Im Frühstadium der Erkrankung im Alter von vier Wochen war bei R6/2 Mäusen AAT 1-5 heterogen exprimiert (Tab. 6). In einer R6/2 Maus war die AAT 1-5 Expression auf einem vergleichbaren Niveau wie bei zwölf Wochen alten Kontrollmäusen, wohingegen andere R6/2 Mäuse überhaupt keine nachweisbare Expression zeigten. Die Expression von AAT 1-5 bei vier Wochen alten Kontrollmäusen war jedoch genauso heterogen wie bei R6/2 Mäusen. Dies deutet darauf hin, dass AAT 1-5 bei R6/2 Mäusen anfänglich auf einem Niveau sehr ähnlich dem der Kontrollmäuse exprimiert wurde. Nach dem Fortschreiten der Erkrankung konnte im Alter von acht Wochen AAT 1-5 im Gehirn bei fünf von acht R6/2 Mäusen nur noch in geringen Mengen gefunden werden, wohingegen Kontrollmäuse im Alter von acht Wochen ein hohes Expressionsniveau des Proteins zeigten (Abb. 10 und Tab. 6). Die Expressionsabnahme der drei Spots erfolgte gleichzeitig, was auf eine Beteiligung aller drei Varianten im gleichen oder einem eng verknüpften Prozess hindeutet. Nahe dem Endstadium der Erkrankung im Alter von zwölf Wochen ist, wie unter 5.1.1.1 bereits dargestellt, keine Expression von AAT 1-5 bei R6/2 Mäusen mehr nachweisbar. Die Expression bei Kontrollmäusen in diesem Alter war hoch (Abb. 4, 10 und Tab. 6). Das Expressionsmuster des vierten Proteinspots korreliert während des Krankheitsverlaufs nicht vollständig mit dem Dreispotmuster an den untersuchten Zeitpunkten, der Trend stimmt jedoch überein.

Abb. 10: AAT Expression im Verlauf der Erkrankung.

Gelausschnitte jeweils eines repräsentativen Probenpaares im Alter von 4, 8 und 12 Wochen von R6/2 und Kontrollmäusen werden gezeigt (Tab. 6). Eine Reduktion von AAT bei R6/2 Mäusen (Pfeile) erfolgt parallel zum Fortschreiten der Erkrankung.

Die Menge an exprimiertem ABC stieg bei Kontrollmäusen mit zunehmendem Alter stetig an. Die Zunahme war bei allen Mäusen gleich. Die Expression bei R6/2 Mäusen verblieb höchstens auf dem Level von vier Wochen (Abb. 11 und Tab. 6). Eine Heterogenität zwischen den Probenpaaren, wie bei AAT 1-5 (vier und acht Wochen), war nicht zu beobachten. Dies deutet darauf hin, dass das Protein im Verlauf der Erkrankung verbraucht oder/und in geringerem Maße produziert wurde.

Abb. 11: ABC Expression im Verlauf der Erkrankung.

Gelausschnitte jeweils eines repräsentativen Probenpaares im Alter von 4, 8 und 12 Wochen von R6/2 und Kontrollmäusen werden gezeigt (Tab. 6). Die ABC Expression bei R6/2 Mäusen (Pfeile) nimmt während des Krankheitsverlaufs im Gegensatz zur Kontrolle nicht zu.

Die bisherigen Ergebnisse wurden ausschließlich unter Verwendung von männlichen Mäusen erzielt. Nun sollten auch Gehirne von weiblichen Mäusen untersucht werden. Auf der Ebene des Gesamtgehirns konnte keine AAT 1-5 Expression in weiblichen C57Bl/6 Mäusen nachgewiesen werden (Tab. 8A). Eine Untersuchung verschiedener Gehirnregionen, von drei weiblichen Mäusen ergab, dass AAT 1-5 in bestimmten Regionen in mittlerer bis geringer Menge exprimiert wurde (Tab. 8B). Der Bereich mit der höchsten Expression war der Nervus Trigeminus, aber auch in anderen Regionen, wie der Hypophyse, dem Motorkortex, dem Hippocampus, den Bulbi Olfaktorii und dem Cerebellum wurde das SERPIN nachgewiesen (Tab. 8B). Der nicht geglückte Nachweis von AAT 1-5 auf der Ebene des Gesamtorgans, könnte auf Verdünnung zurückzuführen sein. Große Gehirnregionen wie der Kortex, das Mittelhirn und das Cerebellum exprimierten AAT 1-5 auf sehr geringem oder nicht nachweisbarem Niveau (Tab. 8B). Der Beitrag dieser Gehirnregionen zum Extrakt könnte das in anderen Gehirnregionen vorhandene AAT 1-5 soweit verdünnt haben, dass die Nachweisgrenze der Silberfärbung (2 ng) im Gesamtgehirn unterschritten worden sein könnte.

ABC wurde im Gehirn von männlichen und weiblichen Tieren exprimiert (Tab. 8A). Das Expressionsniveau von ABC in verschiedenen Gehirnregionen bei weiblichen Mäusen entsprach der Expression im Gesamtgehirn beim Männchen mit Ausnahme des Nervus Trigeminus (sehr hoch) und der Hypophyse (gering) (Tab. 8B und Abb. 15).

Eine Gruppe bestehend aus 6 Spots wurde auf der Gelhälfte mit niedrigem pH-Wert (3,5 – 6) gefunden, während in Kontrollgelen im gleichen Bereich nur drei Spots zu sehen waren (Abb. 12). Dies deutet auf Spotduplizierung hin, welche durch eine Erhöhung des Molekulargewichts oder durch eine Veränderung der Proteinstruktur hervorgerufen worden sein könnte. Diese veränderte Expression wurde im Striatum und Parietallappen von einer weiblichen und einer männlichen Person, welche von HD betroffen waren, gefunden (Abb.

^[a]Schweregrad der Erkrankung bestimmt nach den Kriterien von Vonsattel [54]; ^[b]Aus den Gehirnen 56 und 99 sowie 93 und 104 wurden Probenpaare gebildet; ^[c]Abkürzungen: LMU, Institut für Neuropathologie, „Ludwig Maximilian“ Universität München HBTRC, Harvard Brain Tissue Resource Center, McLean Hospital, Belmont, MA, USA; CCM, Klinik für Neurologie, Charite Campus Mitte, Berlin; CCVK, Institut für Humangenetik, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin; Str, Striatum; Ptl, Parietallappen; AGC, vorderer Gyrus Cinguli; w, weiblich; m, männlich.

Gehirnbe-zeichnung

Herkunft des Gewebes

Gehirn-region

Pathologie-grad[a]

Alter zum Entnahme-zeitpunkt [Jahre]

Geschlecht

Postmor-teminterval [Stunden]

56^[b]

LMU^[c]

Str, Ptl;

2-3

56

w

56

93

LMU

Str; Ptl;

2-3

61

m

9

99

LMU

Str, Tha;

0

55

w

14

104

LMU

Str; Ptl;

0

59

m

?

B3703

HBTRC

AGC

4

61

w

25

B4226

HBTRC

AGC

4

62

w

28

B4356

HBTRC

AGC

4

61

w

24

B4381

HBTRC

AGC

4

55

w

23

B3700

HBTRC

AGC

0

62

w

16

B3813

HBTRC

AGC

0

58

w

20

B3959

HBTRC

AGC

0

59

w

18

B4625

HBTRC

AGC

0

53

w

24

“F”

CCM

Blut (Plasma)

?

m

-

“M”

CCVK

Blut (Plasma)

0

m

-

Tab. 7: Beschreibung der menschlichen HD und Kontrollgewebe und Blutplasmaproben

Abb. 12: Expression von AAT in drei Regionen von Postmortem-Gehirnen beim Menschen.

Die Abbildung zeigt Gelausschnitte von drei Gehirnregionen, Striatum, Parietallappen und Gyrus Cinguli von Postmortem-Gehirnen von Individuen im Endstadium der Erkrankung und im Alter von ungefähr 60 Jahren (genaues Alter siehe Tab. 7). Die Striatum und Parietallappenproben stammen von den Patienten 93 (HD) und 104 (Kontrolle), die ACG Probe stammt von den Patientinnen B3703 und B3700 (siehe Tab. 7). Pfeile zeigen ein Sechsspotmuster in HD und ein Dreispotmuster in Kontrollgehirnen.

12). Zwei von vier Proben vom vorderen Gyrus Cinguli von weiblichen HD Patienten zeigten das gleiche Muster (Abb. 12 und Abb. 13). Die vier am stärksten gefärbten Spots wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie als das SERPIN AAT identifiziert (Datenbankeintrag: α1-antitrypsin precursor; Swiss Prot. Nr.: P01009), das homologe Protein, welches auch im Mausmodell, unter anderem im Gehirn differentiell exprimiert wurde. Der pI der AAT-Spotgruppe lag bei 4,7 und das Molekulargewicht bei ungefähr 40 kDa. Die Spots unterschieden sich durch einen geringeren pI-Wert (0,6 pH-Einheiten) und einem niedrigeren Molekulargewicht (20 kDa) von denen die bei der Maus gefunden wurden. Diese Unterschiede deuten möglicherweise auf eine Prozessierung von AAT hin. Bei den vorderen Gyrus Cinguli Probenpaaren war die Spotduplizierung auch bei einem Kontrollgehirn zu sehen (Abb. 13). Dieses Gehirn war von einer frischen Blutung im zerebralen und subarachnoiden Raum und einer moderaten, akuten Enzephalopathie des hypoxisch-ischemischen Typs (Bericht der Neuropathologie bereitgestellt durch das „Havard Brain Tissue Resource Center“) betroffen. Bei dieser Gehirnregion wurde ein Anstieg der Expression des „Glial Fibrillary Acidic Protein“ (GFAP) festgestellt, was auf Gliose in dieser Gehirnregion schließen lässt. In zwei der drei verbleibenden Kontrollgehirne des vorderen Gyrus Cinguli wurden keine Abnormitäten diagnostiziert. Das dritte Gehirn zeigte einen schwach differenzierten Tumor, welcher mit den Kriterien für ein metastasierendes Melanom übereinstimmt (B4625; Bericht der Neuropathologie bereitgestellt durch das „Havard Brain Tissue Resource Center“). Dieses Kontrollgehirn zeigte jedoch keine Spotduplizierung und keine Erhöhung des Gliosemarkers GFAP (Abb. 13). Vorläufige Untersuchungen bei einer Blutplasmaprobe von einem HD Patienten („F“) zeigten eine leichte Erhöhung der AAT Konzentration (Abb. 14) im Blut. Es konnte jedoch kein Doppelspotmuster von AAT, wie bei den drei untersuchten menschlichen Gehirnregionen, Striatum, Parietallappen und Gyrus Cinguli, (Abb. 14 vs. Abb. 12 und 13), gefunden werden.

Abb. 13: Expression von AAT im vorderen Gyrus Cinguli bei Postmortem-Gehirnen.

Die Probenpaare (HD/Kontrolle) 1 (B3703 und B3700), 2 (B4226 und B3813), 3 (B4356 und B3959) und 4 (B4381 und B4625) zeigen die Expressionen von AAT bei vier verschiedenen, weiblichen HD Patienten im vorderen Gyrus Cinguli und den entsprechenden dem Alter und Geschlecht angepassten Kontrollen. Das AAT Spotmuster ist mit einer Ellipse umrandet. Das Sechsspotmuster tritt nur bei zwei von vier Probenpaaren von HD (1 und 2) auf. Das Doppelspotmuster bei der Kontrolle im Probenpaar zwei geht mit erhöhter Expression von GFAP, einem Marker für Gliose, einher.

Abb. 14: Expression von AAT im Blut (Plasma) von einem HD Patienten während der Erkrankung

Die Gelausschnitte zeigen die Expression von AAT im Blut (Plasma) des HD Patienten “F” und in einer Kontrollperson „M“. Eine Erhöhung der AAT Expression ist beim HD Patienten zu erkennen.

AAT 1-5 konnte im Herzen, in der Leber und den Testes von C57Bl/6 Mäusen nachgewiesen werden (Tab. 8A).

 

 

Gewebe

AAT 1-5

ABC

weiblich

männlich

weiblich

männlich

Gehirn

-

+++

+++

+++

Herz

+

+++

+++

+++

Leber

-

+++

-

-

Milz

-

n. d.^[a]

-

-

Testes

n. v.

+++

n. v.

-

Tab. 8: Verteilung von AAT 1-5 und ABC im Gewebe und in Gehirnregionen. Verteilung im Gewebe (Oben). : Verteilung in den Gehirnregionen von weiblichen Mäusen (Unten)

^[a]Erklärung der Symbole siehe Tab. 6; n. d. = nicht durchgeführt; n. v. = bei weiblichen Mäusen nicht vorhanden; ^[b]Der Motorkortex enthält die Amygdala und die Area Entorhinalis. Die Region, welche als Thalamus bezeichnet worden ist, enthält auch den Hypothalamus; ^[c] ++++ weist auf eine Expression von ABC in dieser Gehirnregion hin, als die höher ist als auf der Ebene des Gewebes im Gehirn und Herzen.

Gehirnregion[b]

AAT 1-5

ABC

Nervus Trigeminus

++

++++^[c]

Hypophyse

++

+

Motorkortex

+

+++

Hippocampus

+

+++

Bulbi Olfaktorii

+

++

Cerebellum

-

+++

Striatum

-

+++

Frontaler Kortex

-

+++

Mittelhirn

-

+++

Rhombenzephalon

-

+++

Thalamus

-

+++

Septum

-

+++

ABC wurde nur im Gehirn und Herzen von C57Bl/6 Mäusen detektiert (Tab. 8A; siehe auch Abb. 7, 8, 9, 11 und 15 (Gehirn); Abb. 18 (Herz)). Die Expression in den verschiedenen Gehirnregionen war gleichmäßig hoch mit Ausnahme des Nervus Trigeminus (sehr hoch) und der Hypophyse (niedrig) (Tab. 8B). Abb. 15 zeigt exemplarisch am Beispiel der Expression von ABC in verschiedenen Gehirnregionen, wie die Intensitätsunterschiede der ABC Spots verschiedenen Symbolen (+ - ++++) zugeordnet wurden. Die mit den Organen von gesunden Mäusen gewonnenen Daten für die Expression von AAT und ABC in verschiedenen Geweben bildeten nun die Grundlage für die Untersuchung der Expression von AAT 1-5 und ABC in Herz, Testes und Leber von R6/2 Mäusen.

Abb. 15: Verteilung der ABC Expression in verschiedenen Gehirnregionen

Expression des Chaperons ABC in verschiedenen Gehirnregionen. Es wird eine Korrelation der Spotintensitäten zu den Intensitätssymbolen (+ bis ++++) in Tab. 8B gezeigt. Der Pfeil zeigt den ABC Spot in den verschiedenen Gelausschnitten aus der zytoplasmatischen Fraktion der verschiedenen Gehirnregionen.

AAT war in den Testes, wie im Herzen bereits gezeigt, in mindestens sieben Spots differentiell exprimiert (Abb. 19). Auch hier wurden sowohl die Isoform AAT 1-4 (2 Spots, Abb. 19 B) als auch AAT 1-5 (5 Spots, Abb. 19A) gefunden. Bei allen Probenpaaren konnte eine differentielle Expression von AAT 1-5 nachgewiesen werden (Abb. 19). Eine differentielle Expression von AAT 1-4 war nur in drei von vier Probenpaaren zu beobachten (Abb. 19, Probenpaar 4 (B), kein Unterschied). Dies könnte dadurch zu erklären sein, dass die R6/2 Testes bei Probenpaar 4 im Gegensatz zu den anderen Probenpaaren einen noch höheren Atrophiegrad aufwiesen. Diese wogen noch 20 mg, viel weniger als die Kontrolltestes mit 262 mg. Dies bedeutet, dass die R6/2 Testes nur noch 7,6 % (w/w) des Kontrollgewichtes besaßen, sodass also über 92 % (w/w) des Gewebes durch Atrophie verloren gegangen sind. Die Proteinzusammensetzung des Restgewebes bei R6/2 (Probenpaar 4) könnte durch diese starke Atrophie stark verändert worden sein. Möglicherweise besteht es nur noch aus Zellen mit höherem AAT Gehalt, welche als einzige überlebt haben könnten. Die Testes der R6/2 Maus des Probenpaares 3, bei dem der AAT 1-4 Expressionsunterschied noch detektierbar war, wog 34 mg, was ein 1,7-fach höheres Gewicht im Vergleich zu Probenpaar 4 (Abb. 19) bedeutet.

Abb. 19: Expression von AAT in Testes nahe dem Endstadium der Erkrankung

Gelausschnitte von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 3 und 4) zeigen eine unterschiedliche Expression von AAT (A und B, alle 7 AAT Spots verändert) und CTS (C und D). Die Expression der schon im Herzen gefundenen 170 kDa Isoform von CTS (D) ist nur bei zwei der drei Probenpaare in der Kontrolle nachweisbar.

CTS unterschied sich bei zwölf Wochen alten Mäusen auch in den Testes in der Expression bei der 70 kDa Isoform, wobei die quantitativen Unterschiede etwas geringer als im Herzen waren. (Abb. 19 vs. Abb. 16). Die 170 kDa Isoform konnte in drei von vier Probenpaaren bei der Kontrolle jedoch nicht bei R6/2 nachgewiesen werden, wobei die Intensität der Spots außer bei Probenpaar 1 nahe an der Nachweisgrenze lag (Abb. 19). Bei den untersuchten R6/2-Kontroll-Probenpaaren war auch die Expression von der 70 kDa CTS Spotgruppe bei zwölf Wochen alten Kontrollmäusen in den Testes geringer als im Herzen (Abb. 19 vs. 16). Es konnten keine weiteren, differentiell exprimierten, Spots gefunden werden.

Während des Fortschreitens der Erkrankung begann die Expression von AAT und CTS im Alter von acht Wochen geringfügig abzunehmen. Eine ausgeprägte Expressionsverringerung war erst im Alter von zwölf Wochen zu sehen ist (Tab. 9 und 10). Die Expression der 170 kDa-Isoform von CTS war im Alter von acht Wochen in den Testes kaum nachweisbar, sodass keine verlässlichen Angaben über den zeitlichen Verlauf des Expressionsniveaus bei dieser Spotgruppe gemacht werden können (Daten werden nicht gezeigt).

AAT zeigte bei zwölf Wochen alten Mäusen in der Leber ein Expressionsniveau, welches geringer als im Herzen und ungefähr vergleichbar mit den Testes war (Abb. 20 vs. Abb. 16 und 19). AAT 1-5 war, wie in Herz und Testes, mit fünf Spots exprimiert. Zwei Spots mit differentieller Expression in Testes und Herz waren in der Leber nicht verändert (Abb. 19 A und 16 A (Pfeile links) vs. Abb. 20 E). Die drei Spots von AAT 1-5 in „A“, die zuerst im Gehirn identifiziert wurden, waren bei R6/2 Mäusen im Alter von zwölf Wochen nicht exprimiert. Die Variante AAT 1-4 in „B“ zeigte Unterschiede in der Expression zwischen R6/2 und Kontrolle.

Abb. 20: Expression von AAT und CTS in der Leber während des Endstadiums der Erkrankung.

Bei den Gelausschnitten der dargestellten drei repräsentativen Probenpaare (1, 2 und 3) von 12 Wochen alten Mäusen ist die Expression von AAT 1-5 A und CTS (C) in R6/2 nicht mehr nachweisbar. Die AAT Variante in AAT 1-4 (B) zeigte eine mäßige Reduktion der Expression und Variante AAT 1-5 E war unverändert (5 Spots verändert; 7 Spots gesamt). Die 170 kDa Isoform von CTS war in der Leber nicht nachweisbar.

Eine Expression der 70 kDa Isoform von CTS (Abb. 20 C) war in R6/2 Mäusen im Alter von zwölf Wochen im Gegensatz zur Kontrolle nicht nachweisbar. Die 170 kDa Isoform von CTS war in der Leber im Gegensatz zu Herz und Testes auch in der Kontrolle nicht nachweisbar (Daten für Leber werden nicht gezeigt). Das allgemeine Expressionsniveau der 70 kDa Isoform von CTS war in der Leber von Kontrolltieren war geringer als im Herzen, aber vergleichbar mit den Testes und höher als im Gehirn.

Ein außergewöhnlicher, aber leberspezifischer Unterschied in der Proteinexpression, bestand aus einem Muster von mindestens neun Spots, welche als zu den Major Urinary Proteins (MUPs) zugehörig identifiziert wurden (Datenbankeintrag: MUP1_mouse, Swiss-Prot # P11588). Die exakte MUP-Isoform für jeden Spot konnte mit Hilfe der Massenspektrometrie nicht zugeordnet werden. Ein pI Wert im Bereich von 4,9 bis 5,3 und ein Molekulargewicht von 22 kDa wurde für die Proteine mit Hilfe der Gelmobilität bestimmt. Diese Werte korrelieren gut mit Literaturdaten für den pI von 4,6 bis 5,3 [104] und einem berechneten Molekulargewicht von ungefähr 21 kDa (Datenblätter zu den Swiss-Prot. Eintragen für murines MUPs). Die Expression dieser Proteine war in zwölf Wochen alten R6/2 Mäusen stark reduziert (Abb. 21).

Abb. 21: MUPs Expression in der Leber nahe dem Endstadium der Erkrankung

Die drei dargestellten, Gelausschnitten von drei repräsentativen Probenpaaren (1, 2 und 3) zeigen eine sehr deutliche Reduktion der MUPs Expression in R6/2 Mäusen im Alter von 12 Wochen.

Eine stark verminderte Expression von MUPs wurde auch im Urin von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung gefunden (Abb. 22).

Im Krankheitsverlauf unterschied sich die Expression AAT, CTS und MUPs zwischen R6/2 und Kontrollmäusen erst im Alter von 12 nicht jedoch 8 Wochen (Abb. 20 und 21 sowie Tab. 9 und 10).

Abb. 22: Stark reduzierte MUPs Expression im Urin von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung

Ein repräsentatives Beispiel eines Gelausschnitts einer Urinprobe von zwölf Wochen alten R6/2 und Kontrollmäusen. Im Gegensatz zum Kontrolle wurde das R6/2 Gel bis zum Sichtbarwerden des Hintergrunds gefärbt, da keine Referenzspots, welche bei R6/2 und Kontrolle gleich exprimiert wurden als Anhaltspunkt für eine identische Färbung vorhanden waren.