1. Einleitung

1.1. T-Zellen

T-Zellen können durch T-Zell-Antigenrezeptor (T-cell receptor, TCR) in zwei unterschiedliche Gruppen eingeteilt werden. Eine exprimiert α:β- und die andere γ:δ-Rezeptoren. Beide Rezeptoren sind mit einem Satz von fünf Polypeptiden, dem CD3-Komplex, assoziiert, die den T-Zell-Rezeptorkomplex ausmachen (CD3-TCR-Komplex). Ungefähr 85-95% der T-Zellen besitzen α:β- Rezeptoren und bis zu 15% γ:δ-Rezeptoren. Die α:β-T-Zellen können weiter in zwei verschiedene, nicht überlappende Populationen unterteilt werden: Eine, die CD4 exprimiert und hauptsächlich Immunantworten erzeugen hilft, nennt man T-Helferzellen (Th). Eine andere Gruppe, die CD8 exprimiet und verantwortlich für die Zerstörung infizierter Zellen ist, nennt man zytotoxische T-Zellen (Tc). Die TCRs können Antigene erkennen, wenn sie in einem MHC (major histocompatibility complex)/Peptide-Komplex präsentiert werden. Es gibt zwei Hauptklassen von MHC-Molekülen, die man MHC-I und MHC-II bezeichnet. Die Tc-Zellen erkennen an MHC-I-Moleküle gebundene Antigene. Auf diese Weise können Virus-infizierte Zellen erkannt werden. Die Th-Zellen interagieren mit an MHC-II-Moleküle gebundenen Antigenen. Die α:β-T-Zellen tragen weder den CD4- noch den CD8-Marker und sind hauptsächlich nicht-MHC-beschränkt.

Es gibt viele verschiedene Th-Zellen, die jeweils zu den unterschiedlichen Krankheitserregern passen. Kommen die Th-Zellen mit dem Antigen in Kontakt, so wird ihre weitere Differenzierung stimuliert. Durch ihre Zytokinproduktion spielen Th-Zellen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Immunantwort bei Infektionskrankheiten, Allergien und Autoimmunerkrankungen. Anhand ihrer Zytokinmuster können Th-Zellen in verschiedene Subpopulationen unterteilt werden (Mosmann, et al.,1986, Mosmann, et al, 1989). Eine vereinfachte Einteilung in Th1- und Th2-Zellen hat sich als nützlich zum Verständnis physiologischer und pathologischer Immunantworten erwiesen. Diese beiden Untertypen wurden auch für humane Th-Zellen gefunden (Romagnani, 1991). Th1-Zellen produzieren überwiegend IL-2, IFN-γ und TNF-β. Die wichtigste Funktion von Th1-Zellen ist die zellvermittelte Immunantwort gegen intrazelluläre Pathogene wie Viren, Bakterien. Sie sind aber auch mit Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ (delayed-typ hypersensitivity reactions, DTH) und Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoide Arthritis, systemischer [Seite 7↓]Lupus erythematodes (SLE), Multiple Sklerose, Insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) usw. assoziiert. Auf der anderen Seite setzen Th2-Zellen vor allem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 frei und stimulieren B-Zellen zur Proliferation und zur Antikörperproduktion (IgE eingeschlossen). Die Hauptfunktion von Th2-Zellen ist die Immunabwehr gegen extrazelluläre Pathogene wie Parasiten. Sie sind mit allergischen Erkrankungen wie Asthma und Allergien assoziiert (Abbas, et al.,1996; Cher, et al., 1987; Infante Duarte, et al.,1999; Kuchroo, et al., 1995; Mosmann, et al., 1989; Sher, et al, 1992). Th1- und Th2-Zellen können in ihrer Entwicklung die klonale Expansion und Funktion gegenseitig inhibieren (Murphy, et al, 2002).

Es gibt noch funktionell unterschiedliche Populationen von Th-Zellen, die andere als die typischen Th1- oder Th2-Zytokinkombinationen exprimieren, diese werden als Th0 (Firestein, et al, 1989), Th3 (Chen, et al.,1994) oder Tr1 (Groux, et al., 1997) bezeichnet. Kurze Stimulation führt zur Entwicklung von Th0-Zellen, die sowohl Th1- als auch Th2-Zytokine freisetzen können. Es ist noch unklar, ob die Th-Zellen bei ihrer Differenzierung ein Zwischenstadium Th0 durchlaufen, ob es sich bei den Th0-Zellen um eine stabil differenzierte Population oder um verschiedene Subpopulationen handelt (Abbas, et al., 1996; Firestein, et al., 1989; Löhning, et al, 1999). Th3- und Tr1-Zellen wurden als regulatorische T-Zellen bezeichnet. Th3-Zellen schütten vor allem TGF-b aus und sollen die Differenzierung von Th1- und Th2-Zellen verhindern (Chen, et al, 1994). Tr1-Zellen, gekennzeichnet durch die Produktion von IL-10 und IL-5, haben immunsupprimierende Funktion (Groux, et al, 1997).

1.2. Aktivierung und Differenzierung naiver Th-Zellen

Für eine Aktivierung und Expansion von naiven Th-Zellen sind mehrere Signale, die die Th-Zellen durch die professionellen antigenpräsentierenden Zellen (antigen presenting cell, APC) erhalten müssen, notwendig. Th-Zellen haben an ihrer Oberfläche Rezeptoren, die ihnen das Erkennen verschiedener MHC/Peptid-Komplexe ermöglichen. Hat eine naive antigenspezifische Th-Zelle einen MHC/Peptid-Komplex erkannt, benötigt sie ein zweites, costimulatorisches Signal, das durch die Bindung des von derselben APC exprimierten B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86) Moleküls mit dem CD28-Molekül, das sich auf der Th-Zelle befindet, vermittelt wird (Abb.1). Zur vollständigen Aktivierung der CD4+ Th-Zelle ist B7 als wichtigstes Costimultionssignal essentiell. Korezeptoren der APC wie B7-1 und B7-2 stehen in Wechchelwirkung mit entsprechenden Rezeptoren der T-Zelle wie CD28 (Lenschow, et al., [Seite 8↓]1996). IL-2, das von der aktivierten CD4+ Th-Zelle sezerniert wird, wirkt als autokriner Wachstumsfaktor auf die Zelle selbst, beeinflusst aber auch B-Zellen und natürliche Killerzellen (NK).

Abb. 1: Aktivierung und Differenzierung naiver Th-Zellen

Nach der Aktivierung durch Antigenerkennung und kostimulatorische Signale, die von den antigenpräsentierenden Zellen vermittelt werden, kann eine Th-Zelle sich in eine Th1- oder Th2-Zelle differenzieren. Entscheidend dafür sind die Zytokine, die während der Aktivierung vorhanden sind sowie die Expression unterschiedlicher Transkriptionsfaktoren (z.B. T-bet für Th1 und GATA-3 für Th2).

Nach Aktivierung durch Antigenerkennung und costimulatorische Signale, die von den antigenpräsentierenden Zellen vermittelt werden, findet die Differenzierung dieser Zellen zu einer Th1- oder Th2-Zelle statt. Dieser Schritt beeinflußt das Ergebnis einer adaptiven Immunantwort stark. Welche Th-Antwort sich ausbildet, ist offensichtlich von mehren Faktoren abhängig. Im Detail ist es noch nicht bekannt, was letzlich die Differenzierung auslöst (Murphy und Reiner, 2002).

Die Zytokine, die während der Aktivierung vorhanden sind, spielen eine entscheidende Rolle bei der Th1- und Th2-Differenzierung. In vitro-Experimente haben gezeigt, dass IL-12, IFN-δ und im Menschen auch IFN-α, das in den frühen Phasen einer Immunreaktion gegen intrazelluläre Phatogene von aktivierten Makrophagen, dendritischen Zellen (dendritic cell, DC) und NK-Zellen ausgeschüttet wird, eine Differenzierung zu Th1-Zellen bewirkt (Hsieh, et al.,1993; Seder, et al., 1993; Macatonia, et al., 1995; Heufler, et al., 1996). Dagegen fördert [Seite 9↓]IL-4 die Produktion der Th2-Zellen. Es ist nicht ganz klar, woher das IL-4 in dieser frühen Phase einer Immunantwort stammt, noch bevor sich IL-4-freisetzende CD4-T-Zellen entwickelt haben. (Le Gros, et al., 1990 ; Seder, et al., 1992; Sher, et al, 1992 ; Swain, et al., 1990). Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass IL-12 durch Aktivierung des STAT4-Signaltransduktionswegs Th1-Differenzierung induziert (Akira, 1999 ; Jacobson, et al., 1995; Kaplan, et al., 1996; Rogge, et al., 1998), während IL-4 durch Aktivierung des STAT6-Signaltransduktionswegs zur Polarisierung der Th2-Zellen führt (Akira, 1999 ; Hou, et al., 1994).

Es ist auch denkbar, dass andere Zytokine in der Lage sein sollten, die Bedingungen der T-Zell-Aktivierung zu verändern und das Verhältnis zwischen den beiden Typen von CD4-T-Zellen zu beeinflussen. Das von APC freigesetzte IL-6 kann durch Induktion der IL-4-Produktion in CD4+-T-Zellen naive Th-Zellen zu Th2-Zellen differenzieren (Rincon, et al., 1997). TGF-β scheint die Vermehrung und die Effektorfunktionen von Th1-Zellen zu verhindern, während IL-10 ihre Reaktionen auf das Antigen blockiert. Entsprechend inhibiert IFN-γ offensichtlich Wachstum und Effektorfunktionen der Th2-Zellen ( Badaro, et al., 1990; Salgamme, et al., 1992).

In den letzten Jahren wurden einige Transkriptionsfaktoren wie T-bet, GATA-3 und c-Maf als kritische regulatorische Faktoren für Th1 und Th2-Differenzierung identifiziert. Th1-spezifischer Transkriptionsfaktor T-bet induziert IL-12Rβ2- und IFN-γ-Expression während Th1-Polarisierung und inhibiert Th2-Polarisierung (Mullen, et al., 2001; Szabo, et al., 2000; Afkarian, et al., 2002), während GATA-3 und c-Maf selektiv auf Th2-Zellen exprimiert wird und die Th2-Zytokinexpression reguliert. GATA-3 spielt eine wichtige Rolle für IL-4-, IL-5- und IL-13-Expression. C-Maf ist für IL-4-Expression notwendig, aber beeinflußt nicht die Expression von IL-5 und IL-13 (Ho, et al., 1996; Kim, et al., 1999; Zhang, et al., 1999; Zheng, et al., 1997).

Welche zusätzlichen Signale bei der Th1/Th2-Polarisierung noch entscheindend sein könnten, wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Dabei scheinen die Stärke der Peptid-MHC-Liganden und der APC-Typ eine große Rolle zu spielen. Peptide, die in hoher Dichte auf APC präsentiert werden, induzieren bevorzugt Th1-Antworten, während die Präsentation in geringer Dichte eine Th2-Antwort hervorruft (Murphy und Reiner, 2002). Weiterhin [Seite 10↓]aktivieren Antigene auf dendritischen Zellen CD4+-Zellen stärker als B-Zellen und Makrophagen (Croft, et al., 1992).

1.3. Identifizierung unterschiedlicher Th-Subpopulationen

Obwohl die Zytokinproduktion und Effektorfunktion der Th-Subpopulationen schon viel bekannt ist, weiß man noch relativ wenig über die Oberflächemoleküle, die unterschiedlich auf den Th1- oder Th2-Zellen stabil exprimiert werden und auf lebenden Zellen detektierbar sind. Als neue Zielmoleküle von immunmodulatorischen Therapiestrategien von Autoimmunerkrankungen könnten solche Oberflächenmoleküle benutzt werden, um unerwünschte Immunreaktionen zu kontrollieren. In den letzten Jahren wurden die Chemokinrezeptoren CCR5 und CXCR3 als humane Th1-, CCR3, CCR4, CXCR4 und CCR8 als Th2-spezifische Oberflächenmoleküle beschrieben (Loetscher, et al., 1998; Bonecchi, et al., 1998; Sallusto, et al., 1998). Bislang konnten diese Beobachtungen aber nicht bestätigt werden. CCR5 wird außer auf Th1-Zellen auch von CD4+- und CD8+-Makrophagen und Langerhans-Zellen exprimiert (Zaitseva, et al., 1998). CXCR3 wird haupsächlich von aktivierten T-Zellen exprimiert (Loetscher, et al., 1996). Das Molekül T1/ST2, das präferentiell auf Th2-Zellen exprimiert wird und für die Funktion dieser Zellen von Bedeutung ist, könnte ein Ansatzpunkt für eine immunmodulatorische Therapie sein (Coyle, et al., 1999; Löhning, et al., 1998; Löhning, et al., 1999; Xu, et al., 1998; Meisel, et al., 2001).

1.4. Rolle der Th-Zellen in der Pathogenese der Autoimmunerkrankungen und Allergien

Eine Autoimmunerkrankung beruht auf einer Immunreaktion gegen körpereigene Antigene. Man weiß nicht, wodurch eine Autoimmunreaktion ausgelöst wird. Autoimmunkrankheiten können durch Autoantikörper oder durch autoimmun wirkende T-Zellen verursacht werden. In den meisten Fällen spielen autoreaktive CD4+-T-Zellen eine kritische Rolle (Kamradt und Mitchison, 2001).

Die experimentell autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Mausmodell für die multiple Sklerose. Die Krankheit wird von Th1-Zellen hervorgerufen, die für Myelinantigene spezifisch sind. Eine Immunisierung mit MBP (myelin basic protein) allein kann zur Erkrankung führen. Klonierte MBP-spezifische Th1-Zellen können die Krankheit auf gesunde [Seite 11↓]Empfänger übertragen, sofern diese das geeignete MHC-Allel besitzen. Auch bei der multiplen Sklerose hat man gefunden, dass MBP-spezifische Th-Zellen an der Pathogenese beteiligt sind ( Martin, et al., 1992; Steinman, et al., 1996; Zamvil, et al., 1990). Bis heute ist noch nicht bewiesen, dass diese Zellen tatsächlich für die Demyelinisierung verantwortlich sind.

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die sich vor allem an der Gelenkinnenhaut (Synovia) manifestiert und zur Erosion, Fehlstellung und Destruktion führt. Bei der T-Zellinfiltration der Synovia handelt es sich vorwiegend um aktivierte CD4+ Th-Zellen (Cush, et al., 1988). Im Synoviagewebe und in der Synovialflüssigkeit von RA-Patienten wurden überwiegend Th1-Zytokine besonders IFN-γ gefunden (Dolhain, et al., 1996; Park, et al., 2001; Canete, et al., 2000).

Der insulinabhängige Diabetes mellitus (IDDM) ist eine chronische, durch autoreaktive Th-Zellen vermittelte Erkrankung, welche eine Inflammation und Zerstörung der Insulin-produzierenden b-Zellen des Pankreas zur Folge hat. Die autoreaktive Th-Zell-Antwort ist beim IDDM gegen die Antigene GAD (glutamic acid decarboxylase) gerichtet. Die Experimente am NOD-Mausmodell haben gezeigt, dass die T-Zellen aus NOD-Mäusen während der Antwort gegen dieses Protein eine große Menge von IFN-γproduzieren (Kaufmann, et al., 1993; Tisch, et al., 1993). Die Behandlungen mit anti-IFN-γ-Antikörper können die Entwicklung des Diabetes in den NOD-Mäusen verhindern (Campbell, et al., 1991; Debray-Sachs, et al., 1991). Die weiteren Untersuchungen im NOD-Mausmodell haben gezeigt, dass die insulinproduzierenden b-Zellen des Pankreas selektiv durch spezifische T-Zellen zerstört werden. Die infiltrierenden Lymphozyten weisen dabei eine anhaltende Th1-Zytokinproduktion auf (Delovitch, et al., 1997). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Th1-Zellen von großer Bedeutung für die Entwicklung des Diabetes in der NOD-Maus sowohl in der frühen als auch in der späten Phase ist.

Eine besonders schwer verlaufende Autoimmunerkrankung ist der systemische Lupus erythematodes (SLE), bei welchem Autoantikörper gegen Zellkernbestandteile und die Doppelstrang-DNA gebildet werden. Eine Th1/Th2-Zytokin-Inbalance mit überwiegenden Th1-Zellen in den peripheren Th-Zellen von SLE-Patienten mit der Lupus-Nephritis wurde beobachtet (Akahoshi, et al., 1999). Die MRL/lpr-Maus ist ein Modell für SLE und entwickelt spontan SLE-ähnliche Erkrankung. Die Untersuchungen im MRL/lpr-Modell haben gezeigt, [Seite 12↓]dass Th1-Zellen und das von Th1-Zellen freigesetzte IFN-γ von wichtiger Bedeutung für die Pathogenese der SLE-ähnliche Erkrankung im MRL/lpr-Mausstamm ist (Takahashi, et al., 1996; Balomenos, et al., 1998; Lawson, et al., 2000; Shiozawa, et al. 2004).

Während man bei Autoimmunerkrankungen also überwiegend eine Th1-Antwort findet, kann auch eine überschießende Th2-Reaktion bei Allergien z.B. Asthma beobachtet werden (Lukacs, et al., 2000; Mclntire, et al., 2001). Bei Patienten mit Asthma geht eine Prädominanz von Th2-Zellen mit Freisetzung von IL-4 und IL-5 einher, was die B-Lymphozyten zur Produktion von Immunglobulin-E anregt und in der Lunge zu der typischen eosinophilen Entzündung führt (Brutsche, Frey, 2002). Im Mausmodell wurde auch gefunden, dass die Aktivierung von Mastzellen und Th2-Antworten durch Antigen-Stimulierung hervorgerufen wird (Mclntire, et al., 2001).

Die Ursachen für Autoimmunerkrankungen sind trotz intensiver Forschung noch nicht bekannt. Die Untersuchungen der Th-Zell-Differenzierung bei Autoimmunerkrankungen dienen nicht nur dazu, die Pathogenese dieser Krankheiten zu verstehen, sondern möglicherweise auch einige neue Zielmoleküle für die immunmodulatorische Therapie zu identifizieren, um eine gestörte Th1/Th2-Zytokin-Balance wiederzuherstellen. Es erscheint jedoch möglich und ist in Modellsystemen auch bereits gelungen, die einzelnen CD4-T-Zellen durch Antigen oder Zytokine zu manipulieren, (Badaro, et al., 1990; Constant, et al., 1995; Hosken, et al., 1995: Pfeiffer, et al., 1991; Powrie, et al., 1993; Lawson, et al., 2000).

1.5. Das TIM3-Molekül

Nach der Aktivierung differenzieren CD4-T-Zellen zu Th1- oder Th2-Zellen, die sich durch ihre Funktion und Zytokinmuster, aber nicht einfach durch stabil exprimierte Oberflächlichenmarker unterscheiden lassen. Um Gene zu finden, die exklusiv in Th1- oder Th2-Zellen exprimiert werden, wurden OVA323-339-Peptid spezifische, differenzierte Th1- und Th2-Linien aus DO11.10 TCR-transgenen CD4+ Zellen generiert und verwendet, um eine PCR-gestützte „Differential Display Analyse” durchzuführen (Löhning et al., 1998). Eines der Gene, welches im Zuge dieser Analyse spezifisch in Th1-Zellen exprimiert wird, ist tim3. Um Th1-spezifische Oberflächenproteine zu identifizieren, hat eine andere Arbeitsgruppe die Ratten mit Th1-Zell-Klonen immunisiert, und zwei monoklonale Antikörper gegen ein Oberflächenprotein nur auf Th1-Zellen aber nicht auf Th2-Zellen generiert. Dieses Protein [Seite 13↓]wurde als TIM3 (T-cell immunoglobulin- and mucin-domain-containing molecule 3) identifiziert (Monney, et al., 2002; Sanchez-Fueyo, et al., 2003). Weitere genetische und genomische Analysen zeigten, dass dieses Gen zur TIM-Genfamilie gehört. Das wurde sowohl in der Maus als auch im Menschen gefunden. Da die Proteine dieser Genfamilie auf T-Zellen exprimiert werden, eine Immunoglobulin V-ähnliche Domäne und eine Mucin-ähnliche Domäne enthalten, wurden sie TIM genannt. Das erste TIM-Gen, TIM1, wurde ursprünglich als KIM1 (kidney injury molecule 1) und HAVCR (hepatitis A virus cellular receptor) identifiziert (Feigelstock, et al., 1998; Feigelstock, et al., 1998; Han, et al., 2002; Ichimura, et al., 1998; Kaplan, et al., 1996). Experimente an einem Mausmodell haben gezeigt, dass TIM1 die Expression von Th2-Zytokinen in der frühen Phase fördern könnte. Weiterhin wurde gezeigt, dass TIM1 mRNA in Th2-Zelllinien aber nicht in Th1-Zelllinien exprimiert wurde (Mclntire, et al., 2001). Aufgrund diesen Ergebnisse nimmt man an, dass TIM-Proteine von großer Bedeutung für die Th-Zell-Differenzierung, Th-Zell-Effektorfunktion und Autoimmunerkrankungen, Allergie und Asthma sind (Mclntire, et al., 2001; Monney, et al., 2002).

Bis heute weiß man noch nicht viel über die Funktion von TIM3. In vivo-Experimente in einem EAE-Mausmodell haben gezeigt, dass die Gabe von Antikörpern gegen TIM3 die Aktivierung und Expansion der Makrophagen erhöhte, die Erkrankung beschleunigte und verschlimmerte (Monney, et al., 2002; Sanchez-Fueyo, et al., 2003). Der Mechanismus, wie der TIM3-spezifische Antikörper in vivo die Aktivierung der Makrophagen und die Interaktion zwischen Zellen vermittelt, ist noch unklar. Eine wahrscheinliche Erklärung ist, dass die Interaktion zwischen TIM3 auf der Oberfläche der Th1-Zellen und seinem potentialen Liganden auf der Oberfläche der Makrophagen zur Aktivierung und klonalen Expansion der Makrophagen führt (Kuchroo, et al., 2003; Sanchez-Fueyo, et al., 2003). Bislang ist allerdings der natürliche Ligand für TIM3 (TIM3L) unbekannt. Um die Funktion von TIM3 und die Interaktion von TIM3-TIM3L weiter zu charakterisieren, wurde ein Fusionsprotein, TIM3-Immunoglobulin (TIM3-Ig) genutzt (Sabatos, et al., 2003; Sanchez-Fueyo, et al., 2003). Der erste Befund ist, dass ein putativer TIM3-Ligand auf CD4+-T-Zellen exprimiert wird. Der zweite wesentliche Befund betrifft die Interaktion von TIM3-TIM3L. Die Interaktion von TIM3-TIM3L kann Th1-Immunantwort runterregulieren und spielt eine wichtige Rolle für die Induktion der peripheren Toleranz. Diese Ergebnisse wurden nicht nur in den Mausmodellen, in denen eine Th1-Immunantwort und Toleranz durch PLP (myelin proteolipid protein)-Immunisierung induziert wurde (Sabatos, et al., 2003), sondern auch in [Seite 14↓]den Mausmodellen der Th1-mediierten auto- und alloimmunen Antwort wie NOD (nonobese diabetic) und Tranplantationstoleranz (Sanchez-Fueyo, et al., 2003) gefunden.

Bisherige Befunde im Mausmodell deuten darauf hin, dass die Bindung von TIM3-TIM3L ein hemmendes Signal für die Regulation der entzündlichen Immunantwot in vivo bietet. Die immunologische Funktion des humanen TIM3 Moleküls bleibt noch unbekannt.

1.6. Ziel der Arbeit

Ziel dieser Arbeit war es, das Gen vom humanen TIM3 mittels PCR zu amplifizieren, zu klonieren, die extrazelluläre Region in E.coli und komplett kodierende Region in eukaryontischen Zellen zu exprimieren und funktionell zu identifizieren. Das Weiteren sollte die Immunisierung von Mäusen mit dem rekombinanten hTIM3-Protein oder mit stabil transfizierten Zellen durchgeführt werden, um monoklonale Antikörper herzustellen.


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28.09.2004