Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Mlynek
Die Erkrankung Huntington’s Chorea ist eine autosomal dominant vererbte Erkrankung, die gewöhnlich im mittleren Lebensabschnitt beginnt und unausweichlich zum Tode führt. In unserem Bestreben, Proteine zu identifizieren, welche an Prozessen „Upstream“ oder „Downstream“ des krankheitsverursachenden Proteins Huntingtin beteiligt sind, wurde das Proteom eines sehr gut etablierten Mausmodells mit Hilfe der Großgel 2D-Elektrophorese untersucht. Es konnte zum ersten Mal auf Proteinebene nachweisen werden, dass die Expression von zwei Serinproteasehemmern, α1-Antitrypsin und Contraspin und darüber hinaus eines Chaperons, αB-Kristallin, im Verlauf der Erkrankung abnimmt. Reduzierte Expression von α1-Antitrypsin und Contraspin konnte in Gehirn, Leber, Herz und Testes nahe dem Endstadium der Erkrankung nachgewiesen werden. Hier ist es wichtig festzustellen, dass die Expressionsabnahme von α1-Antitrypsin im Gehirn der Abnahme in der Leber im Herzen und in den Testes vorangeht. Eine verminderte Expression des Chaperons αB-Kristallin wurde nur im Gehirn gefunden. Für ein weiteres Protein, das Major Urinary Protein, wurde eine verminderte Expression in der Leber und im Urin von betroffenen Mäusen festgestellt. Damit konnte demonstriert werden, dass die Erkrankung auf Proteinebene auch ein Protein, das im Gehirn von transgenen Mäusen nicht vorkommt, beeinflusst. Bei Untersuchungen am Menschen wurde in drei Gehirnregionen von Postmortem-Gehirnen von Huntington’s Chorea Patienten eine veränderte Expression von α1-Antitrypsin festgestellt. Wenn gewährleistet werden kann, dass die Konzentration von α1-Antitrypsin und αB-Kristallin während Huntington’s Chorea im Gewebe nicht absinkt, könnte dies vielleicht neuronalen Zelltod verhindern und somit bei der Verzögerung des Krankheitsverlaufs nutzbringend eingesetzt werden.
Huntington disease is an autosomal dominantly inherited disease that usually starts in midlife and inevitably leads to death. In an effort to identify proteins involved in processes upstream or downstream of the disease causing huntingtin, the proteome of a well-established mouse model was studied by large-gel 2D electrophoresis. It could be demonstrated for the first time at the protein level that two serin protease inhibitors, α1-antitrypsin and contraspin and the chaperone αB-crystallin decrease in expression over the course of disease. Importantly, the α1-antitrypsin decrease in the brain precedes that in liver, heart and testes in mice. Reduced expression of α1-antitrypsin and contraspin could be detected in the brain, liver heart and testes close to terminal disease. Decreased expression of the chaperone αB-crystallin was found exclusively in the brain. Reduced expression of the liver specific major urinary proteins not found in the brain, was seen in affected mice, demonstrating that the disease exerts its influence on a protein not present in the brain of transgenic mice at the protein level. When investigating three human brain regions obtained post-mortem from Huntington’s disease patients, α1-antitrypsin expression was also altered. Maintaining α1-antitrypsin and αB-crystallin availability during the course of Huntington’s disease might prevent neuronal cell death and therefore could be useful in delaying the disease progression.
Für Christina
An der „Redwing Health Clinic“ in Redwing, MN, USA, hängt ein verblassendes Bild in Scotty Redfords Zimmer. Ein junger, gutaussehender Mann in einer „Football-Montur strahlt in die Kamera. Nun, im Alter von 33, vermisst Scotty diese Tage. Als Jugendlicher ein Football Ereignis, wurde bei ihm vor 15 Jahren im Alter von 18 auf Huntington’s Chorea getestet und das Leiden diagnostiziert. Nachdem er mit angesehen hatte, wie seine Mutter verfiel und letztendlich aufgrund der Erkrankung starb, sieht sich Scotty nun mit seiner eigenen schwindenden Muskelkontrolle konfrontiert. Obwohl er immer noch gut aussieht und lächelt, ist er an den Rollstuhl gefesselt und hat Schwierigkeiten beim Sprechen und Essen. Scotty ist einer von ungefähr 30.000 Amerikanern, die diese Krankheit haben, ein im Erwachsenenalter beginnendes, dominant vererbtes Leiden, welches durch den Tod von Neuronen verursacht wird, die den Bewegungsapparat kontrollieren. Ungewollte Muskelbewegungen, Wahrnehmungsbeeinträchtigungen und Verhaltensabnormalitäten kennzeichnen Huntington’s Chorea. ... (aus [1]).
Der Huntington Patient Scott Redford im Alter von 18 (links) und 33 Jahren (rechts) [1].
Neurodegenerative Erkrankungen sind erblich oder sporadisch auftretende Zustände, welche durch fortschreitende Fehlfunktion des Nervensystems gekennzeichnet sind. Diese Erkrankungen sind oft mit der Atrophie (Verkümmerung) der betroffenen zentralen und peripheren Nervensystemstrukturen verbunden [2]. Die am häufigsten vorkommende neurodegenerative Erkrankung ist Alzheimer (AD), von der 7% - 10% aller Menschen über 65 Jahre und ungefähr 40 % der über 80-Jährigen betroffen sind [3]. An Parkinson eine weitere, häufige Gehirnerkrankung leiden in den Vereinigten Staaten von Amerika ungefähr eine Million Menschen [4]. Neben diesen häufigen neurodegenerativen Erkrankungen gibt es seltene, meist auf einzelne Gendefekte zurückzuführende Leiden. Die Ursache einiger dieser Erkrankungen ist die Verlängerung eines instabilen, Trinukleotids, welches sowohl in der kodierenden (Exon), als auch in der nichtkodierenden Sequenz (Intron) liegen kann. Beispiele für das Vorkommen in einem Intron sind das Fragile X Syndrom und die Myotonische Dystrophie [5]. Beim Vorkommen des Trinukleotids in einem Exon, kodiert dieses bei einigen Erkrankungen für die Aminosäure Glutamin [5, 6]. Ein Beispiel für so eine Erkrankung ist Huntington’s Chorea (HD).
Die Zahl der neurodegenerativen Erkrankungen, die auf die Verlängerung einer instabilen Poly-Glutamin-Wiederholung (poly-glutamine-repeat; PGW) zurückgeführt werden kann, wächst ständig. Bisher sind mindestens acht unterschiedliche, sogenannte Polyglutaminerkrankungen bekannt geworden. Diese reichen von der Spinobulbaren Muskulären Atrophie über die Spinozerebralen Ataxien (SCA) bis hin zu HD [6]. HD tritt in einem von 10,000 Menschen auf [7]. An Huntington’s Chorea leiden ungefähr 30.000 Amerikaner [1] und sie ist somit eine der häufigsten, monogenetisch verursachten, neurodegenerativen Erkrankungen.
Die neurodegenerative Erkrankung HD ist eine autosomal dominant vererbte Krankheit, die gewöhnlich im mittleren Lebensabschnitt beginnt und nach ungefähr 15 bis 20 Jahren
An dieser Stelle ist es wichtig festzustellen, dass die ursprünglichen genetischen und umweltbedingten Signale, die den Untergang von Neuronen auslösen, sich bei den verschiedenen physiologischen und pathologischen Zuständen von unterschiedlichen (neurodegenerativen) Erkrankungen unterscheiden mögen, dass aber gemeinsame Mediatoren, Aggregatbildung [6] und toxische Fragmentbildung (AD und HD) [21], existieren. Diese Aggregate finden sich sowohl im Zellkern, als auch im Zytoplasma [22]. Die sich an die Aggregat- und/oder Fragmentbildung anschließenden, biochemischen Abläufe, die während der Neurodegeneration ablaufen, sind apoptoseähnlich und könnten hoch konserviert sein [21]. Die Ursache des Sterbens der Neuronen im Gehirn sowie die Art des Zelltodes bei HD konnte noch nicht genau bestimmt werden [23]. Um eine Vorstellung über den Prozess der Neurodegeneration zu erhalten wird dieser im folgenden anhand seiner Gemeinsamkeiten mit Apoptose im Mausmodell und am Menschen beschrieben. Die bisherigen Daten über den Mechanismus wie Neuronen bei HD sterben sprechen dafür, dass ähnliche Prozesse wie bei Apoptose wichtig sind. Beim Zelltod durch Apoptose spielt die Aktivierung von Kaspasen eine wichtige Rolle. Dies sind Cystein-abhängige Proteasen, die auf der C-terminalen Seite die Peptidbindung bei der Aminosäure Aspartat schneiden [24]. Toxische Fragmente, die möglicherweise von Kaspasen generiert werden, spielen neben HD auch bei Alzheimer eine Rolle und lösen in „in vitro“-Modellen der Erkrankungen Apoptose aus [21]. In der Literatur existieren zwei Haupthypothesen für das Signal das zum Untergang von Neuronen bei HD führt. Nach der ersten Theorie, der „toxischen Peptid“ Hypothese, entstehen nach Kaspasespaltung kleine, N-terminale Fragmente von mutiertem Htt, die eine erhöhte Anzahl an PGW besitzen. Diese Fragmente akkumulieren selektiv im Gehirn von an HD Erkrankten und verursachen aufgrund eines noch nicht genau aufgeklärten Mechanismuses Neurodegeneration [25, 26]. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass Htt mit EPW resistenter gegenüber Proteolyse ist, da sich die Löslichkeitseigenschaften durch die Mutation verändert haben und das Protein nun schwerer löslich ist. Dies erlaubt es dem Protein zu akkumulieren und Proteine aus wichtigen Stoffwechselpfaden und auch Htt mit normaler Anzahl von PGW an sich zu binden und so Neuronen zu schädigen [27].
Für die „toxische Peptid“ Hypothese spricht, dass Peptide bei Postmortem-Gehirnen von HD Patienten und Kontrollen gefunden wurden, die durch eine Spaltung von Htt durch Kaspase 3 entstanden sein könnten [28]. Zuvor wurden bereits potentielle Schnittstellen in Htt für die Kaspasen 3 und 6 nahe dem N-Terminus identifiziert [29, 30]. Es konnte gezeigt werden, dass N-terminale Fragmente im Gehirn von Menschen [31, 32] und Mäusen [33, 34] aggregieren und hierbei durch gehirnregionsspezifische Proteolyse gezielt zytotoxisch wirken könnten [35]. Ein Anhaltspunkt hierfür ist, dass N-terminale Htt Fragmente mit EPW „in vitro“ Apoptose auslösen können [36]. Die „toxische Peptid“ Hypothese mit der Involvierung von Kaspasen wird außerdem von der Beobachtung gestützt, dass sich Kaspase-Inhibitoren positiv auf das Überleben von Zellen bei HD auswirken [29, 36, 37, 38]. Charakteristisch für Apoptose ist neben der Kaspase-Aktivierung oxidativer Stress, gestörte Kalzium Homöostase (Gleichgewicht) und die Fehlfunktion der Mitochondrien [24]. Es gibt Hinweise dafür, dass auch diese Prozesse bei HD eine Rolle spielen.
Signale, welche Apoptosis in Neuronen auslösen sind vielfältig. Beispiele dafür sind der Mangel an neurotrophen Faktoren [39] oder der anregende Neurotransmitter Glutamat, welcher vermittelt durch die ionotrophen Glutamatrezeptoren des Typs AMPA (α-Amino-3-Hydroxy-5-Methyl-4-Isoxazol Propionat) und NMDA (N-Methyl-D-Aspartat), Apoptose auslöst. Bei einem Mausmodell für HD (R6/2) ist die Expression von AMPA während der Erkrankung vermindert [40], was möglicherweise auf eine Herunterregulierung nach übermäßiger Aktivierung des AMPA-Rezeptors zurückzuführen ist. Bei Apoptose spielt Kalziuminflux in die Zelle eine wichtige Rolle. Ein wichtiger Auslöser für neuronalen Zelltod ist auch verstärkter, oxidativer Stress, hervorgerufen durch freie Radikale, wie zum Beispiel dem Superoxid-Anion und dem Hydroxyl Radikal. Bei R6/1 Mäusen, einem weiteren Mausmodell für HD [41] erfolgt eine oxidative Schädigung des Striatums parallel zum neurologischen Phänotyp [42]. Radikale beschädigen zelluläre Lipide [42], Proteine und Nukleinsäuren, indem sie die chemischen Bindungen dieser Moleküle angreifen.
Es gibt zwei bekannte Signalübertragungswege beim Zelltod durch Apoptose. Beide Wege teilen gemeinsame Eigenschaften, wie z. B. molekulare Werkzeuge, welche Kaspasen durch Pro-Enzymrekrutierung, Oligomerisierung und nähe-induzierter Autokatalyse aktivieren. Darüber hinaus sind die Abläufe jedoch relativ verschieden. Der „intrinsische“ Pfad wirkt über das Mitochondrion als generellem Schadenssensor und ein wichtiges Kennzeichen ist die Ausbildung eines Komplexes, dem „Apoptosome“, mit Prokaspase 9, Cytochrom c und dem „Apoptotic Protease Activation Factor-1“, Apaf-1. Der „extrinsische“ Pfad überträgt Signale von extrazellulären Todesliganden, die zur Tumornekrosefaktor-Superfamilie gehören (z.B. CD95L). Diese binden an einen vorgeformten Rezeptorkomplex, welcher Kaspase 8, die auch bei HD eine Rolle spielen könnte [20], aktiviert. Bei einigen Zelltypen ist dieser Pfad unabhängig davon, ob mitochondriale Veränderungen stattfinden. Andere Zellen benötigen eine Wechselwirkung mit dem intrinsischen Pfad [43]. Beide Pfade konvergieren nun und aktivieren die Effektorkaspasen 3 und 7 [43]. Effektorkaspase 3 wird im Krankheitsverlauf auch beim HD Mausmodell R6/2 aktiviert [44]. Beim „intrinsischen“ Pfad wird während der Startphase nach Aktivierung des „Todessignals“ eine intrazelluläre Kaskade gestartet. Zu den bei der Kaskade ablaufenden Vorgängen gehören die Zunahme der Konzentration von Oxyradikalen und von Kalzium, die Produktion von Par-4 (prostate apoptosis response-4) und die Translokation von pro-apoptotisch wirkenden Mitgliedern der Bcl-2 Familie (Bax (Bcl-2-associated X-protein) und Bad (Bcl-associated death promotor)) an die mitochondriale Membran. Die Effektorphase beinhaltet einen Anstieg der mitochondrialen Kalzium- und der Oxyradikalen-Konzentration, die Bildung von „Permeability Transition Pores“ (PTP) in der mitochondrialen Membran und eine Freisetzung von Cytochrom c in das Zytosol [45, 46]. Cytochrom c bildet nun einen Komplex mit Apaf-1 und Kaspase 9. Aktivierte Kaspase 9 wiederum aktiviert Kaspase 3 und startet so die Abbauphase der Apoptose. Bei dieser werden strukturelle Komponenten mit Schlüsselfunktionen in der Zelle, wie z. B. beim Zytoskelett, Kernproteine und zahlreiche Proteine aus Signalkaskaden [24], sowie auch möglicherweise Htt [29, 30] zerschnitten, was zu charakteristischen Veränderungen in der Plasmamembran führt. Die Zellen schlagen Bläschen und präsentieren Phosphatidylserine auf der Zelloberfläche, was ein Signal für die Stimulation von Zellphagozytose durch Makrophagen und Mikroglia ist. Abschließend kondensiert und fragmentiert das nukleäre Chromatin [21]. Es gibt bereits Anhaltspunkte
Ein großer Teil der strukturellen und funktionellen Komplexität des Nervensystems konnte entstehen, weil Neuronen sich nicht teilen. Die lange Lebensdauer der Neuronen erlaubt es dem Nervensystem, die kontinuierliche Funktion des Gehirns über lange Zeiträume zu gewährleisten und ein anhaltendes Gedächtnis zu kodieren. Aus diesem Grund wurde auf das Nervensystem während der Evolution ein beträchtlicher Druck ausgeübt, Mechanismen zu entwickeln, die vor Zelltod schützen. Die merklichen Symptome von neurodegenerativen Erkrankungen unterstreichen die Wichtigkeit von Mechanismen, welche die neuronale Plastizität und das Überleben der Neuronen gewährleisten. Neurotrophe Faktoren können Neuronen vor Apoptose schützen, indem sie Rezeptoren aktivieren, die über Kinasekaskaden die Produktion von Proteinen fördern, die das Überleben der Neuronen sichern [39]. Viele neurotrophe Faktoren wirken über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB [49]. Das Protein Htt sorgt für die vermehrte Produktion von BNDF, einem Neurotrophin, das sich positiv auf das Überleben von Neuronen auswirkt. Bei HD verliert Htt aufgrund der EPW diese Eigenschaft, was zu einem Mangel an BDNF bei den Neuronen und möglicherweise zu Neurodegeneration führt [15].
Neben der „toxischen Peptid“ Hypothese, existiert eine weiteres Modell für die Neurodegeneration bei HD, bei welchem man davon ausgeht, dass mutiertes Htt resistenter gegenüber Proteolyse ist. Es wird deswegen nicht von Proteasen abgebaut und kann
Beide Hypothesen vermögen es, viele der bisher gemachten Beobachtungen bei der Pathologie von HD zu erklären. Beide erklären das Auftreten von Aggregaten, welche N-terminale Fragmente von Htt enthalten. Im Fall der „toxischen Peptid“ Hypothese ist die Akkumulation und möglicherweise auch Aggregation von N-terminalen Fragmenten von Htt mit EPW die Ursache für die Erkrankung. Bei der „verminderten Proteolyse“-Hypothese stammen die Fragmente von Htt ohne EPW. Die Fragmente mit EPW spielen bei der Entstehung der Pathologie keine besondere Rolle. Sie entstehen nur aufgrund der allgemeinen Prozessierung von Htt durch Kaspasen. Die Beteiligung von Kaspasen bei der Pathologie von HD hat auch einen unterschiedlichen Stellenwert. Bei der „toxischen Peptid“ Hypothese ist die Prozessierung von Htt durch Kaspasen die Ursache für die Entstehung der toxischen Fragmente, wohingegen bei der „verminderten Proteolyse“ Kaspasen nur nach der Akkumulation von Aggregaten und dem Wegfangen von verschiedenen im Stoffwechsel wichtigen Proteine durch die Aggregate, eine Rolle als „ausführende Instanz“ der Zelltodmaschinerie spielen. Obwohl beide Hypothesen die bisherigen Beobachtungen erklären können, bleibt die „toxische Peptid“ Hypothese, aufgrund der offenen Fragen bei der „verminderten Proteolyse“-Hypothese, weiterhin die am besten gestützte Theorie für die Pathologie von HD. Mausmodelle, welche ein Fragment von Htt mit EPW exprimieren sind somit ein gutes Modell für die Erkrankung [34, 41]. Nicht zuletzt die Untersuchung dieser Mausmodelle wird Aufschlüsse darüber geben, welche Prozesse beim Untergang von Neuronen in neurodegenerativen Erkrankungen wie HD im Einzelnen ablaufen, warum dieser Prozess so lange dauert und
Es gibt unterschiedliche Mausmodelle für HD basierend auf zwei verschiedenen Ansätzen für deren Herstellung. Ein Ansatz besteht in der Inkorporation des gesamten IT15 Gens für Htt mit einer krankheitsverursachenden Anzahl von Glutaminen. Bei einem dieser Modelle mit erhöhter Anzahl von CAG Wiederholungen (eine Mauslinie mit 48 und eine mit 89) im Gen IT15 und somit der Aminosäure Glutamin im translatierten Protein, zeigen die Mäuse fortschreitende Verhaltensstörungen und Fehlfunktionen der Motorik mit einem Verlust an Neuronen und Gliose im Striatum, zerebralen Kortex, Thalamus und Hippocampus. Ein Merkmal dieses Modells ist das relativ späte Auftreten von Symptomen im Alter von ungefähr 24 Wochen. Außerdem war die Penetranz der Neuronen mit Inklusionen, einer wichtigen pathophysiologischen Eigenschaft von HD gering (~1%) [57]. In einem weiteren Modell mit gleichem Prinzip für HD wurde eine Polyglutaminsequenz von 92 bzw. 111 Aminosäuren an Stelle der 7 Aminosäuren bei der Maus als „knock in“ eingefügt. Im Verlauf der Erkrankung verändert sich die Lokalisation von „full-length“ Htt mit einer erhöhten Anzahl an Glutaminwiederholungen von zytoplasmatisch zu nukleär, bevor, in einem späteren Stadium der Erkrankung, Aggregate mit N-terminalen Fragmenten auftreten [58]. Auch bei diesem Mausmodell treten sichtbare Veränderungen, wie leichte motorische Störungen oder Neurodegeneration erst sehr spät auf und eine deutliche Ausprägung ist erst im Alter von zwei Jahren sichtbar [59]. Bei diesem Modell wird der Krankheitsprozess durch Koexpression von „knock in“ Transgen und kurzen Htt-Fragmenten mit EPW (82 Wiederholungen) beschleunigt. Im Alter von zwei Jahren treten Gliose und Neurodegeneration im Striatum dieser transgenen Mäusen auf. Die Translokation von Htt in den Nukleus der transgenen Mäusen wird durch das N-terminale Fragment ebenfalls beschleunigt.
Ein anderer experimenteller Ansatz basiert auf der Inkorporation eines verkürzten
Die Untersuchung von Veränderungen auf der RNA Ebene bei R6/2 Mäusen hat Einblicke in die Pathologie von HD gewährt. Früh im Krankheitsprozess ist der mRNA Level von spezifischen Glutamat-, Dopamine- [40], und Cannaboidrezeptoren [68], Proteinen im Dopamin Signaltransduktionspfad [69] und met-enkephalin erniedrigt. Diese Veränderungen des Transkriptionsniveaus wurden auch in Gehirnen von HD Patienten
Bei der Untersuchung der Erkrankung auf der Translationsebene zeigte sich, dass sowohl HD Patienten als auch R6/2 Mäuse intranukleäre Einschlüsse (NII) im zerebralen Kortex und dem Striatum entwickeln [13, 31, 33]. NII sind in R6/2 Mäusen bereits im Alter von 4 Wochen gegenwärtig und ihre Zahl steigt nur in geringem Umfang bis kurz vor dem Endstadium der Erkrankung (zwölf Wochen). Im Gegensatz dazu, nimmt die Anzahl der neuropilen Aggregate im Zytoplasma um das vierzehnfache während des Krankheitsverlaufes zu [22]. Aggregate könnten bei neurodegenerativen Erkrankungen vielleicht durch die Rekrutierung von Faktoren zelltoxisch wirken, die normalerweise für die Funktion, Vitalität und Struktur der Zelle wichtig sind [75, 76, 77]. Diese Hypothese wird durch die Beobachtung gestützt, dass bis jetzt schon bestimmte Komponenten des Proteasoms [78], Transkriptionsfaktoren [79, 80], Chaperone [81, 82] und Kaspasen [38] als Aggregatkomponenten identifiziert worden sind. Es wurde bereits gezeigt, dass zwei Mitglieder der Familie der kleinen Hitzeschockproteine (Hsp), die Chaperone Hsp40 und Hsp70, die Aggregation von verkürzten Polyglutaminproteinen in amyloidartige Fibrillen „in vitro“ hemmen [83]. Ein weiteres Mitglied der kleinen Hsp Familie, αB-Kristallin (ABC) ist während der reaktiven Gliose [84, 85], eine neuropathologische Eigenschaft von HD [54], hochreguliert. Es wurde gezeigt, dass die Überexpression von ABC, Aggregation, die durch die Überexpression des „glial fibrillary acidic protein“ (GFAP) in Astrozyten verursacht wird, reduziert [82]. Diese Beobachtung spricht für eine Mitwirkung von ABC in einem Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung der Intermediärfilamentstruktur verantwortlich ist. ABC wurde auch als eine Komponenten der Plaques bei der Alzheimer Krankheit nachgewiesen [86].
Einige Überlegungen zu den Eigenschaften und Möglichkeiten einer Proteomics Studie helfen bei deren korrekten Planung und Durchführung.
Das Proteom eines zu untersuchenden Gewebes besteht aus allen Proteinen, die in diesem Gewebe im Laufe der Zeit exprimiert werden [87]. Diese Expression ist abhängig vom Entwicklungsstadium des untersuchten Gewebes und bei Erkrankungen auch davon, ob das Gewebe krank oder gesund ist. Um Aussagen über den Zustand eines erkrankten Gewebes machen zu können, ist das Vorhandensein einer Referenz wichtig, das gesunde Gewebe. Die Beurteilung über die Durchführbarkeit einer Proteomics Studie bei Erkrankungen richtet sich aus diesem Grund am Vorhandensein der Zustände „krank“ und „gesund“ aus. Absolute Aussagen nach ausschließlicher Untersuchung des erkrankten Gewebes lassen sich nicht machen, da eine absolute Quantifizierung der Proteine in der Probe nicht möglich ist. Der Proteomics Ansatz ist somit ein vergleichender Ansatz.
Bei der Auswahl des zu untersuchenden Spezies muss man sich über die Vorteile und Limitierungen der einzelnen Spezies, vor allem im Hinblick auf die mögliche Aussagefähigkeit der durch eine Proteomics Studie zu erzielten Resultate im klaren sein. Bei der Untersuchung einer Erkrankung, z. B. HD, an Geweben vom Menschen ist eine direkte Relevanz der Ergebnisse gewährleistet. Histologische und morphologische Untersuchungen liefern aufgrund ihrer überschaubaren Komplexität gute Ergebnisse mit menschlichem Probenmaterial. Werden die Proteine aus einem Gewebe jedoch mittels Großgel 2D-Elektrophorese aufgetrennt, kann man mehrere tausend Proteinspots mit sehr unterschiedlicher Intensität auf dem 2D Gel unterscheiden. Die nach dem Vergleich von zwei Gelen auftretenden Unterschiede können verschiedenartigste Ursachen haben. Proteinpolymorphismen, z. B. durch Mutation, veränderte Struktur und posttranslationale Modifizierungen bilden eine Gruppe der möglichen Ursachen für diese Unterschiede. Physiologische, aufgrund von ablaufenden Stoffwechselvorgängen, oder methodische Unterschiede bilden zwei weitere Kategorien. Schließlich besteht noch die Möglichkeit, dass die Unterschiede ihre Ursache in der untersuchten Erkrankung haben. Vor allem durch die posttranslationale Prozessierung und Modifizierung ist die Vielfalt auf der Protein- gegenüber der RNA-Ebene um ein vielfaches höher. Beim Menschen erhöht sich die Proteinvielfalt noch durch die Heterogenität innerhalb der Spezies. Dieses Problem der
Ein weiterer Nachteil ist, dass Humanproben nicht im Rahmen eines Experimentes manipuliert werden können, was eine Überprüfung von komplexen Hypothesen sehr schwierig macht. Ein wichtiger Punkt war nun die Auswahl eines geeigneten Modellsystems für die Untersuchung von HD. Bei der Auswahl des Systems muss die experimentelle Fragestellung berücksichtigt werden. Bei der Untersuchung einer neurodegenerativen Erkrankung wie HD ist es wichtig, dass das Gehirn des Modelltieres dem des Menschen ziemlich nahe kommt, ohne jedoch dessen Generationszeit zu besitzen. Bei der vorliegenden Studie erwies sich die Maus als guter Kompromiss. Abb. 2 zeigt deutlich die Ähnlichkeit beider Spotmuster, in vergleichbaren Gelausschnitten, zwischen den Spezies Maus (Mus Musculus
) und Mensch (Homo Sapiens). Die Mäuse können im Gegensatz zum Menschen gezielt experimentell manipuliert werden, was eine Überprüfung von aufgestellten Hypothesen vereinfacht. Ingezüchtete Mäuse weisen eine gute Reproduzierbarkeit bei Kontrolltieren und transgenen Tieren auf (Abb. 2). In der vorliegenden Studie gab es zwischen Kontrolle und erkrankter Maus selbst krankheitsspezifische Unterschiede nur in geringem Maße. Anders verhielt es sich dagegen bei einem Vergleich von Individuen des Menschen. Die Proben wiesen viele Unterschiede zwischen HD und Kontrolle auf, die nach Quervergleich von mehreren Probenpaaren unspezifisch und auf die Heterogenität innerhalb der Spezies zurückzuführen waren (Abb. 2 und Tab. 12 und 13 im Anhang). Außerdem gab es beim Menschen zwischen den
Der Zugang zu geeignetem menschlichem Gewebematerial stellt im Gegensatz zu Blut oder Urin ebenfalls ein Problem dar. Genetische Erkrankungen, wie z. B. Huntington’s
Vor der Durchführung einer Proteomics Studie muss man sich auch über die zu erwartenden Ergebnisse im klaren sein. Nach der Untersuchung des Proteoms zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf einer Erkrankung, erhält man die zeitlich aufgelöste Expression vieler, unterschiedlicher Proteine. Untersuchung verschiedener Gewebe liefert ein Bild über die Gewebsexpression. Die Fraktionierung der Proben vor der Auftrennung im 2D Gel gibt nähere Auskunft über die mögliche Lokalisation der untersuchten Proteine in der Zelle (Zytoplasma, Membran oder Kern) [88]. Die Untersuchung des Proteoms gibt also einen ersten Anhaltspunkt über die bei der Pathogenese beteiligten Proteine und deren
HD wurde bereits in Mausmodellen [34, 41, 57] und beim Menschen [31] untersucht. Die bisher in der Literatur beschriebenen Veränderungen auf der RNA und Proteinebene, können noch nicht schlüssig die Fehlfunktionen von Neuronen erklären, die dazu führen, dass diese, aufgrund eines noch nicht bekannten Mechanismus, untergehen [23]. Deswegen müssen Proteine, die in Stoffwechselwegen außerhalb der bisher für die Erkrankung bekannten Wege wirken, noch immer identifiziert werden. Ziel dieser Arbeit ist es, diese krankheitsrelevanten Proteine durch Untersuchung des Gehirnproteoms eines sehr gut charakterisierten Mausmodells, R6/2, zu finden [41]. Unter Verwendung der Großgel 2D-Elektrophorese soll die zytoplasmatische, die Membran- und die Kernfraktion von murinem Gehirngewebe untersucht werden. Betroffene, menschliche Gehirnregionen werden untersucht um die bei der Maus gewonnenen Resultate für die Erkrankung beim Menschen zu untermauern. Untersuchungen von weiteren Organen der Maus werden durchgeführt um ein Gewebeexpressionsmuster der zuvor beim Gehirn identifizierten Proteine zu erhalten und krankheitsbedingte Veränderungen der Proteinexpression in verschiedenen Organen zu untersuchen.
Es wurde zum ersten Mal gezeigt, dass die Expression von zwei Serinproteasehemmern, α1-Antitrypsin und Contraspin, sowie des Chaperons αB-Kristallin auf Proteinebene im Krankheitsverlauf von HD im Gehirn von R6/2 Mäusen herunterreguliert war. Nach der Untersuchung von Herz, Leber und Testes, konnte eine reduzierte Expression von α1-
Gewebe von 4, 8 und 12 Wochen alten, transgenen R6/2 Mäusen sowie CBA x C57Bl/6 Kontrollmausgewebe wurden in unseren Studien verwendet. Diese wurden im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Dr. Gillian P. Bates, Guy’s Hospital, London, UK, aus deren Mäusezucht bereitgestellt. R6/2 Mäuse wurden durch Rückkreuzung auf (C57Bl/6 x CBA)F1 Mäuse vermehrt. Die Genotypisierung und die Bestimmung der Länge der CAG-Wiederholungen wurde wie bereits beschrieben durchgeführt [65]. C57Bl/6 Mäuse wurden von Charles River, Deutschland, erworben. Menschliche Gehirnproben wurden von verschiedenen Quellen erworben. Striaten und Parietallappen von einem Huntington Chorea Patienten und einer Patientin, wie auch die in Alter und Geschlecht übereinstimmenden Kontrollen, waren ein Beitrag vom Institut für Neuropathologie der „Ludwig Maximilian“ Universität München. Proben des vorderen Globus Cinguli (Brodmann Bereich 24) von Grad 4 Gehirnen [54] und die in Alter und Geschlecht übereinstimmenden Kontrollen wurden vom Harvard Brain Tissue Resource Center, MA, USA bereitgestellt (Aufstellung der Proben, Tab.7).
Mausgehirne wurden präpariert wie an anderer Stelle bereits beschrieben [88]. Mäuse wurden enthauptet, das Fell entfernt, der Schädel geöffnet und das Gehirn vollständig entnommen. Das Rückenmark wurde am Rhombenzephalon abgetrennt. Das Gehirn wurde in eine auf Eis gelagerte Petrischale, welche mit 0,9 % (w/v) Kochsalzlösung (NaCl, Merck, Darmstadt, Deutschland) gefüllt war, verbracht. Am Gehirn verbliebenes Blut wurde durch vorsichtiges spülen mit der Kochsalzlösung entfernt. Das Gehirn wurde nun mit Kimwipes® (Kimwipes® Lite; Hakle-Kimberly, Mainz, Deutschland) trockengetupft, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C für den weiteren Gebrauch gelagert. Die folgenden Gehirnregionen wurden von einem Pathologen mit großer Erfahrung mit der Handhabung von Mausgehirnen von drei weiblichen, 20,5 Wochen alten, C57Bl/6 Mäusen präpariert: Nervus Trigeminus, Hypophyse, Motor Kortex (mit
Die Methode zur Extraktion von Proteinen wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben [88]. Bei der Prozedur wurden gefrorene Gewebeteile von Organen mechanisch in kleine Stücke zerkleinert und dann chemisch und enzymatisch weiter zerteilt. Maximal drei Fraktionen wurden von jeder Gewebeprobe hergestellt: die erste Fraktion enthält die pufferlöslichen Proteine (Proteine hauptsächlich aus dem Zytoplasma), die Zweite beinhaltet die Harnstoff/Detergenz (CHAPS) löslichen Proteine (Membranfraktion). Diese Fraktion beinhaltet Proteine, welche in Membranen und anderen Strukturen der Zelle und allen Organellen, eingebettet sind. Die dritte Fraktion, das Restpellet, ist eine Kernfraktion, die hauptsächlich aus Chromatin besteht. Durch DNAse Behandlung werden die chromosomalen Proteine (Histone u. a.) freigesetzt. Ein wichtiges Kennzeichen dieses Verfahrens ist es, dass mit den drei Fraktionen das gesamte Spektrum von Proteinen abdeckt wurde, welches in einer Gewebeprobe vorhanden ist. Jeder selektive Verlust von Proteingruppen wurde wegen dem Fehlen von Reinigungsschritten vermieden. Die Proteinkonzentrationen in den Extrakten sind fast mit der „in vivo“ Konzentration identisch, was den Verlust von Proteinklassen durch Aggregation nahezu ausschließt. Die Komponenten, welche zu den jeweiligen Geweben während der Extraktionsprozedur zugegeben wurden, basierten immer auf dem Gewicht, womit Unterschiede in der Proteinkonzentration aufgrund von Gewebsgewichtsunterschieden zwischen R6/2 und Kontrollmäusen ausgeschlossen wurden. Eine zusätzliche Kontrolle für die gleiche Proteinkonzentration in beiden Proben ist die Tatsache, dass die meisten der Proteinspots auf R6/2- und Kontroll-2D-Gelen mit der gleichen Intensität exprimiert wurden und diese somit als interner Standart für gleiche Proteinkonzentrationen in beiden Proben dienten. Die Reproduzierbarkeit der Extraktionsprozedur wurde streng kontrolliert indem errechnete Referenzwerte mit Standardwerten verglichen wurden ([88], Seite 83 Note 4 und dort befindliche Referenzen). Durch die Fraktionierung erhöht sich die Anzahl der
Bei -80 °C eingefrorene Proben, mit einem vom Gewebe abhängigen Gewicht (bis ca. 500 mg), wurden so schnell wie möglich gewogen um die Kondensation von Wasser auf dem gefrorenen Gewebe zu vermeiden. Kondenswasser würde das Gewicht der Probe vergrößern und die auf dem Probengewicht basierenden Berechnungen zur Puffer und Inhibitorenzugabe verfälschen. Nach dem Wiegen wurden die Probe in vorgekühlten Mörser aus Halbedelstein (WITA, Berlin, Deutschland) verbracht, der sich, ungefähr zur Hälfte in flüssigem Stickstoff getaucht, in einer Styropor® Box befand. Probenpuffer P1 (keine Zugabe von P1 bei Gehirn und Testes zu diesem Zeitpunkt) und Proteasehemmerlösungen H1 und H2 wurden zum Gewebe zugegeben, wobei die benötigten Mengen mit Hilfe des Probengewichts bestimmt wurden (Tab. 2). P1 bestand aus 50 mM TRISMA®Base (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland), 100 mM KCl (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 20 % (w/v) Glyzerin (Merck, Darmstadt, Deutschland). H1 bestand aus den Protease-Inhibitoren Pepstatin A (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) und PMSF (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland). Das Ansetzen des Hemmers erfolgte in Chargen von 19 ml. Hierzu wurden 0,0048 g Pepstatin
Das Gewebe wurde nun mit einem Stößel zusammen mit P1, H1 und H2 zu einem feinen Puder zermahlen. Bei Leber und Herz wurde der Gewebepuder nun vorsichtig in ein 2 ml Eppendorfgefäß verbracht und eine genau berechnete Anzahl Glaskugeln (Tab. 2) zugegeben (2,5 ± 0,05 mm Durchmesser; Worf Glaskugeln GmbH, Deutschland) und einer
Das Pellet, welches bei der Extraktion der zytoplasmatischen und nukleoplasmatischen Proteine zurückblieb (Pe2), wurde mit Puffer 2 (P2), in welchem das Detergenz CHAPS gelöst war und Hemmer 3 (H3) zusammengebracht (Tab. 2) und wie in 4.3.2.1 beschrieben, gemörsert. P2 bestand aus 200 mM KCl, 20% (w/v) Glyzerin und Phosphatpuffer (ca. 33 ml 200 mM NaH2PO4 (Merck, Darmstadt, Deutschland) + 67 ml 200 mM Na2HPO4 (Merck, Darmstadt, Deutschland) ergab pH = 7,2) mit einem Pufferendvolumen von 90 ml und einem pH von 7,1. H3 wurde wie H2, jedoch mit P2 anstatt P1, hergestellt. 77 mg CHAPS (Serva, Heidelberg, Deutschland) und 27 µl bidestilliertes Wasser wurden zu 900 µl P2 zugegeben. Die zuzugebenden Mengen von P2
Das Pellet, welches nach der Fraktionierung der Membranproteine übriggeblieben war, wurde nun zusammen mit Puffer 3 (P3), wie unter 4.3.2.1 beschrieben, gemörsert. P3 besteht aus 50 mM TRIZMA®Base und 0,49 g/l MgSO4 x 7 H2O (Ferak, Berlin, Deutschland) in bidestilliertem Wasser. Der pH-Wert des Puffers wurde mit 1 M HCl (Merck, Darmstadt, Deutschland) auf 8,0 bei Raumtemperatur korrigiert. Das benötigte P3 Volumen wurde nach Tab. 2 bestimmt. Der Puder wurde nun mit einem Spatel, ohne Materialverlust, in ein Zentrifugenröhrchen mit kleinem Rührfisch überführt. Nun wurde der Puder bei 4 °C aufgetaut, Benzonase nach Maßgabe des Herstellers (Merck, Darmstadt, Deutschland) zugegeben und 30 min. lang bei 4 °C gerührt, damit die Benzonase die DNA verdauen und so die daran assoziierten Proteine freisetzen konnte. Nun wurde Harnstoff für eine Endkonzentration von 9 M in der Probe zugegeben und die Suspension bei RT weitere 30 min. gerührt. Die sofortige Harnstoffzugabe würde die Benzonase denaturieren und ihre Aktivität inhibieren. Während des Rührens, nachdem Teile des Harnstoffs gelöst waren, wurden 70 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 % (v/v) Servalyte 2,0 – 4,0
Blutproben wurden mit Servalyte pH 2,0 - 4,0 , 9 M Harnstoff und 70 mM DTT versetzt, 1 : 4 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt und danach auf die 1D Gele aufgetragen. Urinproben wurden nach der gleichen Verfahrensweise, aber unverdünnt, aufgetragen [88].
Proteine wurden durch hochauflösende, Großgel 2D-Elektrophorese aufgetrennt, eine Technik, die in unserem Labor entwickelt und erst kürzlich detailliert beschrieben wurde [89, 90]. Obwohl die „Lauf zu Lauf“-Unterschiede mit dieser Technik sehr gering sind, wurden durch zufällige Auswahl aus einem Pool von Proben von Mäusen des gleichen Gewebes, genetischen Hintergrunds, Geschlechts und Alters, Paare, bestehend aus jeweils einem R6/2 und einem Kontrollgewebe, gebildet, sogenannte Probenpaare. Beim Menschen wurde auf die Verwendung von Gewebe aus der gleichen Gehirnregion geachtet, dass sich im Alter möglichst wenig unterschied. Alle Probenpaare hatten das gleiche Geschlecht. Die genetische Heterogenität innerhalb der Spezies Mensch konnte nicht ausgeglichen werden. Probenpaare wurden nun immer parallel beiden Elektrophoreseprozeduren unterzogen. Die erste Dimension (1D), die IEF, basiert auf der „Carrier Ampholyte Technik“, bei welcher der pH-Gradient während des Laufs erzeugt wird. Die Trennstrecke betrug 40 cm. Bei der Herstellung von 2D Gelen für die Spotdetektion oder Identifikation hatten die 1D Gele einen Durchmesser von 0,9 mm oder 1,5 mm und ein Probenvolumen von 6 µl - 10 µl (Tab. 2) oder 50 µl. Nach Beendigung des 1D Laufes wurden die 1D Gele halbiert und jede Hälfte separat zusammen mit der passenden Hälfte (niedriger oder hoher pH-Bereich) des Probenpaares der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) als zweiter Dimension unterzogen. Der pI-Wert wurde, wie vor kurzem im Detail an anderer Stelle beschrieben, bestimmt [90]. Das 1D Gel (mit Probe) wurde nach dem Lauf entlang der Trennstrecke in 80, 0,5 cm lange, Stücke zerschnitten. Die Gelstücke wurden danach einzeln in 1,5 ml Eppendorfgefäßes gefüllt mit 40 µl bidestilliertem Wasser, welches durch Kochen und Vakuum entgast wurde, verbracht. Während des gesamten Prozesses wurden die Eppendorfgefäße unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Die dicht verschlossenen
Bei der isoelektrischen Fokussierung werden Proteine nach ihrem Isoelektrischen Punkt (pI), bei dem ihre Nettoladung gleich null ist, aufgetrennt.
Zur Herstellung eines Gels werden zylindrische Glasröhrchen (Schott Glas, Mainz, Deutschland) mit einer durchgängigen zentralen Bohrung mit einem Innendurchmesser von 0,9 mm (analytische Gele, Spotdetektion) und 1,5 mm (präparative Gele, Spotidentifizierung) und einer Länge von 44,8 cm verwendet (Abb. 3). Grosse Sorgfalt wurde darauf verwendet, sicherzustellen, dass die Gelröhrchen vor dem Lauf absolut sauber waren, um so eine gleichmäßige Anhaftung des Gels an das Glas zu gewährleisten und um Kontaminationen durch Fremdprotein zu vermeiden. Die Reinigung erfolgte durch das Einweichen der Glasröhrchen in erhitzter (50 °C) 6 % (v/v) Deconex®-12-Lösung (Borer Chemie, Zuchwil, Schweiz). Danach wurden sie auf 90 °C in einer 0,1 M HCl (Merck, Darmstadt, Deutschland) Lösung erhitzt. Abschließend wurden die Röhrchen vorsichtig mit deionisiertem Wasser gespült und unter Verwendung von Druckluft getrocknet.
Fünf Glasröhrchen wurden senkrecht in einen Gelröhrchenständer eingespannt und mit Nylonziehfäden (Angelschnur; Ertner super, 0,70 mm, 100 m, Deutschland), welche
Ohne große Verzögerung wurde die Lösung in die Giesschiene gefüllt. Nun wurden die Nylonfäden 40 cm nach oben gezogen. Es musste hierbei gewährleistet sein, dass die Separationsgellösung ohne Luftblasenbildung mit nach oben gezogen wurde. Anschließend wurde die Giesschiene mit der restlichen Gellösung entfernt und eine neue Schiene eingesetzt. Danach wurden 20 µl APS Lösung zu 780 µl Capgellösung zugegeben und
Für die erste Dimension der Elektrophorese wurden meist fünf Gelröhrchen in die IEF Elektrophoresekammer (Wita, Berlin, Deutschland) mit dem Capgel nach unten eingespannt (Abb. 3A, 1D Kammer). Hierbei dienten vier der Aufnahme der Proben für zwei Probenpaare (2 HD und 2 Kontrollen) und das fünfte Röhrchen diente als Ersatz für den eventuell fehlgeschlagen Probenauftrag in einem der anderen Röhrchen. Die Gelröhrchen wurden durch eine Gummidichtung frei beweglich in Bohrungen gehalten, die
Glasstopfen verschlossen. Die untere Kammer (Kathodenkammer) wurde mit 400 ml Ethylendiaminlösung (5 % (v/v) Ethylendiamine (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn,
Bei der Großgel SDS-PAGE wurden Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Das Masse der Proteine in der Probe wurde mit Hilfe von Markerproteinen bekannten Molekulargewichts bestimmt, welche zusammen mit der eigentlichen Probe aufgetrennt wurden.
Wie bei den IEF-Gelen wurde sorgfältig darauf geachtet, dass die für die Gelkammern verwendeten Glasplatten in sehr sauberem Zustand waren, um eine gute Anhaftung des Gels auf der gesamten Glasoberfläche zu gewährleisten. Vor dem Gebrauch wurden die Glasplatten sorgfältig mit destillierten Wasser gespült und mit in 70 % (v/v) Ethanol (Herbeta-Arzneimittel, Berlin, Deutschland) getauchten Kimwipes® abgerieben. Die 2D Gele wurden einen Tag vor ihrem Gebrauch bereitgestellt. Die Standartgröße der Gele betrug 28 cm (Trennlänge) x 23,2 cm (Breite) x 0,75 mm (Geldicke für analytische Gele). Eine Geldicke von 1,0 mm wurde nur für präparative Gele zur Spotidentifizierung mit Hilfe der Massenspektrometrie verwendet. Zwei Behälter mit Gellösung (je 67,5 ml für 0,75 mm Plastikabstandhalter; Zusammensetzung siehe Tab. 5) wurden 30 min. lang bei 40 °C in einem Wasserbad aufgetaut. In der Zwischenzeit wurden die Kammern für die 2D zusammengebaut. Die Gießform bestand aus zwei zuvor gereinigten Glasplatten und zwei Plastikabstandhaltern (Abb. 3A (7)). Die Abstandhalter sorgten dafür, dass die Glasplatten in einem festgelegten Abstand voneinander gehalten wurden. Sie mussten über ihre gesamte Länge gleichmäßig dick sein, damit sie guten Kontakt zu den Glasplatten hatten und die entstehenden Gele gleichmäßig dick waren. Die Abstandhalter waren 0,9 cm breit und 30 cm lang. Die breite Seite wurde vor dem Zusammenbau mit einer geringen Menge Silikonpaste (GE Bayer Silicones, Baysilone Paste; Bayer, Leverkusen, Deutschland) dünn bestrichen um die Dichtigkeit der Gelkammer zu gewährleisten. Die Glasplatten wurden mit Plastikklammern aus einem Stück zusammengehalten, welche an den Längsseiten (Trennstrecke) der Gelkammer angebracht wurden. Das untere Ende der Gießform wurde durch die Verwendung eines Systems verschlossen, welches die Gießform gegen eine Gummidichtung auf einem Gießständer presst. Es wurde nun mit einer Wasserwaage sichergestellt, dass der Gießständer waagrecht aufgestellt war, damit die Gele eine Auftragsfläche, die rechtwinklig zur Trennstrecke verläuft, besitzen würden. Zu 67,5 ml Gellösung wurden 4,5 ml einer 1,28 % (w/v) APS Lösung zugegeben und beide
Elf Liter Elektrophoresepuffer wurden frisch hergestellt und in das untere Pufferreservoir (die Anodenkammer) der 2D Gelelektrophorese Einheit gefüllt (Abb. 3A) und auf 15 °C vorgekühlt. Der Puffer enthielt 25 mM TRIZMA®Base, 192 mM Glyzine (Serva
Um Proteine in SDS-PAGE Gelen anzufärben wurden zwei verschiedene Färbemethoden verwendet, eine saure Silberfärbung und die Anfärbung mit Hilfe des Farbstoffes Coomassie Brillant Blue G250. Für die Sichtbarmachung möglichst vieler Proteine im Gel wurde die Silberfärbung verwendet, da diese Methode die höchste Empfindlichkeit zum
Proteinspots wurden durch saure Silberfärbung zur Beurteilung der differentiellen Expression sichtbar gemacht. Diese Methode ist ausführlich und detailliert an anderer Stelle beschrieben worden und wurde in dieser Arbeit leicht modifiziert durchgeführt [89, 91, 92]. Nach der Fixierung über Nacht waren Substanzen, die die Färbung negativ beeinflussen könnten, wie z. B. SDS oder Glyzine, weitgehend entfernt worden. Alle nun folgenden Arbeitsschritte wurden mit Gelen ausgeführt, die sich horizontal liegend einzeln in Plastikwannen befanden. Für eine hohe Effizienz aller Schritte war die schnelle und gute Benetzung der Gele mit den Färbelösungen notwendig. Aus diesem Grund wurden die Färbewannen auf einen sich mit hoher Geschwindigkeit bewegenden Schüttler positioniert. Es war darauf zu achten, dass das Gel nicht an die Färbewanne ankleben würde, da dieses sonst durch das Schütteln beschädigt werden könnte. Der schnelle Wechsel der Lösungen wurde durch Wannentausch der Gele gewährleistet. Die 2D Gele wurden aus dem Fixierer genommen und einzeln in einem Liter Inkubationslösung pro Gelhälfte und Wanne für eine Stunde quellen gelassen. Die Inkubationslösung bestand aus 30 % (v/v) Ethanol, 0,5 % (v/v) Glutaraldehyd (Glutaraldehydlösung 25 %, Darmstadt, Deutschland), 4,1 % (w/v) Natriumazetat (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 0,2 % (w/v) Natriumthiosulfat (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Deutschland). Die Gele wurden anschließend zweimal 20 min. lang in 2 l bidestilliertem Wasser pro Gel gewaschen. Danach erfolgte eine Inkubation in 1 l Silbernitratlösung (0,1 % (w/v) Silbernitrat (Merck, Darmstadt, Deutschland), 0,01 % (v/v) Formaldehyd (Formaldehydlösung min. 37 % Merck, Darmstadt, Deutschland)) für 30 min. Anschließend wurden die Gele kurz mit 1 l bidestilliertem Wasser gewaschen und danach 45 s in 1 l Vorentwickler (2,5 % (w/v) Natriumcarbonat (Merck, Darmstadt, Deutschland)) entwickelt. Die eigentliche Entwicklung erfolgte in 2,5 % (w/v) Natriumcarbonat und 0,01 (w/v) Formaldehyd. Die gesamte Entwicklungszeit war stark von der Menge an aufgetragenem Protein und dem verwendeten Gewebe abhängig. Der Färbeprozess wurde durch die Zugabe von Stoplösung
Zur Spotidentifizierung wurde eine Färbung unter Verwendung von Coomassie Brillant Blue (Brillant Blau G250, Roth, Karlsruhe, Deutschland)) benützt, welche für die Verwendung zusammen mit Massenspektrometrie bereits gut etabliert, jedoch weniger empfindlich ist als die saure Silberfärbung. Die Färbung wurde leicht modifiziert nach einem bereits publizierten Protokoll durchgeführt [93, 94]. Die Gele wurden 30 Minuten lang in 1 l bidestilliertem Wasser pro Gel und Wanne gewaschen. Der Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Jeweils zwei Gele wurden nun in zwei Litern 34 % (v/v) Methanol, 2 % (v/v) Phosphorsäure und 17 % (w/v) Ammoniumsulfat (Merck, Darmstadt, Deutschland) in einer Stahlwanne inkubiert. Nach 1 Stunde wurden 0,66 g/l Coomassie Brillant Blue G250 zugegeben. Die Gele wurden 5 Tage lang unter kräftigem Schütteln bei Raumtemperatur gefärbt. Nach dem Ende der Inkubationszeit wurden die Gele einzeln mindestens drei Mal in bidestilliertem Wasser gewaschen um überschüssige Coomassie Farbpartikel und Methanol zu entfernen. Danach wurden die Gele einzeln in Plastikfolie verschweißt und bei 4 °C aufbewahrt oder sofort weiterverarbeitet. Für eine gute Identifizierbarkeit der Spots war es sehr wichtig, diese möglichst schnell auszustechen und bei –80 °C zu konservieren. Aus diesem Grunde erfolgte das Ausstechen mit dem Skalpell, wenn möglich am gleichen, spätestens aber am nächsten Tag nach der Beendigung der Färbung. Die Gelstücke hatten einen Durchmesser von ca. 1,5 mm. Beim Ausstechen war darauf zu achten, dass möglichst dunkel angefärbte Partien des Spots mit hoher Proteinkonzentration ausgewählt wurden.
Zur Konservierung der Ergebnisse der analytischen 2D Läufe wurden die silbergefärbten Gele getrocknet. Zu diesem Zweck wurde das silbergefärbte Gel flach auf eine
Die silbergefärbten 2D Gele wurden visuell bewertet, indem die beiden Gelhälften eines Probenpaares auf einem Leuchtkasten (BIOTEC-FISCHER, Reiskirchen, Deutschland) miteinander verglichen wurden. Veränderungen der Spots wurden anhand folgender Gesichtspunkte in Betracht gezogen: vorhanden/nicht vorhanden, quantitative Veränderung oder Mobilitätsveränderung; die Mobilitätsvariante definiert einen Spot oder Spots, die sich im Gel an eine andere Position „bewegen“ und damit einen Shift des Isoelektrischen Punktes und/oder des Molekulargewichts anzeigen [95].
Alle massenspektrometrischen Proteinbestimmungen und die dafür notwendigen in den Punkten 4.8 bis 4.11 beschriebenen Arbeiten, wurden von Herrn Dipl. Biochemiker Daniel C. Chamrad, PROT@GEN AG, Emil-Figge-Str. 76 A, 44227 Dortmund, durchgeführt.
Die interessanten Proteinspots wurden herausgeschnitten und abwechselnd dreimal mit 10 µl Verdaupuffer (10 mM NH4HCO3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland)) und 10 µl modifiziertem Verdaupuffer (10 mM NH4HCO3 / Azetonitril (Merck, Darmstadt, Deutschland) 1 : 1) gewaschen. Danach wurden die Gelstücke in 10 µl Azetonitril geschrumpft und in 2 µl Proteaselösung (0,05 µg/ml Trypsin; Promega, Madison, WI, USA) quellen gelassen. Der Verdau fand in einem Zeitraum von 10 bis 12 Stunden bei 37 °C statt. Der gewonnene Überstand wurde in eine saubere Quarzküvette überführt und die Gelstücke wurden noch zwei Mal mit je 5 µl Verdaupuffer extrahiert. Die Überstände wurden gepoolt. Eine von zwei verschiedenen Methoden wurde für die MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) Target Präparation verwendet. Bei der ersten Methode handelt es sich um die konventionelle, „trockene Tropfen“ Technik, mit der Aufkonzentrierung der Probe mit Hilfe von Poros 10 R1 Beads (Perseptive BioSystems, Cambridge, England) [96]. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels, wurden die Proben mit den Poros Beads in 1 µl Matrixlösung (HCCA (α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure; Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland) in Azetonitril / 0,1 % (v/v) TFA 1:1 v/v) aufgenommen und auf ein konventionelles MALDI Target transferiert. Eine weitere Probenaufbereitungsmethode verwendet die AnchorChip® Technologie. AnchorChips® (Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland) sind mit hydrophilen Patches („Anker“) in einer hydrophoben Umgebung ausgestattet, sodass der relativ hydrophile Analyt sich auf den „Ankern“ konzentriert. Ein ein µl Tropfen des gepoolten Überstands wurde auf jeden „Anker“ (386/Target) mit 400 µm Durchmesser appliziert. Nachdem die Tropfen auf die Größe des „Ankers“ geschrumpft waren, wurden 0,5 µl HCCA (0,2 g/l Azetonitril/0,1 % (v/v) TFA (Trifluoressigsäure; Merck, Darmstadt, Deutschland) 1 : 1) zugegeben.
Zur Analyse und Identifikation der tryptischen Peptide wurde MALDI-TOF Massenspektrometrie [97] mit einem Bruker Reflex III Massenspektrometer (Bruker-Daltonik, Bremen, Deutschland) mit einer SCOUT 384 Ionenquelle verwendet. Die Beschleunigungsspannung betrug 25 kV und die Reflektorspannung wurde anfänglich auf 21.6 kV festgesetzt. Die interne Kalibrierung basierte auf tryptischen Peptiden (842,510 Da; 2211.105 Da). „Post Source Decay“ (PSD) Spektren wurde mit einer „Parent“-Ionen
Die Peptidmassenfingerabdruck-Spektren wurden unter Zuhilfenahme der nicht-redundanten NCBI Proteindatenbank mit Hilfe von ProFound (
Zur automatischen Interpretation der Fragmentionenspektren wurde der SEQUEST Algorithmus [99, 100, 101] Version 2 während des Screenens der NCBI Datenbank verwendet.
Zur Untersuchung der Erkrankung HD wurde das Proteom von Gehirn, Herz, Leber und Testes des Htt Exon 1 transgenen Mausmodells R6/2 und von Kontroll-Mäusen gleichen Geschlechts, Alters und genetischem Hintergrund mit Hilfe der Großgel 2D-Elektrophorese verglichen. Je nach Gewebe wurden vier, acht oder zwölf Gelpaare mit jeweils mehreren tausend Proteinspots pro Gel für jeden untersuchten Zeitpunkt ausgewertet. Die genaue Anzahl der Spots pro 2D-Muster unterschied sich zwischen den verschiedenen Geweben (Leber ca. 9.000, Gehirn ca. 8.000, Herz ca. 5.000 und Testes ca. 10.000). Zur Frage der Relevanz der Ergebnisse für den Menschen wurde das Proteom von drei Gehirnregionen beim Menschen, mit jeweils ca. 4.000 bis 5.000 Spots pro Gel, ausgewertet. Es wurden nur Spotunterschiede berücksichtigt, die in allen Gelpaaren eines untersuchten Zeitpunktes identisch waren oder, bei Ergebnissen mit menschlichem Probenmaterial, wo Abweichungen von diesem Kriterium anhand von zusätzlich erhobenen Daten geklärt werden konnten. Die Auswertung der Proteinmuster führte zum Nachweis von vier verschiedenen Proteinen aus drei Proteinfamilien, die in der HD-Maus abweichend von der Kontrolle exprimiert waren. Beim Menschen konnte die differentielle Expression eines Proteins im Falle der Krankheit bestätigt werden.
Nach Auswertung des Gehirnproteoms bei der Maus stellte sich heraus, dass erstaunlicherweise nur eine geringe Anzahl von Proteinen zwischen R6/2 und Kontrolle differentiell exprimiert wurden. Die Spotmuster waren bei den Probenpaaren selbst nahe dem Endstadium der Erkrankung kaum unterscheidbar. Nach Auswertung aller Proteinspots zeigten sich krankheitsrelevante, signifikante Unterschiede im Expressionslevel von nur drei Proteinen, wobei der Expressionsunterschied eines der Proteine nicht immer deutlich zu sehen war. Die Lokalisation der Proteinspots im 2D Gel, die Identifizierung und subzelluläre Verteilung sowie die Expression der Proteine im Verlauf der Erkrankung wird im folgenden beschrieben und die Frage geklärt, inwieweit die Ergebnisse auf den Menschen übertragbar sind.
Zu Beginn der Studie wurde nach krankheitsspezifischen Unterschieden im Gehirnproteom nahe dem Endstadium der Erkrankung (zwölf Wochen) bei transgenen R6/2 Mäusen gesucht, einem Stadium der Erkrankung, bei dem die größten Unterschiede zwischen erkranktem und gesundem Gehirngewebe zu erwarten waren. Wie aus den Abbildungen 4 bis 11 zu ersehen ist, waren die Spotmuster im Mausgehirn sehr reproduzierbar. Um trotzdem vorhandene, leichte Variationen fast ganz auszuschließen, wurden nur 2D Gele von Probenpaaren miteinander verglichen, die sowohl in der ersten als auch in der zweiten Dimension parallel gelaufen waren.
Drei verschiedene Fraktionen des Gehirns, mit Proteinen angereichert aus dem Zytoplasma, den Membranen oder dem Chromatin, wurden von zwölf Wochen alten R6/2- und Kontrollmäusen untersucht. Die Fraktionierung und separate Auftrennung der Proteinfraktionen im 2D Gel ermöglichte die Darstellung und Untersuchung einer größeren Anzahl von Proteinen, als dies bei der Untersuchung eines Gesamtextraktes möglich gewesen wäre. Die für die einzelnen Fraktionen erzielten Ergebnisse werden nun im Einzelnen dargestellt.
Im pH-Bereich von 3,5 bis 6 fehlten den R6/2 2D Gelen eine drei Spots umfassende Gruppe in allen acht untersuchten HD/Kontrolle Probenpaaren (Abb. 4, Tab. 6). Ein vierter Spot in der Nachbarschaft der Dreiergruppe fehlt im Endstadium der Erkrankung ebenfalls. Alle drei Proteinspots der Spotgruppe auf der sauren Seite wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert und gehören zu einer von fünf murinen Isoform des Serin-Protease-Inhibitors (SERPIN) α1-Antitrypsin, nämlich α1-Antitrypsin 1-5 (AAT 1-5) (Datenbankeintragung: alpha-1-antitrypsin 1-5 precursor; Swiss Prot. No.: Q00898). Der vierte Proteinspot war schwer zu identifizieren, da er selbst eine geringe Intensität besitzt und sehr nah bei einem anderen Spot mit höherer Intensität liegt (Abb. 4). Der beobachtete Isoelektrische Punkt von 5,3 für AAT 1-5 stimmt gut mit dem berechneten Isoelektrischen
Zusätzlich zur zytoplasmatischen Fraktion des Gehirns, wurden zwei weitere Fraktionen untersucht. Proteine, die durch Harnstoff und Detergenzextraktion (Fraktion 2) gewonnen wurden bildeten die Fraktion mit angereicherten Membranproteinen. DNA-bindende Proteine wurden durch DNAse Behandlung freigesetzt (Fraktion 3) und bildeten die Kernfraktion. Die Unterschiede in der Verteilung der Proteine zwischen den Fraktionen ist in Abb. 23 im Anhang dargestellt. In beiden Proteinfraktionen konnten keine weiteren Proteine gefunden werden, die sich zwischen R6/2 und Kontrollprobenpaaren unterschieden. AAT 1-5 konnte im Gegensatz zur zytoplasmatischen Fraktion (Abb. 4) in der Membranfraktion von Kontrollmäusen nur noch in geringen Mengen nachgewiesen werden, was entweder auf teilweise Membranassoziation oder auf geringfügige Überlappung der Proteinverteilung mit der zytoplasmatischen Fraktion zurückzuführen ist
Eine in der pH-Region von 3,5 bis 6 identifizierte Spotgruppe (siehe 5.2.2) mit einem Molekulargewicht von 70 kDa, welche dem Protein Contraspin zugeordnet werden konnte, zeigte eine im großen und ganzen verminderte Expression in der zytoplasmatischen Fraktion des Gehirns. Der Grad der Expressionsverminderung in R6/2 Gehirnen war jedoch auch nahe dem Endstadium der Erkrankung zwischen den Probenpaaren heterogen
In der pH-Region von 6 bis 9,5 war ein quantitativer Unterschied in der Expression bei einem Spot in allen acht Probenpaaren zu sehen (Abb. 7, Tab. 6). Der Spot wurde dem Protein αB-Kristallin (ABC) mittels Massenspektrometrie zugeordnet (Datenbankeintragung: αB-crystallin; Swiss Prot. Nr.: P23927). Das Molekulargewicht von ungefähr 23 kDa, welches für ABC bestimmt wurde, unterscheidet sich um 2,5 kDa vom berechneten Wert von 20,5 kDa. Der isoelektrische Punkt wurde mit Hilfe des Gels auf 7,5 bestimmt. Dies ist ein Unterschied von 0,6 pH-Einheiten zum berechneten Wert. Beide zuvor genannten Veränderungen könnten darauf hindeuten, dass eine Modifikation des Proteins stattgefunden hat.
ABC wurde auch in der Kern- und Membranfraktion gefunden. Die Expression in beiden Fraktionen nahm gegenüber der zytoplasmatischen Fraktion nicht ab. Die Expression von ABC bei R6/2 Mäusen war wie in der zytoplasmatischen Fraktion geringer als bei Kontrollmäusen. (Abb. 8 und 9).
Die Expression von AAT 1-5 und ABC in der zytoplasmatischen Fraktion von drei ausgewählten Krankheitsstadien, früh (vier Wochen), fortgeschritten (acht Wochen) und nahe dem Endstadium (zwölf Wochen) wurden nun untersucht um einen Überblick über die Expression im Krankheitsverlauf zu erhalten.
Im Frühstadium der Erkrankung im Alter von vier Wochen war bei R6/2 Mäusen AAT 1-5 heterogen exprimiert (Tab. 6). In einer R6/2 Maus war die AAT 1-5 Expression auf einem vergleichbaren Niveau wie bei zwölf Wochen alten Kontrollmäusen, wohingegen andere R6/2 Mäuse überhaupt keine nachweisbare Expression zeigten. Die Expression von AAT 1-5 bei vier Wochen alten Kontrollmäusen war jedoch genauso heterogen wie bei R6/2 Mäusen. Dies deutet darauf hin, dass AAT 1-5 bei R6/2 Mäusen anfänglich auf einem Niveau sehr ähnlich dem der Kontrollmäuse exprimiert wurde. Nach dem Fortschreiten der Erkrankung konnte im Alter von acht Wochen AAT 1-5 im Gehirn bei fünf von acht R6/2 Mäusen nur noch in geringen Mengen gefunden werden, wohingegen Kontrollmäuse im Alter von acht Wochen ein hohes Expressionsniveau des Proteins zeigten (Abb. 10 und Tab. 6). Die Expressionsabnahme der drei Spots erfolgte gleichzeitig, was auf eine Beteiligung aller drei Varianten im gleichen oder einem eng verknüpften Prozess hindeutet. Nahe dem Endstadium der Erkrankung im Alter von zwölf Wochen ist, wie unter 5.1.1.1 bereits dargestellt, keine Expression von AAT 1-5 bei R6/2 Mäusen mehr
Die Menge an exprimiertem ABC stieg bei Kontrollmäusen mit zunehmendem Alter stetig an. Die Zunahme war bei allen Mäusen gleich. Die Expression bei R6/2 Mäusen verblieb höchstens auf dem Level von vier Wochen (Abb. 11 und Tab. 6). Eine Heterogenität zwischen den Probenpaaren, wie bei AAT 1-5 (vier und acht Wochen), war nicht zu beobachten. Dies deutet darauf hin, dass das Protein im Verlauf der Erkrankung verbraucht oder/und in geringerem Maße produziert wurde.
In Vorversuchen mit C57Bl/6 Mäusen wurde nun die Geschlechtsspezifität der Expression von AAT 1-5 und ABC im Gesamtgehirn und einzelnen Gehirnregionen untersucht. An dieser Stelle ist es wichtig anzumerken, dass die 2D Gel Spotmuster von CBAxC57Bl/6 Mäusen (genetischer Hintergrund der transgenen R6/2 Mäuse und Kontrollmäuse) und C57Cl/6 Mäusen ziemlich gut miteinander übereinstimmen und die Positionen und Intensitäten der Spots (Kontrolltiere) der beiden Proteine von Interesse (AAT und ABC) in beiden Mäusestämmen identisch sind.
Die bisherigen Ergebnisse wurden ausschließlich unter Verwendung von männlichen Mäusen erzielt. Nun sollten auch Gehirne von weiblichen Mäusen untersucht werden. Auf der Ebene des Gesamtgehirns konnte keine AAT 1-5 Expression in weiblichen C57Bl/6 Mäusen nachgewiesen werden (Tab. 8A). Eine Untersuchung verschiedener Gehirnregionen, von drei weiblichen Mäusen ergab, dass AAT 1-5 in bestimmten
ABC wurde im Gehirn von männlichen und weiblichen Tieren exprimiert (Tab. 8A). Das Expressionsniveau von ABC in verschiedenen Gehirnregionen bei weiblichen Mäusen entsprach der Expression im Gesamtgehirn beim Männchen mit Ausnahme des Nervus Trigeminus (sehr hoch) und der Hypophyse (gering) (Tab. 8B und Abb. 15).
Die drei Proteine (AAT, CTS und ABC), deren Expression sich zwischen dem R6/2 Mausmodell und der Kontrolle HD-spezifisch unterschied, wurden nun in drei menschlichen Gehirnregionen von HD postmortem Gewebe und Blutplasma untersucht (Tab. 7).
Eine Gruppe bestehend aus 6 Spots wurde auf der Gelhälfte mit niedrigem pH-Wert (3,5 – 6) gefunden, während in Kontrollgelen im gleichen Bereich nur drei Spots zu sehen waren (Abb. 12). Dies deutet auf Spotduplizierung hin, welche durch eine Erhöhung des Molekulargewichts oder durch eine Veränderung der Proteinstruktur hervorgerufen worden sein könnte. Diese veränderte Expression wurde im Striatum und Parietallappen von einer weiblichen und einer männlichen Person, welche von HD betroffen waren, gefunden (Abb.
12). Zwei von vier Proben vom vorderen Gyrus Cinguli von weiblichen HD Patienten
Die Isoform des Proteins ABC, welche sich bei der Maus im Verlauf der Erkrankung änderte, konnte in den untersuchten, menschlichen Gehirnregionen nicht gefunden werden (Resultate werden nicht gezeigt). Dies ist wahrscheinlich auf eine zu geringe Expression der bei der Maus gefundenen Isoform von ABC im menschlichen Gehirn zurückzuführen, da der Spot im menschlichen Herzen bereits gefunden wurde [102]. Der pI und das Molekulargewicht von ABC sind bei Mensch und Maus nahezu identisch [102].
In R6/2 Mäusen wurden Proteinaggregate, die N-terminale Fragmente des HD-verursachenden Proteins Htt enthalten, in Form von nukleären Einschlüssen in verschieden Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems gefunden [63]. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob sich die Expression der im Gehirn gefundenen Proteine (AAT, CTS und ABC) auch in anderen Organen krankheitsspezifisch ändert. Mit der Untersuchung des Gehirns wurde ein Organ ausgewählt, welches hauptsächlich aus dem Ektoderm, einem der drei embryonalen Keimblätter, gebildet wird. Bei der Auswahl der weiteren, untersuchten Organe wurde nun je ein Vertreter des Mesoderms (Herz) und des Endoderms (Leber) ausgewählt. Da R6/2 Mäuse reproduktive Schwierigkeiten aufweisen [41] und die Testes von fünf in der Literatur bereits untersuchten Geweben (Muskel, Testes, Leber, Niere und Milz) den höchsten Atrophiegrad aufwiesen [63], wurden diese, als weiterer Vertreter des Mesoderms, untersucht.
AAT 1-5 konnte im Herzen, in der Leber und den Testes von C57Bl/6 Mäusen nachgewiesen werden (Tab. 8A).
ABC wurde nur im Gehirn und Herzen von C57Bl/6 Mäusen detektiert (Tab. 8A; siehe auch Abb. 7, 8, 9, 11 und 15 (Gehirn); Abb. 18 (Herz)). Die Expression in den verschiedenen Gehirnregionen war gleichmäßig hoch mit Ausnahme des Nervus Trigeminus (sehr hoch) und der Hypophyse (niedrig) (Tab. 8B). Abb. 15 zeigt exemplarisch am Beispiel der Expression von ABC in verschiedenen Gehirnregionen, wie die Intensitätsunterschiede der ABC Spots verschiedenen Symbolen (+ - ++++) zugeordnet wurden. Die mit den Organen von gesunden Mäusen gewonnenen Daten für die Expression von AAT und ABC in verschiedenen Geweben bildeten nun die Grundlage für die Untersuchung der Expression von AAT 1-5 und ABC in Herz, Testes und Leber von R6/2 Mäusen.
Es wurde nun die zytoplasmatische/nukleoplasmatische Fraktion des Proteinextrakts aus dem Herzen von R6/2 Mäusen auf differentielle Proteinexpression der beiden im Gehirn gefundenen Proteine, AAT 1-5 und ABC, untersucht. Außerdem sollte geklärt werden, ob weitere Proteine in diesem Organ zwischen R6/2 und Kontrollmäusen krankheitsspezifisch differentiell exprimiert wurden.
AAT 1-5 wurde auch im Herzen bei R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung stark vermindert exprimiert (Abb. 16 A). Die Anzahl der unterschiedlichen AAT 1-5 zugeordneten Spots erweiterte sich von drei im Gehirn auf mindestens fünf im Herzen (Abb. 16 A). Die im Herzen gefundene Dreispotgruppe (Abb. 16 A, rechte Seite) war wie auch schon im Gehirn nur in Kontrollgehirnen vorhanden. Neben der bereits identifizierten
AAT-Isoform AAT 1-5 (Abb. 16 A) wurde die Isoform AAT 1-4 (Abb. 16 B;
Ein weiteres, bei HD in der Maus differentiell exprimiertes SERPIN, Contraspin (CTS) (Datenbankeintrag: contraspin; Swiss-Prot # Q62257), konnte neben dem Gehirn, auch im Herzen identifiziert werden (Abb. 16 (C und D) und 17). Spotgruppen von CTS wurden an zwei verschiedenen Orten im Gel gefunden. Die Gruppen besaßen einen gemeinsamen, beobachteten pI von ungefähr 5 und zwei unterschiedliche Molekulargewichte von 70 kDa (Gruppe mit 7 Spots; Abb. 16 C) und 170 kDa (Gruppe mit 6 Spots; Abb. 16 D und 17). Wie bereits bei AAT 1-4 und AAT 1-5 festgestellt, wich auch das Molekulargewicht der 70 kDa Isoform, welches mit Hilfe der Mobilität in der Großgel 2D-Elektrophorese bestimmt worden war, beträchtlich (23 kDa höher) von dem berechneten Wert (46,6 kDa) [103] ab.
ABC wird im Herzen bei R6/2 und Kontrollen auf hohem Niveau exprimiert. Die Lokalisation des einzelnen Spots im Gel war im Gehirn und Herzen identisch. Die Spotintensitäten sind auch im Alter von zwölf Wochen bei sehr weit fortgeschrittener Erkrankung nahezu identisch, d. h. es gibt keine differentielle ABC Expression im Herzen (Abb. 18).
Im Herzen beginnt während der Erkrankung die Expression der SERPINE AAT und CTS (beide Isoformen) im Alter von acht Wochen abzunehmen, wobei eine ausgeprägte Expressionsverringerung erst im Alter von zwölf Wochen, nahe dem Endstadium der Erkrankung, zu sehen ist (Tab. 9 und 10).
Nachdem im Gehirn und im Herzen die beiden SERPINE, AAT und CTS, im Krankheitsverlauf vermindert exprimiert worden waren, wurde nun deren Expression und die von ABC bei stark atrophischen Testes von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung auf eine krankheitsspezifische Veränderung untersucht. Der starke Gewichtsverlust der Testes parallel zum Fortschreiten der Erkrankung ließ auf die Identifizierung weiterer Proteine hoffen.
AAT war in den Testes, wie im Herzen bereits gezeigt, in mindestens sieben Spots differentiell exprimiert (Abb. 19). Auch hier wurden sowohl die Isoform AAT 1-4 (2 Spots, Abb. 19 B) als auch AAT 1-5 (5 Spots, Abb. 19A) gefunden. Bei allen Probenpaaren konnte eine differentielle Expression von AAT 1-5 nachgewiesen werden (Abb. 19). Eine differentielle Expression von AAT 1-4 war nur in drei von vier Probenpaaren zu beobachten (Abb. 19, Probenpaar 4 (B), kein Unterschied). Dies könnte dadurch zu erklären sein, dass die R6/2 Testes bei Probenpaar 4 im Gegensatz zu den
CTS unterschied sich bei zwölf Wochen alten Mäusen auch in den Testes in der Expression bei der 70 kDa Isoform, wobei die quantitativen Unterschiede etwas geringer als im Herzen waren. (Abb. 19 vs. Abb. 16). Die 170 kDa Isoform konnte in drei von vier Probenpaaren bei der Kontrolle jedoch nicht bei R6/2 nachgewiesen werden, wobei die
Während des Fortschreitens der Erkrankung begann die Expression von AAT und CTS im Alter von acht Wochen geringfügig abzunehmen. Eine ausgeprägte Expressionsverringerung war erst im Alter von zwölf Wochen zu sehen ist (Tab. 9 und 10). Die Expression der 170 kDa-Isoform von CTS war im Alter von acht Wochen in den Testes kaum nachweisbar, sodass keine verlässlichen Angaben über den zeitlichen Verlauf des Expressionsniveaus bei dieser Spotgruppe gemacht werden können (Daten werden nicht gezeigt).
Durch die Untersuchung des Proteoms des Gehirns (Endoderm) und der aus dem Mesoderm stammenden Organe, Herz und Testes, wurden drei, im Krankheitsverlauf differentiell exprimierte Proteine, AAT, CTS und ABC identifiziert. Obwohl von einem hohen Gewichtsverlusts im Laufe der Erkrankung betroffen, fand sich in den Testes kein weiteres, krankheitsspezifisch verändert exprimiertes Protein. Dies lässt darauf schließen, dass die unterschiedliche Expression der gefundenen Proteine primär krankheitsspezifisch war, und nicht auf Sekundärprozesse wie z. B. Atrophie, zurückzuführen war. Die Untersuchung der Leber aus dem Endoderm rundet die Untersuchung der drei Keimblätter ab.
AAT zeigte bei zwölf Wochen alten Mäusen in der Leber ein Expressionsniveau, welches geringer als im Herzen und ungefähr vergleichbar mit den Testes war (Abb. 20 vs. Abb. 16 und 19). AAT 1-5 war, wie in Herz und Testes, mit fünf Spots exprimiert. Zwei Spots mit differentieller Expression in Testes und Herz waren in der Leber nicht verändert (Abb. 19
Eine Expression der 70 kDa Isoform von CTS (Abb. 20 C) war in R6/2 Mäusen im Alter von zwölf Wochen im Gegensatz zur Kontrolle nicht nachweisbar. Die 170 kDa Isoform von CTS war in der Leber im Gegensatz zu Herz und Testes auch in der Kontrolle nicht nachweisbar (Daten für Leber werden nicht gezeigt). Das allgemeine Expressionsniveau der 70 kDa Isoform von CTS war in der Leber von Kontrolltieren war geringer als im Herzen, aber vergleichbar mit den Testes und höher als im Gehirn.
Ein außergewöhnlicher, aber leberspezifischer Unterschied in der Proteinexpression, bestand aus einem Muster von mindestens neun Spots, welche als zu den Major Urinary Proteins (MUPs) zugehörig identifiziert wurden (Datenbankeintrag: MUP1_mouse, Swiss-Prot # P11588). Die exakte MUP-Isoform für jeden Spot konnte mit Hilfe der Massenspektrometrie nicht zugeordnet werden. Ein pI Wert im Bereich von 4,9 bis 5,3 und ein Molekulargewicht von 22 kDa wurde für die Proteine mit Hilfe der Gelmobilität bestimmt. Diese Werte korrelieren gut mit Literaturdaten für den pI von 4,6 bis 5,3 [104] und einem berechneten Molekulargewicht von ungefähr 21 kDa (Datenblätter zu den Swiss-Prot. Eintragen für murines MUPs). Die Expression dieser Proteine war in zwölf Wochen alten R6/2 Mäusen stark reduziert (Abb. 21).
Eine stark verminderte Expression von MUPs wurde auch im Urin von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung gefunden (Abb. 22).
Im Krankheitsverlauf unterschied sich die Expression AAT, CTS und MUPs zwischen R6/2 und Kontrollmäusen erst im Alter von 12 nicht jedoch 8 Wochen (Abb. 20 und 21 sowie Tab. 9 und 10).
Bei dieser Arbeit wurde Gewebe aus den drei Keimblättern, Ektoderm (Gehirn), Mesoderm (Herz und Testes) und Endoderm (Leber) untersucht. Eine wichtige Erkenntnis der Untersuchung dieser Gewebe ist, dass die AAT 1-5 Expression im Gehirn im Gegensatz zu den anderen drei Organen schon im Alter von acht und nicht erst mit zwölf Wochen signifikant erniedrigt war (Tab. 9A). Die Abnahme von CTS nahe dem Endstadium der Erkrankung (zwölf Wochen) ist im Gehirn und bei den Testes geringer als bei der Leber und im Herzen (Tab. 10A und Daten nicht gezeigt (Gehirn)). ABC war im Gehirn und Herzen und nicht in den Testes und der Leber nachweisbar (Tab. 8A) und nur im Gehirn von R6/2 Mäusen vermindert exprimiert (Tab. 6, Abb. 7, 9 und 11 vs. Abb. 18). Die Expression von AAT, CTS und MUPs ist bei männlichen viel höher als bei weiblichen Mäusen. Die Untersuchungen wurden deswegen an männlichen Mäusen durchgeführt. Es konnte somit eine Expressionsabnahme von Proteinen aus drei verschiedenen Proteinfamilien beobachtet werden – zwei SERPINE (AAT und CTS), ein Chaperon (ABC) und ein zur Lipocalinfamilie gehöriges Protein (MUPs, [105]). Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für Gewebe von zwölf Wochen alten Mäusen zeigt Tab. 11.
Beim Vergleich des Proteoms von HD Exon 1 transgenen Mäusen und Kontrollmäusen traten nahe dem Endstadium der Erkrankung nur wenige, aber krankheitsspezifische Unterschiede im Proteinmuster auf. Der größte Teil der exprimierten Proteine war identisch. Mit Hilfe der gefundenen Expressionsunterschiede konnte zum ersten Mal auf Proteinebene gezeigt werden, dass AAT und ABC in ihrer Expression im Gehirn eines Mausmodells für HD während des Krankheitsverlaufs abnehmen. Nahe dem Endstadium der Erkrankung sinkt die Expression von AAT bis unterhalb der Nachweisgrenze einer Silberfärbung von 2 ng ab. Die ABC Expression ist zu diesem Zeitpunkt im Gehirn stark reduziert. Ein weiteres SERPIN, CTS, war in einigen Probenpaaren nahe dem Endstadium im Expressionsniveau erniedrigt. Die Untersuchung der Organe Herz, Testes und Leber zeigte, dass das Expressionsniveau von AAT und im Gegensatz zum Gehirn, CTS, nahe dem Endstadium der Erkrankung stark vermindert ist. Die AAT Expression im Gehirn war im Gegensatz zu den anderen untersuchten Geweben schon im Alter von 8 und nicht erst mit 12 Wochen deutlich erniedrigt. Außer den drei genannten Proteinen war bei HD Mäusen ein weiteres Protein betroffen, MUPs. Die Herunterregulierung des leberspezifischen MUPs Proteins deutet darauf hin, dass zumindest im Mausmodell das Huntingtin Transgen auch die Expression von Proteinen beeinflusst, die im Gehirn nicht vorkommen. Untersuchungen am Menschen mit HD wurden für verschiedene Gehirnregionen durchgeführt (Striatum, der Parietallappen und der vordere Gyrus Cinguli). Ein für Huntington’s Chorea charakteristisches abnormes Spot Muster, welches dem Protein AAT zugeordnet werden konnte, wurde in drei Postmortem Gehirnregionen festgestellt. Diese Beobachtung bildet den Brückenschlag zwischen dem Mausmodell und der Erkrankung beim Menschen.
AAT ist ein Protein, das hauptsächlich in der Leber produziert wird und bei der Akutphasenantwort mitwirkt [106], d. h. es wird in dem Bestreben sekretiert, bleibenden Gewebeschaden nach Beschädigung des Gewebes zu vermeiden [106]. Im Gehirn wird
AAT nimmt in der Expression bei Maus und Mensch während des Krankheitsverlaufes ab.
Gestützt auf die Literaturdaten über das Fortschreiten der Erkrankung [22, 60, 61], scheint die Abnahme von AAT im Alter von acht Wochen (Abb. 10 und Tab. 6) im Gehirn ein späterer Vorgang zu sein, welcher mit einer Zunahme des Schweregrades der Erkrankung einhergeht. Die Anzahl der unterschiedlich stark exprimierten AAT Spots und der Gesamtanzahl der AAT Spots (unterschiedlich/gesamt) unterscheidet sich in Gehirn (3/3), Leber (5/7), Testes (7/7) und Herz (7/7) und es scheinen im Mausmodell mehrere Isoformen beteiligt zu sein (AAT 1-4 und AAT 1-5). Trotz der unterschiedlichen Zahl der exprimierten Spots ist festzustellen, dass die Expression von allen Isoformen und Spots im Verlauf der Erkrankung abnimmt. Die Abnahme der Expression des SERPINS CTS könnte, da es mit AAT zumindest eine gemeinsame Spezifität besitzt [108] und eine 44 %ige Sequenzidentität aufweist [109], die gleichen Ursachen haben wie die von AAT.
Es konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass sich die AAT Expression im Striatum und dem Parietallappen zwischen postmortem HD-, im Endstadium der Erkrankung, und Kontrollgehirnen unterschied (Abb. 12). Dies steht in Einklang mit der Beobachtung, dass bei HD, mit fortschreitender Erkrankung, vor allem das Striatum von einem Verlust an Neuronen und Atrophie betroffen ist [54, 110]. Die Untersuchung eines früheren Stadiums der Erkrankung könnte nun Aufschluss über den zeitlichen Verlauf der Erkrankung geben. Ein frühes Stadium der Erkrankung kann durch den vorderen Gyrus Cinguli simuliert werden. Es hat sich gezeigt, dass dieser selbst bei Grad 3 und 4 Gehirnen (Tab. 7) nach makroskopischer Begutachtung (Untersuchung durchgeführt am: Harvard Brain Tissue Resource Center) morphologisch nicht von Atrophie betroffen war. Er bildet somit ein Modell für mögliche pathologische Veränderungen, die bei der Proteinexpression vor allem im Striatum zu Beginn der Erkrankung auftreten. Es konnte in dieser Studie nachgewiesen werden, dass nur zwei von vier der untersuchten vorderen Gyrus Cinguli
AAT wurde in der Maus und im Menschen mit unterschiedlichem pI und Molekulargewicht identifiziert. Das bei der Maus differentiell exprimierte AAT besitzt ein Molekulargewicht von 61 kDa. Es handelt sich wahrscheinlich um die unprozessierte Form des Proteins mit 46 kDa und 413 Aminosäuren. Die Ursache für das um 15 kDa erhöhte Molekulargewicht in der SDS-PAGE ist wahrscheinlich die globuläre Konformation von AAT. Diese Konformation führt zu einer verminderten Bindung von SDS und demzufolge zu einer geringeren Mobilität bei der SDS PAGE [111]. Das sechs AAT-Spots umfassende Muster beim Menschen besitzt einen um 0,6 pH Einheiten niedrigeren pI Wert und ein ungefähr um 20 kDa geringeres Molekulargewicht. Selbst die Entfernung der angenommenen Signalsequenz bei AAT, welche aus den Aminosäuren 1 – 24 besteht, durch Prozessierung des Proteins, würde nur zu einer geringfügigen Molekulargewichtsverminderung des Proteins auf 43 kDa und keiner signifikanten pI-Wert Änderung führen [103]. Die für die geringere SDS Bindung verantwortliche Proteinstrukturelemente würden durch die Abtrennung der Signalsequenz somit wahrscheinlich kaum oder gar nicht verändert, sodass die beobachtete Masse von ca. 60 kDa ungefähr gleich bleiben sollte. Die Erklärung für das in der PAGE beobachtete Molekulargewicht von 40 kDa muss also eine andere sein. Es ist in der Literatur bereits beschrieben worden, dass AAT in Gegenwart von Heparin und Glukose gespalten wird. Das Protein Fragment, welches nach der Spaltung auftrat, hatte ein Molekulargewicht von 45 kDa (durch SDS-PAGE bestimmt) [112] was im Bereich des gefundenen 40 kDa Proteins liegt. Beim Menschen könnte also eine Prozessierung oder Abbau von AAT durch
Im Gegensatz zu einem einzelnen menschlichen AAT Gen wurde gezeigt, dass Mäuse, die zur Spezies Mus Musculus gehören, mindestens fünf Gene besitzen [113]. In C57Bl/6 Mäusen befinden sich sowohl zwei „orthodoxe“ Gene, mit dem Menschen gleichender Aminosäuresequenz im reaktiven Zentrum, als auch drei „unorthodoxe“ Gene mit abweichender Sequenz, auf Chromosome 12. Das reaktive Zentrum eines SERPINS ist die Region wo die Serinprotease zwischen der variablen Aminosäure an Position P1’ und dem konservierten Serin an Position P1 schneidet, bevor sie einen unauflöslichen, hemmenden Komplex mit dem SERPIN formen kann [113, 114]. Die Aminosäure an Position P1’ variiert zwischen Methionin (einzige beim Menschen an dieser Position vorkommende Aminosäure, darum „orthodox“) Thyrosin oder Leuzin (beide nicht menschähnlich, deshalb nicht orthodox) [113]. Die in der Studie gefundenen AAT Varianten, AAT 1-4 und
Nachdem nun nachgewiesen werden konnte, dass die Expression von AAT bei HD sich im Verlauf der Erkrankung ändert war es interessant zu untersuchen welche Rolle AAT bei der Erkrankung spielen könnte. AAT wurde bereits mit der Pathologie von Alzheimer, eine weitere schwerwiegende, neurodegenerative Erkrankung, in Zusammenhang gebracht. Es kommt in senilen Plaques vor und schützt vor der Toxizität von amyloiden Peptiden [107, 116]. AAT schützt die Tumorzellinie I5, welche aus Inselzellen des Pankreas der Ratte hervorgegangen ist, in Gegenwart der Peptide Aβ1-42, Aβ1-40 und Aβ25-35, deren fehlgeleitete Generierung bei Alzheimer toxisch wirkt, vor Zelltod. Zur Aufrechterhaltung der Schutzfunktion war die protease-hemmende Wirkung wichtig [116]. Die Zelltod-hemmende Wirkung von AAT könnte darauf beruhen, dass dieses den Abbau der extrazellulären Matrix (gezeigt bei vaskulären, glatten Muskelzellen) hemmt. Dies wiederum verhindert die Aktivierung von Kaspasen und verringert so den Zelltod [117]. Es gibt noch weitere Hinweise, dass bei der Zelltodverhinderung durch AAT, die indirekte Hemmung von Kaspasen, die bei Apoptose eine wichtige Funktion haben [24], eine Rolle spielt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass hohe Konzentrationen von AAT, die Aktivierung der Kaspasen 1 und 3 in einem Ischämie/Reperfusions-Experiment in der
In der vorliegenden Untersuchung geht die stark verringerte ABC Expression im Alter von acht Wochen (Abb. 11 und Tab. 6) mit dem verstärkten Auftreten von neuropilen Aggregaten bei R6/2 Mäusen einher [22]. Es ist interessant, dass diese Verminderung von ABC im Gehirn, nicht aber im Herzen beobachtet werden konnte (Abb. 11 und Tab. 6 vs. Abb. 18). Dies könnte einerseits damit zusammenhängen, dass der Verlauf der Erkrankung in verschiedenen Organen unterschiedlich ist oder dass der Expressionslevel von ABC im Herzen viel höher als im Gehirn ist (Abb. 18 vs. Abb. 7 und 11). Abb. 18 zeigt jedoch nicht zu unterscheidende Spotintensitäten bei drei repräsentativen Probenpaaren im Herzen bei R6/2 und Kontrolle. Die Intensitäten der umgebenden Spots zeigen auch keine Unterschiede, sodass die organspezifische Abnahme der Expression sehr viel wahrscheinlicher ist. Es konnte auch bereits gezeigt werden, dass die Konzentration von ABC bei kardiovaskulären Erkrankungen im Herzen ansteigt und es möglicherweise zu schnellen posttranslationalen Modifizierung kommt [121]. Da Erkrankungen im
Die Expression einer Gruppe von Isoformen eines Proteins, die Major Urinary Proteins (MUPs), von denen kein homologes Protein beim Menschen bekannt ist, war in der Leber (Abb. 21 und Tab. 9B) und im Urin (Abb. 22) von Mäusen im Alter von 12 Wochen stark reduziert. Es ist bereits bekannt, dass dieses Protein leberspezifisch exprimiert wird [129]. Die Expression ist in männlichen beträchtlich höher als in weiblichen Mäusen [130]. Die Proteinisoformen von MUPs haben ein Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa, und bilden eine β-Barrel Struktur aus, welche einen hydrophoben Hohlraum umschließt [131]. Dieser Hohlraum dient zum Beispiel als Bindungsstelle für 3,4-Dehydro-Exo-Brevicomin und 2-Sec-Butyl-4,5-Dihydrothiazole [132]. Das Binden an MUPs erlaubt es diesen leicht flüchtigen Liganden, über einen längeren Zeitraum von getrocknetem Urin freigesetzt zu werden [132]. Die Freisetzung dieser Liganden vermittelt den Aggressivitätsstatus eines Männchens an andere Männchen [133] und stimuliert den Eisprung bei Weibchen [134]. Daraus lässt sich ableiten, dass R6/2 Männchen nahe dem Endstadium der Erkrankung nicht länger die Aufmerksamkeit von Weibchen durch Duftmarken auf sich ziehen können, was ihren Erfolg bei der Reproduktion zusätzlich zur Testesatrophie [63] stark vermindert [41]. Erkennung der Individualität bei Mäusen scheint auch vom Vorhandensein der MUPs Proteine abzuhängen, so dass eine Verringerung in der Konzentration dieser Proteine im Urin das Sozialverhalten der Mäuse beeinträchtigen könnte [133]. Es ist bereits bekannt, dass das Gewicht der Testes in transgenen Mäusen beginnt ab dem Alter von ca. acht Wochen abzunehmen [63], was ungefähr mit dem Beginn der Abnahme der MUPs Konzentration im Urin zusammenfällt. Es konnte bereits bei Ratten gezeigt werden, dass die MUPs-Expression, bei einem experimentellen Modell für Schlaganfall, herunterreguliert war [135]. Dies könnte bedeuten, dass dieses Protein empfindlich gegenüber vielfältigen krankhaften Veränderungen bei Mäusen und Ratten ist und dafür
Die bei dieser Arbeit verwendete Proteomanalyse bot die Möglichkeit, Tausende von Proteinen von verschiedenen Organen parallel zu untersuchen. Mit Hilfe dieses breit angelegten Ansatzes konnten vier bei HD differentiell exprimierte Proteine aus sehr unterschiedlichen Familien in einem Mausmodell identifiziert und deren Expressionsmuster zeitlich aufgelöst werden. Bei den Proteinen handelt es sich um AAT und CTS, beides SERPINE, ABC, ein Chaperon und Mitglied der Familie der kleinen Hsp sowie MUPs, ein Lipocalin. Die Expressionsabnahme von AAT, CTS und ABC im Gehirn während des Krankheitsverlauf weist darauf hin, dass die Aufrechterhaltung der normalen Konzentration der Proteine möglicherweise den Zelltod von Gehirnzellen verringern und damit nützlich bei der Verzögerung des Fortschreitens der Erkrankung sein könnte. Unterstützt wird die Hypothese dadurch, dass bereits gezeigt werden konnte, dass sowohl SERPINE als auch Chaperone bei der Verminderung von Zelltod in neurodegenerativen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Die gleichzeitige Abnahme der Konzentration von AAT und CTS lässt auf einen krankheitsrelevanten Prozess bei HD schließen, an dem mehrere SERPINE, mit vielleicht nur teilweise überlappenden Spezifitäten beteiligt sind. Die unterschiedliche Expression von MUPs bei R6/2 Mäusen kann als leicht zugänglicher, klinischer Marker für das Fortschreiten von HD bei diesen Tieren zum Screenen nach wirksamen Medikamenten Anwendung finden. Nach Verwendung eines Mausmodells zur Charakterisierung des HD Proteoms konnte eine gezielte Suche nach den bei der Maus gefundenen, HD spezifischen, Unterschieden im Proteom von menschlichen HD Gehirnregionen gestartet und für ein Protein, AAT, erfolgreich abgeschlossen werden. Es konnte also gezeigt werden, dass es sinnvoll ist, Mausmodelle für die Untersuchung von Krankheiten beim Mensch im Rahmen einer Proteomics Studie zu verwenden. Generell kommt es im Anschluss an die Proteomuntersuchung darauf an, die gefundenen, krankheitsrelevanten Proteine, hinsichtlich ihrer Wirkungsweise im Krankheitsprozess biochemisch und genetisch genauer zu untersuchen. Hier stößt die biochemische und genetische Charakterisierung jedoch an Grenzen, weil für die meisten Proteine die normalen Funktionen nicht bekannt sind, geschweige denn die Stoffwechselwege in die diese integriert sind.
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Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. Joachim Klose für die Möglichkeit in seinem Labor die Erkrankung Huntington’s Chorea mit Hilfe eines Proteomics Ansatzes zu erforschen und seine immerwährende Unterstützung.
Prof. Gillian Bates, Ph. D., hat durch die Bereitstellung von wertvollen Gewebeproben und durch die enge, konstruktive Zusammenarbeit sehr viel zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
Prof. Dr. rer. nat. Harald Saumweber hat mir durch die Übernahme der Position des Doktorvaters und durch konstruktive Kritik während der Arbeit geholfen den Weg bis zum Ende zu gehen.
Mein Dank gilt Patrick Giavalisco, der durch seine Diskussionsbeträge neue Sichtweisen auf Problemstellungen eingebracht und so die Arbeit sehr bereichert hat.
Die Einsichten vermittelt durch Dr. med. Josef Priller bei Fragen der Neuroanatomie und des Krankheitsverlaufes haben mir sehr beim Verständnis der Erkrankung HD geholfen.
Ich bedanke mich bei Jadranka Segaric für die Aufmunterung und Ermutigung während des Schreibens dieser Arbeit.
Lei Mao hat durch kritische Durchsicht des Manuskripts die Anzahl der Ungereimtheiten im Text reduziert.
Außerdem gilt mein Dank den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe, Nicole Steireif, Ivonne Kläre, Marion Herrmann und Janine Stuwe.
Chung, J. D.; Zabel, C.; Sinskey, A. J. und Stephanopoulos, G. (1997): Extension of sp2/0 hybridoma cell viability through interleukin-6 supplementation, Biotechnology & Bioengineering (Band 55), Nr. 2, Seite 439-446.
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Bianco, A.; Zabel, C.; Walden, P. und Jung, G. (1998): N-Hydroxy-amide analogues of MHC-class I peptide ligands with nanomolar binding affinities, J Pept Sci (Band 4), Nr. 8, Seite 471-8.
Hin, S.; Zabel, C.; Bianco, A.; Jung, G. und Walden, P. (1999): Cutting edge: N-hydroxy peptides: a new class of TCR antagonists, J Immunol (Band 163), Nr. 5, Seite 2363-7.
Hin, S.; Bianco, A.; Zabel, C.; Jung, G. und Walden, P. (2001): Mimetics of a T cell epitope based on poly-N-acylated amine backbone structures induce T cells in vitro and in vivo, J Biol Chem (Band 276), Nr. 52, Seite 48790-6. URL:
Zabel, C; Chamrad, D. C.; Priller, J.; Woodman, B.; Meyer, H. E.; Bates, G. P. and Klose J. (2002) Alterations in the mouse and human proteome caused by Huntington disease, Mol Cell Proteomics (Band 1), Nr. 5, Seite 366-75.
Hiermit versichere ich, dass ich die Arbeit selbständig und nur unter Zuhilfenahme der aufgeführten Hilfsmittel und Literaturquellen angefertigt habe.
Claus Zabel