2. Material

2.1. Bakterienstämme und Zelllinien

Es wurde der Bakterienstamm E.coli BL21 (DE3) (Novagen) eingesetzt. Dieser Stamm ist lysogen für den Bakteriophagen λ DE3 und enthält das Gen für die T7 Polymerase dieses Phagen. Genotyp: F- omp T hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)

E.coli BL21 (DE3)	Novagen
COS-7	DRFZ
CHO-K1	DRFZ
HEK 293	DRFZ
P3 X 63 Ag8.653	DRFZ, Myelomzelllinie aus der BALB/c Maus:
	ATCC: P3 X 63 Ag8.653

2.2. Mäuse und Gewebe von Menschen

BALB/c Mäuse	Versuchstierzucht des BgVV, Berlin
humanes Blut (Buffy-coats)	Blutbank, Charite Berlin

2.3. Oligonukleotide

Folgende Oligonukleotide wurden von der Firma TIB MOLBIOL synthetisiert.

Sequenzprimer:

2.4. Plasmide

Innerhalb dieser Arbeit wurde der Vektor pQE100S und pIRES2EGFP verwendet. Der Vektor pQE100S expremiert eine klonierte cDNA mit einem Histidinmarker von 6´ Histidinresten am N-Terminus und enthält einen lac Z-Promotor sowie eine Ampicillin-Resistenz. Der Vektor pIRES2EGFP enthält einen CMV-Promotor, die Sequenz IRES-GFP, die EGFP-Koexpression gewährleistet, und ein Neomycin-Resistenzgen, das die Selektion von stabil transfizierten Zellen mit Geniticinsulfat (G418) erlaubt (Abb.2).

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2.5. Antikörper

Polyklonaler Antikörper des Kaninchens gegen hTIM3

Anhand der Aminosäuresequenz wurden zwei Peptide (s. 2.9) von der Firma Eurogentec S.A. Belgium synthetisiert, an KLH gekoppelt und zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt.

Durchflusszytometrie

Ziege-anti-Kaninchen-IgG	Biosource, wurde an Cy5 gekoppelt und als sekundärer Antikörper eingesetzt.
Ziege-anti-Maus-IgG	Biosource, wurde an Cy5 gekoppelt und als sekundärer Antikörper eingesetzt

Western Blot

Maus-anti-6´His-IgG1	QIAGEN, 100ng/ml, erkennt einen penta-His- Tag, wurde als Primärantikörper eingesetzt (Verdünnung 1: 15000 in TBS-Puffer)
Schaf-anti-Maus-IgG-AP-Konjugat	Sigma,erkennt murine IgG, wurde als Sekundärantikörper eingesetzt (Verdünnung 1:15000 in TBS-Puffer)
Ziege-anti-Kaninchen-IgG-AP-Konjugat	Sigma, erkennt Kaninchen IgG, wurde als Sekundärantikörper eingesetzt (Verdünnung 1:2500 TBS-Puffer)

ELISA

Schaf-anti-Maus-IgG

-Peroxidase-Konjugat

Sigma, erkennt murine IgG, wurde als
Sekundärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1:5000 in PBT-Puffer)

Ziege-anti-Kaninchen-IgG

-Peroxidase-Konjugat

Sigma, erkennt Kaninchen IgG, wurde als
Sekundärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1:40000 in PBT-Puffer)

Kaninchen-anti-Ziege-IgG

-Peroxidase-Konjugat

Sigma, erkennt Ziege IgG, wurde als
Sekundärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1:5000 in PBT-Puffer)

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Abb. 2: Schematische Darstellung des Plasmidvektors pIRES2EGFP und pQE100S und Sequenz der multiplen Klonierungsstelle.

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2.6. Puffer

PCR-Puffer (Genexpress, Berlin)	10 x PCR-Puffer
Restriktionsverdau	10 x EcoR I-Puffer
(NewEnglandBiolabs)	10 x H-Puffer
	10 x NEB-Puffer 2
	10 x BSA

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
10x Laufpuffer	30g	Tris
	144g	Glycin
	10g	Natriumdodecylsulfat (SDS)
	1000ml	ddH²O
2x reduzierender Probenpuffer	0.77g	Dithiothreitol (DTT)
	10ml	10%SDS
	4ml	1M Tris
	5ml	Glycerin
	20mg	Bromphenolblau
	25ml	ddH₂O, pH 6,8

Färbungslösung	1,25g	Coomassie blue R 250
	250ml	Methanol
	50ml	Essigsäure
	200ml	ddH₂O

Entfärbungslösung	430ml	Methanol
	70ml	Essigsäure
	500ml	ddH₂O

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Western Blot
Blottingpuffer (10x)	19,3g	Tris
	90g	Glycin
	1000ml	ddH₂O, pH 8,1~8,4
Transferpuffer	100ml	10x Blottingpuffer
	200ml	Methanol
	700ml	ddH₂O
TBS-Puffer	50ml	0,2M Tris
	30ml	5M NaCl
	1000ml	ddH₂O, pH 7,5
TBS-Tween	TBS-Puffer
	0,05% (v/v) Tween 20
Blockpuffer	TBS-Puffer
	3% Rinderserumalbumin (BSA)
Inkubationspuffe	TBS-Tween
	1% BSA
Alkalische Phosphatase-Färbelösung	1 Tablette NBT-BCIP
	10ml ddH2O

Agarosegelelektrophorese
Laufpuffer (50x TAE)	242g	Tris
	57,1ml	96% Essigsäure
	100ml	0,5M EDTA
	1000ml	ddH₂O, pH 8
5x Probenpuffer	50ml	Glycerin
	1ml	1M Tris
	1g	Orange G
	100ml	ddH₂O, pH 7,5

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6x His-tagged hTIM3 Aufreinigung
Lysis Puffer	50mM	NaH2PO4
	300mM	NaCl
	20mM	Imidazol
	pH 8,0
Puffer A	100mM	NaH₂PO4
	10mM	Tris
	6M	GuHCl
	pH 8,0
Puffer B	100mM	NaH₂PO4
	10mM	Tris
	8M	Harnstoff
	pH 8,0
Puffer C	100mM	NaH₂PO4
	10mM	Tris
	8M	Harnstoff
	pH 6,3
Puffer D	100mM	NaH₂PO4
	10mM	Tris
	8M	Harnstoff
	pH 5,9
Puffer E	100mM	NaH₂PO4
	10mM	Tris
	8M	Harnstoff
	pH 4,5

Durchflusszytomerie
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	137mM	NaCl
(PBS)	2,7mM	KCl
	1,5mM	KH₂PO₄
	8,1mM	Na₂HPO₄
	pH 7,2
FACS-Puffer	PBS
(PBS/BSA/Azid)	0,5% (w/v) BSA
	0,5% Natriumazid (NaN3)

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ELISA
Bindungspuffer	PBS
Blockpuffer	PBS
	0,5% BSA
Inkubationspuffer	PBS
	0,5% BSA
	0,05% Tween-20
Waschpuffer	PBS
	0,05% Tween-20
3,3’,5,5’Tetramethylbenzidin-Puffer	25,7ml 0,2M Na₂HPO₄
(TMB-Puffer)	24,3ml 0,1M Zitronensäure
	50ml ddH₂O
	pH 5,0
Entwicklungslösung	1 TMB-Tablette
	10ml TMB-Puffer
	2µl 30%ige H₂O₂
Stopping Lösung	12,5% H₂SO₄

2.7. Medien

Zellkulturmedum:	RPMI-1640
	10% Fetales Kälberserum (FCS)
	50µM 2-Mercaptoethanol
	100U/ml Penicillin
	100µg/ml Streptomycin

Waschmedium	RPMI-1640
	5% Kulturmedium

Serumfreies Medium	RPMI-1640
	50µM 2-Mercaptoethanol
	100U/ml Penicillin
	100µg/ml Streptomycin

HAT-Medium	RPMI-1640
	20% Fetales Kälberserum (FCS)
	50µM 2-Mercaptoethanol
	HAT-Supplement (1x)
	50 U/ml rmIL-6
	100U/ml Penicillin
	100mg/ml Streptomycin

[Seite 23↓]

HT-Medium	RPMI-1640
	20% Fetales Kälberserum (FCS)
	50mM 2-Mercaptoethanol
	HAT-Supplement (1x)
	50 U/ml rmIL-6
	100U/ml Penicillin
	100mg/ml Streptomycin

SOC-Medium	2g	Trypton
	0,55g	Hefe-Extrakt (yeast extract-B)
	1ml	1M NaCl
	1ml	1M KCl
	1ml	2M MgCl
	1ml2M	glucose
	97ml	ddH₂O, pH 7,0

LB-Medium	10g/l	Trypton-B (trptone-B)
	5g/l	Hefe-Extrakt (yeast extract-B)
	10g/l	Natriumchlorid (NaCl)
	100µg/ml	Ampicillin

Agarplatten	LB-Medium
	15g/l Agar-Agar
	100mg/ml Ampicillin

2.8. Enzyme

Taq-Polymerase	peqlab
T4-DNA-Ligase	peqlab
Restriktionsendonukleasen	New England Biolabs
Reverse Transkriptase	Roche
PWO-DNA-Polymerase	peqlab

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2.9. Peptide

Zwei hTIM3 Peptide wurden von der Firma Eurogentec S.A. Belgium synthetisiert, an KLH gekoppelt und zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt.

Peptid I (EP012930): CKP AKV TPA PTL QRDF

Peptid II (EP012931): ELR DSR LAN DLR DSGA

2.10. Zytokine

Recombinant human GM-CSF	TEBU
Recombinant human TNFα	Strathmann
Recombinant human IL-4	Strathmann
Recombinant mouse IL-6 (rmIL-6)	R&D Systems

2.11. Reaktionskits

BigDyeTM Terminator Cycle
Sequencing Kit Ready Reaction	ABI PRISMR Applied Biosystems
BCA Protein Assay Reagent Kit	Pierce
Rneasy Mini Kit	Qiagen
QIAprep Spin Miniprep kit	Qiagen
Qiagen Plasmid Midi kit	Qiagen
EndoFree Plasmid Maxi kit	Qiagen
QIAquick PCR purification kit	Qiagen
QIAquick Gel extraction kit	Qiagen
TaqMan Reverse Transcription Reagents	Roche
TOPO TA Cloning	Invitrogen
Lipofectamine 2000	Invitrogen
Mouse monoclonal Antibody isotyping kit	Sigma
(antibody developed in goat)

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2.12. Chemikalien

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Acrylamid/Bisacrylamid	Biorad
Agar-Agar	Roth
Agarose	Gibco
Ammoniumpersulfat (APS)	Sigma
Ampicillin	Sigma
BCIP/NBT	Sigma
Brefeldin A	Sigma
Bromphenolblau	Sigma
Coomassie blue R 250	Fluka
Dithiothreitol (DTT)	Sigma
DNTPs	peqlab
EDTA	Roth
Essigsäure	Roth
Ethidiumbromid-Lösung (1%)	AppliChem
EtOH absolut	Merck
FCS	Sigma
FCS	Sigma
Ficoll-isopaque	Amersham Biosciences
Freund’s Adjuvans	Sigma
Glycerin	Roth
Glycin	Sigma
GuHCl	Roth
Harnstoff	Sigma
HAT-Supplement (50x)	Biochrom AG
HT- Supplement (50x)	Biochrom AG
Hefe-Extrakt	Sigma
30%ige H₂O₂	Sigma
Imidazol	Sigma
Ionomycin	Sigma
Isopropyl β-D-Thiogalaktopyranosid	Appligene
(IPTG)
KCl	Roth
KH2PO4	Merck
LB-Medium (Kapseln)	BIO 101,CA USA
2-Mercaptoethanol	Sigma
Methanol	Roth
MgCl2	Merck
Molekulargewichtsstandards	Roche
(Marker VI+VII)
N,N,N’,N’ Tetramethylendiamin(TEMED)	Sigma
Na₂HPO₄	Sigma
NaCl	Sigma
NaH₂PO₄	Roth
Natriumacetat	Sigma
Natriumazid (NaN₃)	Sigma
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Merck
Natriumhydroxid	Sigma
50% Ni-NTA-Superflow	Qiagen
OligodT’s	Roche
Orange G	Sigma
50% PEG (Polyethylene Glycol) 1500	Roche
Penicillin	Seromed
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)	Sigma
Polyethylenglycol 20000	Merck
Ponceaus S	Sigma
Protein standards	Bio-Rad
Random Hexamers	Roche
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma
RNnase Inhibitor	Roche
RPMI 1640	GibcoBRL/Invitrogen
Salzsäure	Sigma
Schwefelsäure	Sigma
Tablette NBT-BCIP	Sigma
3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine Dihydrochloride	Sigma
TNFα	Strathmann
Tris	Roth
Trypanblau Lösung (0,4%)	Sigma
Trypton	Sigma
Tween 20	Merck
Zitronensäure	Merck

2.13. Geräte

ABI PRISM 310 Genetic Analyzer	Applied Biosystems
Agarose-Gelelektrophoresekammer	PeQLab
Blottingkammer	Biorad
Brutschrank	Heraeus
Chromatographie Säule	Biorad
Drchflusscytometer FACScan	Becton Dickinson
ELISA-Lesegerät, Spectra Max 250	Molecular Devices
ELISA Waschgerät	Nunc Immuno Wash 12
French Press	Aminco
Heizblock TCR 100	Roth
PCR-Thermoblock, Gene Amp 2400	Perkin Elmer
Phasenkontrastmikroskop	Zeiss
pH-Meter, 766 Calimatic	Knick
Photometer, UV-1202	Shimadzu
Pipetten	Gilson
Pipettierhilfe	Integra Biosciences
Schüttelinkubator, TH 25	Edmund Bühler
SDS-PAG-Elektrophoresekammer	Biorad
Sterile Werkbank HeraSafe	Heraeus
Ultraschallgerät, Sonoplus HD70	Bandelin
Vortexer	Scientific Industries
Zentrifugen	Heraeus

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2.14. Kunststoffartikel und sonstige Verbrauchmaterialien

Acrylküvetten	Sarstedt
Blott-Papier 300x600mm	Schleicher-Schuell
Dialysenschläuche Visking Typ 20/32	Roth
ELISA-Platten	Costar
Kanülen, Spritzen	Braun, HSW
Kry-Tubes	Nunc
Nitrocellulosemembran Optitran 0,45μm	Scheicher-Schuell
Petrischalen,Pipetten,Zellkulturflaschen	Corning/Costar
Reaktionsgefäße	Eppendorf
RNase-freie Pipettenspitzen mit Filter	Fisher Scientific
(ART)
round bottom tubs (1,4ml)	Matrix
Zellsieb (70μm)	Falcon
Zentrifugenröhrchen, Cellstrainer	Falcon

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Shengtao Zhang: Klonierung, Expression und initiale Charakterisierung vom humanen TIM3
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