 Mäusen
      • 5.2.3.2 Verminderte CTS Expression in den Testes von R6/2 Mäusen
      • 5.2.3.3 Verminderte Expression von AAT und CTS im Verlauf der Erkrankung
    • 5.2.4 Untersuchung der differentiellen Expression von AAT, CTS und ABC in der Leber
      • 5.2.4.1 Verminderte Expression von AAT in der Leber von R6/2 Mäusen
      • 5.2.4.2 Verminderte CTS Expression in der Leber von R6/2 Mäusen
      • 5.2.4.3 Stark verminderte Expression von Major Urinary Proteins in der Leber von R6/2 Mäusen
      • 5.2.4.4 Expression von AAT, CTS und MUPs im Krankheitsverlauf
    • 5.2.5  Zusammenfassung der Ergebnisse aus der Untersuchung verschiedener Gewebe
• 6  Diskussion
  • 6.1 Verhinderung von Zelltod durch AAT
    • 6.1.1 Aufgabe von AAT im Organismus
    • 6.1.2 Charakterisierung und Bewertung der AAT Expression bei HD bei Maus und Mensch
      • 6.1.2.1 Maus
      • 6.1.2.2 Mensch
    • 6.1.3 Differentielle Expression unterschiedlicher AAT Varianten bei Mensch und Maus
      • 6.1.3.1 Zwei Proteinisoformen von AAT bei Maus und Mensch repräsentieren zwei Zustände im gleichen Prozess
      • 6.1.3.2 Gemeinsamer Wirkmechanismus für AAT in humanem und murinem HD trotz unterschiedlicher Anzahl an AAT Proteinen zwischen den Spezies
    • 6.1.4 Mechanismus der Zelltodhemmung durch AAT
  • 6.2 Verminderte ABC Expression im Verlauf der Erkrankung
  • 6.3 Veränderte MUPs Expression bei transgenen R6/2 Mäusen
• 7  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Anhang
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eigene Veröffentlichungen
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Pathologie bei HD – Basis, Phänotyp, Pathologie und molekulare Grundlagen
• Tab. 2: Zusammenfassung der Arbeitsschritte für die Proteinextraktion in verschiedenen Geweben
• Tab. 3: Chemische Zusammensetzung des Separationsgels
• Tab. 4: Chemische Zusammensetzung des Capgels
• Tab. 5: Chemische Zusammensetzung von SDS-PAGE Gelen
• Tab. 6: Expression von AAT 1-5 und ABC im Verlauf der Erkrankung
• Tab. 7: Beschreibung der menschlichen HD und Kontrollgewebe und Blutplasmaproben
• Tab. 8: Verteilung von AAT 1-5 und ABC im Gewebe und in Gehirnregionen. Verteilung im Gewebe (Oben). : Verteilung in den Gehirnregionen von weiblichen Mäusen (Unten)
• Tab. 9: Differentielle Proteinexpression in verschiedenen Geweben. Expression von AAT 1-5 in verschiedenen Geweben[a] (Oben). Expression von MUPs im Krankheitsverlauf (Unten).
• Tab. 10: Expression der beiden CTS Isoformen. 70 kDa Isoform in verschiedenen Geweben (Oben). 170 kDa Isoform im Herzen (Unten).
• Tab. 11: Zusammenstellung des Expressionsniveaus von Proteinen, welche HD-spezifisch verändert wurden nahe dem Endstadium der Erkrankung^[a]
• Tab. 12: Identifizierung von Proteinspots, welche sich in ihrer Expression zwischen zwei HD Patienten in Abhängigkeit von Geschlecht und Gehirnregion unterscheiden.
• Tab. 13: Untersuchung der HD-spezifischen Spotunterschiede beim vorderen Globus Cinguli bei post-mortem Gehirnen von vier weiblichen HD Patienten.

Bilder

• Abb. 1: Neurotransmitterrezeptoren bei HD
• Abb. 2: Speziesübergreifende Ähnlichkeit der Spotmuster und Vergleich der Reproduzierbarkeit bei der Spezies Maus und Mensch
• Abb. 3: Großgel 2D Elektrophorese: Erste und zweite Dimension
• Abb. 4: AAT 1-5 Expression im Gehirn bei R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion.
• Abb. 5: Expression von AAT1-5 in der Membranfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.
• Abb. 6: Expression von AAT 1-5 in der Kernfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.
• Abb. 7: Expression von ABC im Gehirn von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion.
• Abb. 8: ABC Expression in der Membranfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.
• Abb. 9: ABC Expression in der Kernfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.
• Abb. 10: AAT Expression im Verlauf der Erkrankung.
• Abb. 11: ABC Expression im Verlauf der Erkrankung.
• Abb. 12: Expression von AAT in drei Regionen von Postmortem-Gehirnen beim Menschen.
• Abb. 13: Expression von AAT im vorderen Gyrus Cinguli bei Postmortem-Gehirnen.
• Abb. 14: Expression von AAT im Blut (Plasma) von einem HD Patienten während der Erkrankung
• Abb. 15: Verteilung der ABC Expression in verschiedenen Gehirnregionen
• Abb. 16: AAT und CTS Expression im Herzen nahe dem Endstadium der Erkrankung.
• Abb. 17: Expression der 170 kDa Isoform von CTS.
• Abb. 18: Unveränderte Expression von ABC im Herzen nahe dem Endstadium der Erkrankung.
• Abb. 19: Expression von AAT in Testes nahe dem Endstadium der Erkrankung
• Abb. 20: Expression von AAT und CTS in der Leber während des Endstadiums der Erkrankung.
• Abb. 21: MUPs Expression in der Leber nahe dem Endstadium der Erkrankung
• Abb. 22: Stark reduzierte MUPs Expression im Urin von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung
• Abb. 23: Darstellung der drei Proteinfraktionen am Beispiel der Leber von C57Bl/6 Mäusen