2. Material

2.1. Bakterienstämme und Zelllinien

Es wurde der Bakterienstamm E.coli BL21 (DE3) (Novagen) eingesetzt. Dieser Stamm ist lysogen für den Bakteriophagen λ DE3 und enthält das Gen für die T7 Polymerase dieses Phagen. Genotyp: F- omp T hsdSB(rB-mB-) gal dcm (DE3)

E.coli BL21 (DE3)

Novagen

COS-7

DRFZ

CHO-K1

DRFZ

HEK 293

DRFZ

P3 X 63 Ag8.653

DRFZ, Myelomzelllinie aus der BALB/c Maus:

 

ATCC: P3 X 63 Ag8.653

2.2. Mäuse und Gewebe von Menschen

BALB/c Mäuse

Versuchstierzucht des BgVV, Berlin

humanes Blut (Buffy-coats)

Blutbank, Charite Berlin

2.3. Oligonukleotide

Folgende Oligonukleotide wurden von der Firma TIB MOLBIOL synthetisiert.

Sequenzprimer:

2.4. Plasmide

Innerhalb dieser Arbeit wurde der Vektor pQE100S und pIRES2EGFP verwendet. Der Vektor pQE100S expremiert eine klonierte cDNA mit einem Histidinmarker von 6´ Histidinresten am N-Terminus und enthält einen lac Z-Promotor sowie eine Ampicillin-Resistenz. Der Vektor pIRES2EGFP enthält einen CMV-Promotor, die Sequenz IRES-GFP, die EGFP-Koexpression gewährleistet, und ein Neomycin-Resistenzgen, das die Selektion von stabil transfizierten Zellen mit Geniticinsulfat (G418) erlaubt (Abb.2).


[Seite 17↓]

2.5.  Antikörper

Polyklonaler Antikörper des Kaninchens gegen hTIM3

Anhand der Aminosäuresequenz wurden zwei Peptide (s. 2.9) von der Firma Eurogentec S.A. Belgium synthetisiert, an KLH gekoppelt und zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt.

Durchflusszytometrie

Ziege-anti-Kaninchen-IgG  

Biosource, wurde an Cy5 gekoppelt und als sekundärer Antikörper eingesetzt.

Ziege-anti-Maus-IgG

Biosource, wurde an Cy5 gekoppelt und als sekundärer Antikörper eingesetzt

Western Blot

Maus-anti-6´His-IgG1

QIAGEN, 100ng/ml, erkennt einen penta-His-
Tag, wurde als Primärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1: 15000 in TBS-Puffer)

Schaf-anti-Maus-IgG-AP-Konjugat

Sigma,erkennt murine IgG, wurde als
Sekundärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1:15000 in TBS-Puffer)

Ziege-anti-Kaninchen-IgG-AP-Konjugat

Sigma, erkennt Kaninchen IgG, wurde als
Sekundärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1:2500 TBS-Puffer)

ELISA

Schaf-anti-Maus-IgG

-Peroxidase-Konjugat

Sigma, erkennt murine IgG, wurde als
Sekundärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1:5000 in PBT-Puffer)

Ziege-anti-Kaninchen-IgG

-Peroxidase-Konjugat

Sigma, erkennt Kaninchen IgG, wurde als
Sekundärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1:40000 in PBT-Puffer)

Kaninchen-anti-Ziege-IgG

-Peroxidase-Konjugat

Sigma, erkennt Ziege IgG, wurde als
Sekundärantikörper eingesetzt
(Verdünnung 1:5000 in PBT-Puffer)


[Seite 18↓]

Abb. 2: Schematische Darstellung des Plasmidvektors pIRES2EGFP und pQE100S und Sequenz der multiplen Klonierungsstelle.


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2.6.  Puffer

PCR-Puffer (Genexpress, Berlin)

10 x PCR-Puffer

Restriktionsverdau

10 x EcoR I-Puffer

(NewEnglandBiolabs)

10 x H-Puffer

 

10 x NEB-Puffer 2

 

10 x BSA

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

  

10x Laufpuffer

30g

Tris

 

144g

Glycin

 

10g

Natriumdodecylsulfat (SDS)

 

1000ml

ddH2O

2x reduzierender Probenpuffer

0.77g

Dithiothreitol (DTT)

 

10ml

10%SDS

 

4ml

1M Tris

 

5ml

Glycerin

 

20mg

Bromphenolblau

 

25ml

ddH2O, pH 6,8

Färbungslösung

1,25g

Coomassie blue R 250

 

250ml

Methanol

 

50ml

Essigsäure

 

200ml

ddH2O

Entfärbungslösung

430ml

Methanol

 

70ml

Essigsäure

 

500ml

ddH2O


[Seite 20↓]

Western Blot

  

Blottingpuffer (10x)

19,3g

Tris

 

90g

Glycin

 

1000ml

ddH2O, pH 8,1~8,4

Transferpuffer

100ml

10x Blottingpuffer

200ml

Methanol

 

700ml

ddH2O

TBS-Puffer

50ml

0,2M Tris

 

30ml

5M NaCl

 

1000ml

ddH2O, pH 7,5

TBS-Tween

TBS-Puffer

 

0,05% (v/v) Tween 20

Blockpuffer

TBS-Puffer

 

3% Rinderserumalbumin (BSA)

Inkubationspuffe

TBS-Tween

 

1% BSA

Alkalische Phosphatase-Färbelösung

1 Tablette NBT-BCIP

 

10ml ddH2O

Agarosegelelektrophorese

  

Laufpuffer (50x TAE)

242g

Tris

 

57,1ml

96% Essigsäure

 

100ml

0,5M EDTA

 

1000ml

ddH2O, pH 8

5x Probenpuffer

50ml

Glycerin

 

1ml

1M Tris

 

1g

Orange G

 

100ml

ddH2O, pH 7,5


[Seite 21↓]

6x His-tagged hTIM3 Aufreinigung

  

Lysis Puffer

50mM

NaH2PO4

 

300mM

NaCl

 

20mM

Imidazol

 

pH 8,0

 

Puffer A

100mM

NaH2PO4

 

10mM

Tris

 

6M

GuHCl

 

pH 8,0

 

Puffer B

100mM

NaH2PO4

10mM

Tris

 

8M

Harnstoff

 

pH 8,0

 

Puffer C

100mM

NaH2PO4

 

10mM

Tris

 

8M

Harnstoff

 

pH 6,3

 

Puffer D

100mM

NaH2PO4

 

10mM

Tris

 

8M

Harnstoff

 

pH 5,9

 

Puffer E

100mM

NaH2PO4

 

10mM

Tris

 

8M

Harnstoff

 

pH 4,5

 

Durchflusszytomerie

  

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

137mM

NaCl

(PBS)

2,7mM

KCl

 

1,5mM

KH2PO4

 

8,1mM

Na2HPO4

 

pH 7,2

 

FACS-Puffer

PBS

(PBS/BSA/Azid)

0,5% (w/v) BSA

 

0,5% Natriumazid (NaN3)


[Seite 22↓]

ELISA

 

Bindungspuffer

PBS

Blockpuffer

PBS

 

0,5% BSA

Inkubationspuffer

PBS

 

0,5% BSA

 

0,05% Tween-20

Waschpuffer

PBS

0,05% Tween-20

3,3’,5,5’Tetramethylbenzidin-Puffer

25,7ml 0,2M Na2HPO4

(TMB-Puffer)

24,3ml 0,1M Zitronensäure

 

50ml ddH2O

 

pH 5,0

Entwicklungslösung

1 TMB-Tablette

 

10ml TMB-Puffer

 

2µl 30%ige H2O2

Stopping Lösung

12,5% H2SO4

2.7. Medien

Zellkulturmedum:

RPMI-1640

 

10% Fetales Kälberserum (FCS)

 

50µM 2-Mercaptoethanol

 

100U/ml Penicillin

 

100µg/ml Streptomycin

Waschmedium

RPMI-1640

 

5% Kulturmedium

Serumfreies Medium

RPMI-1640

 

50µM 2-Mercaptoethanol

 

100U/ml Penicillin

 

100µg/ml Streptomycin

HAT-Medium

RPMI-1640

 

20% Fetales Kälberserum (FCS)

 

50µM 2-Mercaptoethanol

 

HAT-Supplement (1x)

 

50 U/ml rmIL-6

 

100U/ml Penicillin

 

100mg/ml Streptomycin


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HT-Medium

RPMI-1640

 

20% Fetales Kälberserum (FCS)

 

50mM 2-Mercaptoethanol

 

HAT-Supplement (1x)

 

50 U/ml rmIL-6

 

100U/ml Penicillin

 

100mg/ml Streptomycin

SOC-Medium

2g

Trypton

 

0,55g

Hefe-Extrakt (yeast extract-B)

 

1ml

1M NaCl

 

1ml

1M KCl

 

1ml

2M MgCl

 

1ml2M

glucose

 

97ml

ddH2O, pH 7,0

LB-Medium

10g/l

Trypton-B (trptone-B)

 

5g/l

Hefe-Extrakt (yeast extract-B)

 

10g/l

Natriumchlorid (NaCl)

 

100µg/ml

Ampicillin

Agarplatten

LB-Medium

 

15g/l Agar-Agar

 

100mg/ml Ampicillin

2.8. Enzyme

Taq-Polymerase

peqlab

T4-DNA-Ligase

peqlab

Restriktionsendonukleasen

New England Biolabs

Reverse Transkriptase

Roche

PWO-DNA-Polymerase

peqlab


[Seite 24↓]

2.9.  Peptide

Zwei hTIM3 Peptide wurden von der Firma Eurogentec S.A. Belgium synthetisiert, an KLH gekoppelt und zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt.

Peptid I (EP012930): CKP AKV TPA PTL QRDF

Peptid II (EP012931): ELR DSR LAN DLR DSGA

2.10. Zytokine

Recombinant human GM-CSF

TEBU

Recombinant human TNFα

Strathmann

Recombinant human IL-4

Strathmann

Recombinant mouse IL-6 (rmIL-6)

R&D Systems

2.11. Reaktionskits

BigDyeTM Terminator Cycle

 

Sequencing Kit Ready Reaction

ABI PRISMR Applied Biosystems

BCA Protein Assay Reagent Kit

Pierce

Rneasy Mini Kit

Qiagen

QIAprep Spin Miniprep kit

Qiagen

Qiagen Plasmid Midi kit

Qiagen

EndoFree Plasmid Maxi kit

Qiagen

QIAquick PCR purification kit

Qiagen

QIAquick Gel extraction kit

Qiagen

TaqMan Reverse Transcription Reagents

Roche

TOPO TA Cloning

Invitrogen

Lipofectamine 2000

Invitrogen

Mouse monoclonal Antibody isotyping kit

Sigma

(antibody developed in goat)

 


[Seite 25↓]

2.12.  Chemikalien


[Seiten 26 - 27↓]

Acrylamid/Bisacrylamid

Biorad

Agar-Agar

Roth

Agarose

Gibco

Ammoniumpersulfat (APS)

Sigma

Ampicillin

Sigma

BCIP/NBT

Sigma

Brefeldin A

Sigma

Bromphenolblau

Sigma

Coomassie blue R 250

Fluka

Dithiothreitol (DTT)

Sigma

DNTPs

peqlab

EDTA

Roth

Essigsäure

Roth

Ethidiumbromid-Lösung (1%)

AppliChem

EtOH absolut

Merck

FCS

Sigma

FCS

Sigma

Ficoll-isopaque

Amersham Biosciences

Freund’s Adjuvans

Sigma

Glycerin

Roth

Glycin

Sigma

GuHCl

Roth

Harnstoff

Sigma

HAT-Supplement (50x)

Biochrom AG

HT- Supplement (50x)

Biochrom AG

Hefe-Extrakt

Sigma

30%ige H2O2

Sigma

Imidazol

Sigma

Ionomycin

Sigma

Isopropyl β-D-Thiogalaktopyranosid

Appligene

(IPTG)

 

KCl

Roth

KH2PO4

Merck

LB-Medium (Kapseln)

BIO 101,CA USA

2-Mercaptoethanol

Sigma

Methanol

Roth

MgCl2

Merck

Molekulargewichtsstandards

Roche

(Marker VI+VII)

 

N,N,N’,N’ Tetramethylendiamin(TEMED)

Sigma

Na2HPO4

Sigma

NaCl

Sigma

NaH2PO4

Roth

Natriumacetat

Sigma

Natriumazid (NaN3)

Sigma

Natriumdodecylsulfat (SDS)

Merck

Natriumhydroxid

Sigma

50% Ni-NTA-Superflow

Qiagen

OligodT’s

Roche

Orange G

Sigma

50% PEG (Polyethylene Glycol) 1500

Roche

Penicillin

Seromed

Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)

Sigma

Polyethylenglycol 20000

Merck

Ponceaus S

Sigma

Protein standards

Bio-Rad

Random Hexamers

Roche

Rinderserumalbumin (BSA)

Sigma

RNnase Inhibitor

Roche

RPMI 1640

GibcoBRL/Invitrogen

Salzsäure

Sigma

Schwefelsäure

Sigma

Tablette NBT-BCIP

Sigma

3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine Dihydrochloride

Sigma

TNFα

Strathmann

Tris

Roth

Trypanblau Lösung (0,4%)

Sigma

Trypton

Sigma

Tween 20

Merck

Zitronensäure

Merck

2.13. Geräte

ABI PRISM 310 Genetic Analyzer

Applied Biosystems

Agarose-Gelelektrophoresekammer

PeQLab

Blottingkammer

Biorad

Brutschrank

Heraeus

Chromatographie Säule

Biorad

Drchflusscytometer FACScan

Becton Dickinson

ELISA-Lesegerät, Spectra Max 250

Molecular Devices

ELISA Waschgerät

Nunc Immuno Wash 12

French Press

Aminco

Heizblock TCR 100

Roth

PCR-Thermoblock, Gene Amp 2400

Perkin Elmer

Phasenkontrastmikroskop

Zeiss

pH-Meter, 766 Calimatic

Knick

Photometer, UV-1202

Shimadzu

Pipetten

Gilson

Pipettierhilfe

Integra Biosciences

Schüttelinkubator, TH 25

Edmund Bühler

SDS-PAG-Elektrophoresekammer

Biorad

Sterile Werkbank HeraSafe

Heraeus

Ultraschallgerät, Sonoplus HD70

Bandelin

Vortexer

Scientific Industries

Zentrifugen

Heraeus


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2.14.  Kunststoffartikel und sonstige Verbrauchmaterialien

Acrylküvetten

Sarstedt

Blott-Papier 300x600mm

Schleicher-Schuell

Dialysenschläuche Visking Typ 20/32

Roth

ELISA-Platten

Costar

Kanülen, Spritzen

Braun, HSW

Kry-Tubes

Nunc

Nitrocellulosemembran Optitran 0,45μm

Scheicher-Schuell

Petrischalen,Pipetten,Zellkulturflaschen

Corning/Costar

Reaktionsgefäße

Eppendorf

RNase-freie Pipettenspitzen mit Filter

Fisher Scientific

(ART)

 

round bottom tubs (1,4ml)

Matrix

Zellsieb (70μm)

Falcon

Zentrifugenröhrchen, Cellstrainer

Falcon


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HTML-Version erstellt am:
28.09.2004