Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Mlynek

• Vorwort

• 1  Einleitung

  • 1.1 Neurodegenerative Erkrankungen hervorgerufen durch verlängerte Poly-Glutamin-Wiederholungen

  • 1.2 Die Erkrankung HD

  • 1.3  Ursache der Neurodegeneration bei HD

    • 1.3.1  Zelltod bei Neuronen durch toxische Peptidfragmente

      • 1.3.1.1 Toxische Peptidfragmente sind nur eines von vielen Signalen die Apoptose in der Zelle auslösen können

      • 1.3.1.2  Verlauf der Apoptose in der Zelle

      • 1.3.1.3 Mechanismen, die das Überleben der Zelle sichern

    • 1.3.2 Neurodegeneration als Folge von verstärktem Widerstand von mutiertem Htt gegenüber Proteolyse

    • 1.3.3 Bewertung der „toxischen Peptid“ und der „verminderte Proteolyse“ Hypothese

  • 1.4  Mausmodelle für die Erkrankung Huntington’s Chorea

    • 1.4.1 Mausmodelle für HD mit „Knock in“ von „Full length“ IT15 mit expandiertem CAG

    • 1.4.2 Mausmodelle generiert durch verkürzte Fragmente von IT15 mit expandierten CAG Wiederholungen

    • 1.4.3 Expressionsveränderung auf RNA Niveau bei R6/2 Mäusen

    • 1.4.4 Veränderung bei R6/2 Mäusen auf der Proteinebene

  • 1.5 Durchführung einer Proteomics Studie für HD

    • 1.5.1 Allgemeine Grundlagen für eine Proteomics Studie

    • 1.5.2 Eingrenzung der Vielfalt bei der Proteomics Studie

    • 1.5.3 Auswahl eines geeigneten Modellsystems für HD

    • 1.5.4 Verfügbarkeit der Proben bei Maus und Mensch

    • 1.5.5 Erkenntnisgewinn aus einer Proteomics Studie

• 2 Zielsetzung

• 3 Ergebnisse der Dissertation im Überblick

• 4  Materialien und Methoden

  • 4.1 Tiere und Gewebe

  • 4.2 Gewinnung von Gehirnregionen und anderen Geweben

  • 4.3 Herstellung von Proteinproben

    • 4.3.1 Konzept

    • 4.3.2 Durchführung der Proteinextraktion

      • 4.3.2.1 Plasmatische Fraktion

      • 4.3.2.2 Membranfraktion

      • 4.3.2.3 Kernfraktion

      • 4.3.2.4 Körperflüssigkeiten

  • 4.4 Großgel 2D-Elektrophorese

    • 4.4.1 Die erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung (IEF)

      • 4.4.1.1 Reinigung der 1D Gelröhrchen

      • 4.4.1.2 Herstellung der 1D Gele

      • 4.4.1.3 Probenauftrag und IEF Lauf

    • 4.4.2  Die zweite Dimension: Großgel SDS-PAGE

      • 4.4.2.1 Gießen der Separationsgele

      • 4.4.2.2 SDS-PAGE Lauf

  • 4.5 Anfärbung der Proteine

    • 4.5.1 Saure Silberfärbung zur Spoterkennung

    • 4.5.2 Coomassie Brillant Blue G250 Färbung zur Spotidentifizierung

  • 4.6 Trocknung der 2D Gele

  • 4.7 Spoterkennung

  • 4.8  In-Gel Verdau

  • 4.9 MALDI-TOF-Massenspektrometrie

  • 4.10 Datenbanksuche auf Grundlage der Peptidmassenfingerabdruck-Spektren

  • 4.11 Automatische Interpretation der Fragmentionen Spektren:

• 5  Ergebnisse

  • 5.1 Untersuchung des Gehirnproteoms bei der Maus und beim Menschen

    • 5.1.1  Differentielle Proteinexpression nahe dem Endstadium der Erkrankung im Gehirn bei der Maus

      • 5.1.1.1 R6/2 Mausgehirne zeigen keine Expression von α1-Antitrypsin 1-5 nahe dem Endstadium der Erkrankung

        • 5.1.1.1.1 α1-Antitrypsin1-5 ist in der zytoplasmatischen Fraktion von R6/2 Mäusen nicht mehr nachweisbar

        • 5.1.1.1.2 α1-Antitrypsin in Membran- und Kernfraktion

      • 5.1.1.2 Verminderte Expression von Contraspin im Gehirn von R6/2 Mäusen

      • 5.1.1.3 R6/2 Mausgehirne nahe dem Endstadium der Erkrankung zeigen eine reduzierte Expression von αB-Kristallin

        • 5.1.1.3.1 Verminderte Expression von αB-Kristallin in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion

        • 5.1.1.3.2 Geringere Expression von ABC nahe dem Endstadium der Erkrankung bei R6/2 Mäusen auch in der Membran- und Kernfrakion

    • 5.1.2 Expression von AAT 1-5 und ABC während des Krankheitsverlaufes bei der Maus

      • 5.1.2.1 Verminderung der Expression von AAT 1-5 mit dem Fortschreiten der Erkrankung

      • 5.1.2.2 Verminderung der Expression von ABC mit dem Fortschreiten der Erkrankung

    • 5.1.3 Untersuchung der Geschlechtsspezifität der Expression der differentiell exprimierten Proteine bei der Maus

      • 5.1.3.1 Geringere Expression von AAT 1-5 in weiblichen als in männlichen Mäusen

      • 5.1.3.2 Gleiches Expressionsniveau von ABC in weiblichen und männlichen Mäusen

    • 5.1.4 Veränderte Proteinexpression im Endstadium der Erkrankung beim Menschen

      • 5.1.4.1 Veränderte Expression von AAT bei HD postmortem Gehirnen

      • 5.1.4.2  Expression von ABC ist im menschlichen Gehirn nicht nachweisbar

  • 5.2 Expression von krankheitsrelevanten Proteinen in verschiedenen Geweben

    • 5.2.1 Voruntersuchung zur Expression von AAT 1-5 und ABC in verschiedenen Geweben und Gehirnregionen

      • 5.2.1.1 Expression von AAT 1-5 in unterschiedlichen Geweben

      • 5.2.1.2 ABC Expression in unterschiedlichen Geweben

    • 5.2.2  Untersuchung der differentiellen Proteinexpression im Herzen

      • 5.2.2.1 Verringerte Expression von AAT im Herzen von R6/2 Mäusen

      • 5.2.2.2 Verminderte Expression von Contraspin im Herzen von R6/2 Mäusen

      • 5.2.2.3  Gleiche Expression von ABC in R6/2 – und Kontrollmäusen

      • 5.2.2.4 Expression von AAT und CTS im Verlauf der Erkrankung

    • 5.2.3 Untersuchung der differentiellen Expression von AAT, CTS und ABC in den Testes

      • 5.2.3.1 Verminderte Expression von AAT in den Testes von R6/2 Mäusen

      • 5.2.3.2 Verminderte CTS Expression in den Testes von R6/2 Mäusen

      • 5.2.3.3 Verminderte Expression von AAT und CTS im Verlauf der Erkrankung

    • 5.2.4 Untersuchung der differentiellen Expression von AAT, CTS und ABC in der Leber

      • 5.2.4.1 Verminderte Expression von AAT in der Leber von R6/2 Mäusen

      • 5.2.4.2 Verminderte CTS Expression in der Leber von R6/2 Mäusen

      • 5.2.4.3 Stark verminderte Expression von Major Urinary Proteins in der Leber von R6/2 Mäusen

      • 5.2.4.4 Expression von AAT, CTS und MUPs im Krankheitsverlauf

    • 5.2.5  Zusammenfassung der Ergebnisse aus der Untersuchung verschiedener Gewebe

• 6  Diskussion

  • 6.1 Verhinderung von Zelltod durch AAT

    • 6.1.1 Aufgabe von AAT im Organismus

    • 6.1.2 Charakterisierung und Bewertung der AAT Expression bei HD bei Maus und Mensch

      • 6.1.2.1 Maus

      • 6.1.2.2 Mensch

    • 6.1.3 Differentielle Expression unterschiedlicher AAT Varianten bei Mensch und Maus

      • 6.1.3.1 Zwei Proteinisoformen von AAT bei Maus und Mensch repräsentieren zwei Zustände im gleichen Prozess

      • 6.1.3.2 Gemeinsamer Wirkmechanismus für AAT in humanem und murinem HD trotz unterschiedlicher Anzahl an AAT Proteinen zwischen den Spezies

    • 6.1.4 Mechanismus der Zelltodhemmung durch AAT

  • 6.2 Verminderte ABC Expression im Verlauf der Erkrankung

  • 6.3 Veränderte MUPs Expression bei transgenen R6/2 Mäusen

• 7  Zusammenfassung

• Abkürzungsverzeichnis

• Literaturverzeichnis

• Anhang

• Danksagung

• Lebenslauf

• Eigene Veröffentlichungen

• Eidesstattliche Erklärung

• Tab. 1: Pathologie bei HD – Basis, Phänotyp, Pathologie und molekulare Grundlagen

• Tab. 2: Zusammenfassung der Arbeitsschritte für die Proteinextraktion in verschiedenen Geweben

• Tab. 3: Chemische Zusammensetzung des Separationsgels

• Tab. 4: Chemische Zusammensetzung des Capgels

• Tab. 5: Chemische Zusammensetzung von SDS-PAGE Gelen

• Tab. 6: Expression von AAT 1-5 und ABC im Verlauf der Erkrankung

• Tab. 7: Beschreibung der menschlichen HD und Kontrollgewebe und Blutplasmaproben

• Tab. 8: Verteilung von AAT 1-5 und ABC im Gewebe und in Gehirnregionen. Verteilung im Gewebe (Oben). : Verteilung in den Gehirnregionen von weiblichen Mäusen (Unten)

• Tab. 9: Differentielle Proteinexpression in verschiedenen Geweben. Expression von AAT 1-5 in verschiedenen Geweben[a] (Oben). Expression von MUPs im Krankheitsverlauf (Unten).

• Tab. 10: Expression der beiden CTS Isoformen. 70 kDa Isoform in verschiedenen Geweben (Oben). 170 kDa Isoform im Herzen (Unten).

• Tab. 11: Zusammenstellung des Expressionsniveaus von Proteinen, welche HD-spezifisch verändert wurden nahe dem Endstadium der Erkrankung^[a]

• Tab. 12: Identifizierung von Proteinspots, welche sich in ihrer Expression zwischen zwei HD Patienten in Abhängigkeit von Geschlecht und Gehirnregion unterscheiden.

• Tab. 13: Untersuchung der HD-spezifischen Spotunterschiede beim vorderen Globus Cinguli bei post-mortem Gehirnen von vier weiblichen HD Patienten.

• Abb. 1: Neurotransmitterrezeptoren bei HD

• Abb. 2: Speziesübergreifende Ähnlichkeit der Spotmuster und Vergleich der Reproduzierbarkeit bei der Spezies Maus und Mensch

• Abb. 3: Großgel 2D Elektrophorese: Erste und zweite Dimension

• Abb. 4: AAT 1-5 Expression im Gehirn bei R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion.

• Abb. 5: Expression von AAT1-5 in der Membranfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.

• Abb. 6: Expression von AAT 1-5 in der Kernfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.

• Abb. 7: Expression von ABC im Gehirn von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung in der zytoplasmatischen/nukleoplasmatischen Fraktion.

• Abb. 8: ABC Expression in der Membranfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.

• Abb. 9: ABC Expression in der Kernfraktion nahe dem Endstadium der Erkrankung.

• Abb. 10: AAT Expression im Verlauf der Erkrankung.

• Abb. 11: ABC Expression im Verlauf der Erkrankung.

• Abb. 12: Expression von AAT in drei Regionen von Postmortem-Gehirnen beim Menschen.

• Abb. 13: Expression von AAT im vorderen Gyrus Cinguli bei Postmortem-Gehirnen.

• Abb. 14: Expression von AAT im Blut (Plasma) von einem HD Patienten während der Erkrankung

• Abb. 15: Verteilung der ABC Expression in verschiedenen Gehirnregionen

• Abb. 16: AAT und CTS Expression im Herzen nahe dem Endstadium der Erkrankung.

• Abb. 17: Expression der 170 kDa Isoform von CTS.

• Abb. 18: Unveränderte Expression von ABC im Herzen nahe dem Endstadium der Erkrankung.

• Abb. 19: Expression von AAT in Testes nahe dem Endstadium der Erkrankung

• Abb. 20: Expression von AAT und CTS in der Leber während des Endstadiums der Erkrankung.

• Abb. 21: MUPs Expression in der Leber nahe dem Endstadium der Erkrankung

• Abb. 22: Stark reduzierte MUPs Expression im Urin von R6/2 Mäusen nahe dem Endstadium der Erkrankung

• Abb. 23: Darstellung der drei Proteinfraktionen am Beispiel der Leber von C57Bl/6 Mäusen