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3.  Methoden

3.1. Ex vivo Gewinnung von dendritischen Zellen

3.1.1. Isolierung von mononukleären Zellen (PBMC) aus humanem Vollblut

Die PBMC wurden aus Blutkonserven (buffy coats) isoliert. Die Isolierung erfolgte 8h nach Entnahme des peripheren Blutes gesunder Blutspender.

15ml Ficoll wurden in ein konisches 50ml Röhrchen gefüllt und mit 30ml einer mit PBS (1: 2) verdünnten Blutsuspension vorsichtig überschichtet. Die Phasentrennung erfolgte durch 20 min Zentrifugation bei 1000 g. Die Interphase zwischen Plasma und Ficoll wurde mit einer sterilen Pasteur-Pipette isoliert. Sie enthielt die PBMC, eine Mischung der mononukleären Blutzellen (Monocyten, B- und T-Lymphocyten, NK-Zellen). Um eine Verunreinigung durch Thrombocyten zu minimieren wurde die Fraktion durch Zentrifugation (200 g, 10 min) zweimal in PBS/EDTA (2mM) gewaschen und die Reinheit mikroskopisch kontrolliert.

Die isolierten PBMC wurden in RPMI 1640 Medium supplementiert mit 10% FCS und 100U/ml Penicillin/100µg/ml Streptomycin resuspendiert (2 x 106 Zellen/ml, Ausbeute: ca. 2-3x108Zellen).

3.1.2. Anreicherung der Monocyten über Adhärenz

Die Anreicherung von Monocyten aus PBMC erfolgte mittels Kunststoff-Adsorption der Monocyten an die Kulturflasche. Die über Ficoll-Gradient isolierten PBMC wurden in komplettem Medium auf 2x106 Zellen/ml eingestellt und 2 h in 225 cm2 Kulturflaschen bei 37 °C, 5% CO2 inkubiert. Anschließend wurden die nicht-adhärenten Zellen vorsichtig mit einer Pipette zusammen mit dem Medium abgenommen. Die zurückbleibenden adhärenten Zellen wurden mit vorgewärmtem PBS zweimal gewaschen und weiter in komplettem Medium über Nacht kultiviert.

3.1.3. Erzeugung von dendritischen Zellen aus Monocyten

Die über Nacht kultivierten Monocyten wurden in komplettem Medium mit GM-CSF (50ng/ml) und IL-4 (100ng/ml) 6 Tage und zusätzlich 2 Tage mit TNFa (50ng/ml) kultiviert. [Seite 30↓]Um die kultivierten dendritischen Zellen (dendritic cell, DC) zu charakterisieren, wurden sie durchfluß-zytometrisch phänotypisiert. Dabei wurden dendritischen Zellen als CD80-, CD86-, CD83-, HLA-DR-positiv und CD14-negativ definiert.

3.2. Isolierung der Gesamt-RNA aus dendritischen Zellen

Eine entscheidende Voraussetzung für den sensitiven Nachweis von Transkripten in der RT-PCR ist die Qualität der RNA sowie ein konsequentes RNasefreies Arbeiten. Ribonukleasen (RNasen) sind sehr stabile und aktive Enzyme. Sie sind schwierig zu inaktivieren, und bereits kleinste Mengen sind ausreichend, um RNA zu zerstören. Deshalb wurden bei allen Arbeiten Rnase-freie Handschuhe getragen und sterile Eimal-Kunststoff-Artikel (Pipetten, Reaktionsgefäße, etc.) verwendet. Um die gesamt-RNA von dendritischen Zellen zu isolieren, wurde das ‘RNeasy Mini Kit’ verwendet. Die Präparation der Gesamt-RNA beruht auf der Bindung und späteren Elution der Ribonukleinsäuren unter spezifischen Pufferbedingungen auf einer speziell entwickelten Säule.

3.3. cDNA Präparation

Für die cDNA Präparation wurde Gesamt-RNA eingesetzt und TaqMan Reverse Transcription Reagentien verwendet. Für einen 20µl Ansatz wurden folgende Komponenten in einem RNase-freien Reaktionsgefäß zusammengegeben:

Die RT-PCR wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:


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Bevor die fertige cDNA zur Amplifikation der hTIM3 cDNA eingesetzt wurde, wurde ihre Qualität durch eine ß-Actin PCR im Thermocycler überprüft (cDNA-check). Für eine 20µl Reaktion wurden in der Regel 0,5 µl der cDNA eingesetzt, und nach der PCR 10µl dieser Reaktion gelelektrophoretisch analysiert. Das PCR-Gemisch hatte folgende Zusammensetzung:

Die Reaktionsbedingungen wurden wie folgt gewählt:

3.4. Agarosegelelektrophorese

Zur Analyse oder Präparation von DNA-Fragmenten wurden diese in Agarosegelen im elektrischen Feld aufgetrennt. Die Auftrennung von linearen, doppelsträngigen DNA-Fragmenten in einem elektrischen Feld beruht auf der Tatsache, dass die elektrophoretische Beweglichkeit der DNA antiproportional zum Logarithmus der Anzahl der Basenpaare ist (Meyers, et al., 1976). Nach Zugabe von Ethidiumbromid, welches in GC-Paare der DNA interkaliert, können DNA-Fragmente unter UV-Licht aufgrund der Abgabe von Fluoreszenzlicht sichtbar gemacht werden.


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Der verwendete Agarosegehalt der Gele richtete sich nach der Größe der zu trennenden Fragmente und variierte zwischen 0,8-1,5 % (w/v). Die innerhalb dieser Arbeit verwendeten Agarosegele waren alle 1,2%. Es wurde 1,2g Agarose in 100ml 1 x TAE-Puffer bis zur Homogenität aufgekocht und nach dem Abkühlen auf 50-60 °C 5 µl Ethidiumbromid (10 µg/µl) zugegeben. Anschließend wurde das Gel in eine Gelkammer mit Gelkamm gegossen. DNA-Proben wurden im Verhältnis 5:1 mit Probenpuffer versetzt und zur Elektrophorese in die geformten Geltaschen gegeben. Als Standard zum Größenvergleich wurde Marker VI eingesetzt. Die angelegte Spannung während der Elektrophorese betrug je nach der Größe der Gelkammer bzw. des Gels 80-120V.

3.5. Klonierung der hTIM3 cDNA mit Topo TA Klonierungskit

Zur Ligation von PCR-Fragmenten in einen Vektor wurde die TA-Überhang-Methode verwendet. Diese Methode beruht auf der Tatsache, dass die Taq-DNA-Polymerase während der Elongation an die 3’-Termini der PCR-Produkte zusätzliche Adenosine anhängt. Dieses macht es möglich, dieses PCR-Produkt direkt in einen linearisierten klonenden Vektor mit einzelnem, Überhang 3’-T zu klonen. In dieser Arbeit wurde das TA-Cloning-Kit (Invitrogen) verwendet. Der Klonierungsprozeß erfolgte nach den Protokollangaben des Herstellers.

3.5.1. Amplifikation der hTIM3 cDNA

Mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) (Mullis, et al., 1987) wurde von der hergestellten cDNA ausgehend (s.3.3) die für hTIM3 kodierende cDNA amplifiziert. Folgender 50µl Reaktionsansatz wurde auf Eis in ein 200µl Reaktionsgefäß pipettiert:

Am PCR-Thermoblock wurde folgendes Programm verwendet:


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Nach der PCR wurden 10µl dieser Reaktion gelelektrophoretisch analysiert.

3.5.2. Topo Klonierungsreaktion

Nach der PCR wurde Klonierungsreaktion sofort fortgesetzt. Für einen 6µl Ansatz wurde das Reaktionsgemisch wie folgt zusammengesetzt:

Die Reaktion wurde vorsichtig gemischt und bei der Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert, und anschließend auf Eis gesetzt.

3.5.3. Transformation

Die Transformation erfolgt mit den chemisch kompetenten Bakterien E.coli (TOP10). 50µl Aliquots der chemisch kompetenten Bakterien wurden auf Eis aufgetaut. Zu den kompetenten Zellen wurden 2µl von der Reaktion vorsichtig pipettiert und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde ein Hitzeschock für 30 sec bei 42 °C durchgeführt. Nach dem Hitzeschock wurde der Ansatz sofort auf Eis überführt und für 2-5 min auf Eis inkubiert, mit 250µl Raumtemperatur SOC-Medium versetzt und für eine Stunde bei 37 °C geschüttelt (200 rpm).

125µl von der Suspension der transformierten Zellen wurden dann auf einem vorgewärmten Agarplatten mit 50µg/ml Ampicillin und 40mg/ml X-gal ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.


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3.5.4. Blau-Weiß Selektion

Durch die Transformation werden Plasmide in kompetente E. coli-Zellen übertragen. Da der verwendete Vektor pCR2.1-TOPO das Gen für β-Lactamase enthält, können nur solche Bakterien auf Ampicillin-Agarplatten anwachsen, die das Plasmid aufgenommen haben. Da das Reportergen für β-Galaktosidase (lacZ) die multiple Klonierungsstelle (MCS) enthält, kann mittels der sogenannten Blau-Weiß-Selektion auf X-Gal enthaltenen Agarplatten überprüft werden. Die Aufname eines intakten Plasmids führt zu einer Ampicillin-Resistenz der Zellen und zur Spaltung des farblosen Substrates X-Gal in das blaue Produkt. Der Einbau von Inserts in die MCS zerstört das Leseraster des LacZ Gens. Die mit dem Insert transformierten Bakterienkolonien bleiben in Anwesenheit von X-Gal farblos.

3.5.5. Analyse von positiven Kolonien

Um die positiv transformierten Bakterienzellen zu identifizieren, wurden 10 weisse Kolonien, die auf den Agarplatten gewachsen waren mit sterilen Spitzen gepickt und in 3ml LB-Medium mit Ampicillin über Nacht bei 37 °C auf dem Schüttler (200rpm) kultiviert. Anschließend erfolgt die Plasmidisolierung mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit gemäß den Protokollangaben des Herstelers. Die Methode basiert auf einer Lyse der Bakterien unter alkalischen Bedingungen (Birnboim, 1983).

Nach der Isolierung wurde die Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym EcoR I verdaut. Dazu wurden jeweils 20µl der isolierten Plasmid-DNA wie folgt eingesetzt:

Die Reaktion wurde bei 37 °C für 1,5 h durchgeführt, und anschließend gelelektrophoretisch analysiert.


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3.5.6.  Sequenzierung

Die Sequenzierung erfolgt nach der Didesoxy-Methode nach Sanger et al (1977). Es wurde zunächst eine PCR durchgeführt. Um die für hTIM3 kodierende cDNA komplett sequenzieren zu können, wurden 4 verschiedene Primer benötigt (s. 2.3, Sequenzprimer), die in 4 separaten PCR-Ansätzen eingesetzt wurden.

Es wurde folgender Ansatz zusammenpipettiert:

Am PCR-Thermoblock wurde folgendes Programm verwendet:

Nach der PCR wurden die Proben gefällt, um freie ddNTPs und dNTPs zu entfernen. Dazu wurden die zu sequenzierenden Proben (jeweils 10µl) in ein 500µl Gefäß überführt und nach Zugabe von 80 µl H2O ,10 µl 3M Natriumacetat (pH 4,6) und 250 µl reinem Ethanol gut gevortext und 20 min bei 10000g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Pipette abgenommen. Zum Waschen des Pellets wurden 350µl 70%iger Ethanol zugegeben und unter gleichen Bedingungen für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde bei 50 °C im Block für 10 min getrocknet und schließlich in 20µl ddH2O aufgenommen. Anschließend wurden die Proben in den Sequenzer gestellt.

3.6. Subklonierung in die Expressionsvektoren

3.6.1. Plasmid-PCR

Plasmid-PCR wurde zur Subklonierung und zur Gewinnung von Fragmenten, die zur Herstellung von Hybridisierungssonden verwendet wurden, durchgeführt.


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Zur Subklonierung der extrazellulären Region und komplett kodierenden Region der hTIM3-cDNA in den entsprechenden Expressionsvektor pQE100S und pIRES2EGFP wurden Restriktionsschnittstellen mit PCR in die cDNA-Sequenz so eingeführt, dass die cDNAs im Zielvektor im richtigen Leserahmen vorlagen. Die Primer, die zur PCR zur Gewinnung von cDNA-Fragmenten für Hybridisierungssonden verwendet wurden, sind in 2.3 aufgeführt.

Die PCR wurde so wie die Amplifikation der hTIM3-cDNA (s.3.5.1) durchgeführt. 5 µl von PCR-Produkte wurden dann gelelektrophoretisch analysiert.

3.6.2. Restriktionsverdau der hTIM3-cDNA und der Plasmidvektor pQE100S und pIRES2EGFP

Die 45 ml PCR-Produkte wurden dann mit dem QIAquick PCR purification kit aufgereinigt. Damit die hTIM3-cDNA in den entsprechenden Plasmidring eingefügt werden konnte, mußten die hTIM3-cDNA und Plasmidvektor pQE100S und pIRES2EGFP durch ensprechende Enzyme aufgeschnitten werden. Es wurden wie folgt angesetzt:

Beide Ansätze wurden bei 37 °C für 2 h inkubiert, und anschließend 1 ml Nsi I dazu pipettiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert.

Beide Ansätze wurden bei 37 °C über Nacht inkubiert.

Um den Erfolg des Restriktionsverdaus zu überprüfen, wurden die DNA über ein Agarosegel aufgetrennt und wie 3.6.3 beschrieben aus dem Gel extrahiert.


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3.6.3. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

Nach Auftrennung der DNA durch Gelelektrophorese in einem Agarose-Gel wurde das gewünschte Fragment mit Hilfe eines Skalpells ausgeschnitten und in ein Eppendorfgefäß überführt. Die weitere Aufarbeitung erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraction Kit.

3.6.4. Ligation der DNA-Fragmente

Die aufgereinigte cDNA und der Vektor wurden dann mittels DNA-Ligase verknüpft. Für eine gute Ausbeute an intakten Konstrukten sollte das Verhältnis von Vektor zu Insert ca. 1:3~5(mol/mol) betragen. Es wurden zwei Ansätze für zwei verschiedene Vektoren erstellt:

Beide Ansätze wurden bei RT für 30min inkubiert. Als Kontrolle wurden zwei Ansätze (positiv und negativ) mitgeführt, der statt cDNA unverdauter Vektor oder nur Wasser enthielt.

3.6.5. Transformation in TOP10 und BL21

Die Transformation wurde so ähnlich wie in 3.4.3 geschrieben durchgeführt. Für pIRES2EGFP-hTIM3 und pQE100S-hTIM3 wurden die unterschiedliche chemisch kompetente Bakterien E.coli TOP10 und BL21(DE3) genommen. Nach fünfminütiger Inkubation auf Eis wurde jeweils der gesamte Ligationsansatz von 10 µl zu den kompetenten Zellen pipettiert. Der Transformationsansatz wurde für weitere 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde ein Hitzeschock für 45 sec bei 42 °C durchgeführt. Nach dem [Seite 38↓]Hitzeschock wurde der Ansatz sofort auf Eis überführt und für 2-5 min auf Eis inkubiert, mit 200µl Raumtemperatur SOC-Medium versetzt und für eine Stunde bei 37 °C geschüttelt (200rpm).

200 µl von der transformierten Zellen wurden dann auf einem vorgewärmten Agarplatten mit 50 µg/ml Kanamycin (für pIRES2EGFP-hTIM3 ) oder 100 µg/ml Ampicillin (für pQE100S-hTIM3 ) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

3.6.6. PCR-Screening nach positiven Kolonien

Mit einer PCR mit den Insert-spezifischen Primern lässt sich die Transformation nachweisen. Kolonien wurden von den Kulturplatten isoliert und in 20 µl PCR Ansatz zugegeben. Die PCR wurde so wie in 3.6.1 (Plasmid PCR) beschrieben mit entsprechenden Primern durchgeführt.

3.6.7. Isolierung von Plasmid-DNA

Die Plasmidisolierung wurde ähnlich wie in 3.5.5 beschrieben durchgeführt. Die PCR-positiven Kolonien wurden weiter in 3 ml Medium mit Kanamycin oder Ampicillin über Nacht kultiviert. Nach der Isolierung wurde die Plasmid-DNA mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (s. 3.6.2) verdaut, gelelektrophoretisch analysiert und anschließend sequenziert (s. 2.3, Sequenzprimer und 3.5.6 Sequenzierung).

Die Gewinnung von Plasmid-DNA in größerem Maßstab erfolgte mit dem Qiagen Plasmid Midi kit bzw. EndoFree Plasmid Maxi kit.

3.7. Prokaryontische Expression der extrazellulären Region vom humanen TIM3

3.7.1. Kultivierung in BL21 (DE3)

Um eine Langzeitlagerung der mit dem Plasmid pQE100S-hTIM3 transformierten E.coli-Zellsuspension zu ermöglichen, wurden Glycerinkulturen hergestellt. Dazu wurden 750 µl der Zellsuspension mit 750 µl sterilem Glycerin/LB-Medium (3:2 v/v) in [Seite 39↓]Kryokonservierungsröhrchen gegeben, vermischt und kurz in flüssigen Stickstoff überführt, und dann bei –70 °C eingefroren.

Von diesen Glycerinkulturen ausgehend wurden Übernachtkulturen für die Proteinexpression hergestellt. Dazu wurde mit einer sterilen Impföse in die gefrorene Glycerinkultur gestochen und eine kleine Menge der Zellsuspension in LB-Medium/Amp überführt. Die Kultur wurde bei 37 °C auf einem Schüttler (200 rpm) inkubiert.

3.7.2. Optimierung der rekombinanten hTIM3-Proteinexpression

Sowohl für die Expression als auch für die anschließende Aufreinigung des exprimierten Proteins wurde nach Anleitung des Kits QiaExpressionist der Firma Qiagen verfahren. Um die Expression des hTIM3-His-Fusionsproteins zu optimieren, wurde eine 100 ml Kultur aus einer 2 ml Übernachtkultur in LB-Medium angeimpft, bei 37 °C auf einem Schüttler (200 rpm) kultiviert, bis sie eine OD600nm = 0,6 erreicht hatte und anschließend durch die Zugabe von verschiedenen IPTG-Konzentrationen (0,5 mM, 1 mM, 2 mM) induziert. Jede Stunde wurde eine Probe von 1 ml aus der Kultur entnohmen, zentrifugiert und zur 100 µl 2x reduzierenden Probenpuffer resuspendiert und bei –20 °C eingefroren bis SDS-PAGE-Analyse. Die Expression wurde im SDS-PAGE (s. 3.7.3) überprüft.

Um das rekombinante Protein in größerem Maßstab herzustellen, wurde eine Einzelkolonie des E.coli-Stammes BL21 (DE3), die das Plasmid pQE100S-hTIM3 trug, für eine Vorkultur in 25 ml LB-Medium/Amp bei 37 °C über Nacht angezogen. 1000 ml LB-Medium/Amp wurden mit 25 ml Vorkultur angeimpft und bei 37 °C und 200 rpm bis zu einer optischen Dichte von OD600nm=0,6 wachsen gelassen. Anschließend wurde die Expression mit 0,5 mM IPTG induziert und für 3 h bei 37 °C und 200 rpm inkubiert. Die Zellsuspension wurde bei 4 °C und 5000 rpm für 15 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde entweder gleich weiter verarbeitet oder bei –20 °C tiefgefroren.

3.7.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Durchführung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese erfolgte nach der Methode von Laemmli (1970). Die Polyacrylamid-Gele wurde wie folgt gegossen:


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15% Trenngel (20 ml)

5% Sammelgel (6 ml )

H2O

4,6

4,1

30% acrylamide mix

10

1,0

1,5 M Tris (pH 8,8)

5,0

---

1,0 M Tris (pH 6,8)

---

0,75

10% SDS

0,2

0,06

10% ammonium persulfate

0,2

0,06

TEMED

0,008

0,006

Die Proteinproben wurden im Verhältnis 1:10 mit 2x reduzierenden Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95 °C denaturiert und abgekühlt, anschließend aufgetragen.

Der Gellauf wurde im Elektrophoresepuffer bei 15 mA durchgeführt. Nachdem die Proben in das Trenngel eingewandert waren, wurde die Stromstärke auf 30 mA erhöht. Der Gellauf wurde gestoppt, nachdem der Farbmarker das Gel verlassen hatte. Die Färbung erfolgte mit Coomassie Brilliant Blue-Lösung.

Als Marker diente ein Low Molecular Weight Marker, der sich aus den Proteinen Phosphorylase B (97,4 kDa), Serumalbumin (66,2 kDa), Ovalbumin (45,0 kDa), Carboanhydrase (31,0 kDa), Trypsininhibitor (21,5 kDa) und Lysozym (14,4 kDa) zusammengesetzte.

3.7.4. Western Blot-Analyse der Expression

Für den Western Blot wurde eine Proteinfraktion über ein 15% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und über Nacht auf eine Nitrocellulosemembran mit Transferpuffer im Tankverfahren bei 30 Volt und 4 °C geblottet. Der erfolgreiche Transfer wurde mittels Ponceau S-Färbung kontrolliert und die Markerbanden markiert. Die Membran wurde für 1 h bei RT in TBS/ 3% BSA abgesättigt und anschließend mit dem ersten Antikörper (mouse anti-His-IgG1) 1 µg für 1 h bei RT in 10ml TBS/Tween/ 1% BSA inkubiert. Danach wurde 3x 10 min mit TBS/Tween gewaschen und eine weitere Stunde mit 1 mg anti-mouse-IgG-AP in 10ml TBS/Tween/ 1% BSA bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wie oben wurden die immunreaktiven Proteine mit BCIP/NBT in 10 ml H2O angefärbt.


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3.7.5.  Die Bestimmung der rekombinanten hTIM3-Protein-Löslichkeit

Vor Beginn der Reinigung ist es notwendig zu bestimmen, ob das rekombinante hTIM3-Protein löslich im Zytoplasma oder cytoplasmatisch in Einschlußkörperchen („inclusion bodies“) vorliegt. Das Zellpellet aus 100 ml Kultur 3 h nach der 0,5 mM IPTG-Induktion wurde auf Eis aufgetaut und in 10 ml Lysispuffer unter nicht denaturierenden Bedingungen resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen 3x mit French Press bei 4 °C bei einem Druck von 1000 bar aufgeschlossen. Nach 30minütiger Zentrifugation bei 10,000 ´ g und 4 °C wurde der Überstand (löslicher Proteinextrakt) in ein frisches Reaktionsgefäß überführt, und das Pellet (unlöslicher Proteinextrakt) in 10 ml Lysispuffer resuspendiert. Die anschließende SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse wurde so wie 3.7.3 und 3.7.4 beschrieben durchgeführt.

3.7.6. Affinitätsreinigung an Nickel-Agarose

Durch die Subklonierung der extrazellulären Region der humanen TIM3-cDNA in den pQE100S-Vektor trägt das rekombinante Protein eine 6xHis-Sequenz am N-Terminus. Die Affinität der 6xHis-Sequenz zu Ni2+-Ionen wurde zur Aufreinigung des exprimierten Proteins mittels der Metallchelat-Affinitätschromatographie an Ni-Agarose genutzt (Crowe, et al., 1994). Da das gesuchte Protein nach der Expression in Einschlußkörperchen vorlag, wurde in denaturierenden Medien gearbeitet. Das Zellpellet wurde auf Eis aufgetaut und in 5 ml Puffer A pro Gramm Pelletmasse resuspendiert. Die Proteine wurden durch 60 min Rühren bei RT gelöst, unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation für 30 min bei 10000 x g und RT entfernt. Vor dem Probenauftrag wurde die 5 ml umfassende Nickel-NTA-Säule mit Puffer A äquilibriert. Die Proteine wurden über einen UV-Durchflussdetektor bei einer Extinktion von 280 nm bestimmt. Die Proteinlösung wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min auf die Säule geladen. Nicht spezifisch gebundenes Protein wurde durch Waschen mit Puffer A, B, C entfernt, es wurde jedesmal so lange gewaschen, bis die Extinktion wieder den Anfangswert erreicht hatte. Die Elution der 6xHis markierten Proteine erfolgte durch Absenken des pH mit Puffer D und Puffer E. Während die Extinktion bei 280 nm anzusteigen begann und bis auf den Anfangswert abfiel (Proteinpeak), wurde das eluierte Protein aufgefangen und anschließend über Nacht gegen PBS dialysiert. Die Säule wurde durch Waschen mit 0,2%iger Essigsäure, 30% Glycerin, H2O und 20% Ethanol je 10 min regeneriert.


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Während der Aufreinigung wurden von den einzelnen Fraktionen Proben genommen, die zur Analyse von SDS-PAGE und Western Blot aufgetragen wurden (s. 3.7.3 und 3.7.4).

3.7.7. Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit dem BCA Protein Assay Kit, gemäß den Angaben des Herstellers. Die Absorption bei 562 nm wurde gemessen, als Standard wurde BSA in PBS eingesetzt.

3.8. Eukaryontische Expression von der komplett kodierenden Region

3.8.1. Transiente Transfektion

Die Transfektion erfolgte mit LipofectamineTM-Reagenz der Firma Invitrogen. Die Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion in 6-Well-Platten in einer Konzentration von 2-4 x 105 Zellen pro Well mit antibiotikafreien Medium ausgesät, so dass sie am nächsten Tag 50-70% konfluent waren. Für die Transfektion wurden folgende Reaktionsansätze vorbereitet:

Röhrchen 1: 4 µg DNA in 250 µl serumfreiem Medium

Röhrchen 2: 10 µl LipofectamineTM-Reagenz in 250 µl serumfreiem Medium

Nach der vorsichtigen Mischung wurde das Röhrchen 2 5 min bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurden DNA und LipofectamineTM vorsichtig gemischt und bei RT für 20 min inkubiert. In dieser Zeit wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, und nach Zugabe von 2 ml antibiotikafreien Medium weiter bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die DNA-LipofektamineTM-Ansätze tropfenweise auf die Zellen gegeben und weiter bei 37 °C für 24 h inkubiert, und danach im FACS analysiert.

3.8.2. FACS-Analyse der Transfektanten

FACS-Analyse der Transfektanten beruht auf dem Nachweis von der Expression des Markergens EGFP und hTIM3-Expression auf der Oberfläche. Hierzu wurden die Zellen 24 h nach der Transfektion zweimal mit PBS gewaschen, anschließend mit Trypsin/EDTA-Lösung [Seite 43↓]abgelöst, in ein 5 ml-FACS-Röhrchen überführt und 200 g 6 min bei 4 °C zentrifugiert. Nachdem das Pellet mit PBS/BSA/Azid gewaschen und erneut zentrifugiert wurde, wurde es in 200 ml PBS/BSA/Azid zur FACS-Analyse resuspendiert.

Um die hTIM3-Expression auf der Zelloberfläche zu identifizieren, wurde ein polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen zwei hTIM3-Peptide verwendet. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit dem Kaninchenserum im Verhältnis 1: 50 auf Eis für 15 min inkubiert und einmal mit PBS/BSA/Azid gewaschen. Anschließend wurde die Zellsuspension mit dem cy5-konjugierten sekundären Antikörper anti-Kaninchen-IgGs im Verhältnis 1:200 auf Eis für 15 min inkubiert, und nach einmaligem Waschen in 200 µl PBS/BSA/Azid zur FACS-Analyse resuspendiert. Als Negativkontrolle wurden die mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen verwendet (mock).

Die Auswertung der FACS-Daten wurde mit Hilfe der „Cellquest Research Software“ (Becton Dickinson) durchgeführt.

3.8.3. Western Blot-Analyse der Transfektanten

Mittels Western Blot wurde das hTIM3-Protein in transfizierten Zellen mit dem Kaninchen-Antiserum nachgewiesen. Dafür wurden die Kulturflaschen zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann mit Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst. Nach Zentrifugation wurde das Zellpellet in 2 x reduzierenden Probenpuffer aufgenommen (50 µl Zellen in 200 µl Puffer). Das Zelllysat wurde bei 13000 rpm für 15 min abzentrifugiert und der klare Überstand für SDS-PAGE weiterverwendet (s. 3.7.3). Die getrennte Proteine wurden weiter so wie 3.7.4 gearbeitet. Als Negativkontrolle wurden die mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen verwendet (mock). Das Kaninchen-Antiserum (1:2000) diente als erster Antikörper und Ziege-anti-Kaninchen-IgG-AP(1:25000) als sekundärer Antikörper.

3.8.4. Herstellung der stabilen Transfektion

Einen Tag nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen von 6-Well-Platten im Verhältnis 1:10 in Kulturflasche überführt, am nächsten Tag erfolgte die Selektion stabil transfizierter Klone. Dazu wurde dem Kulturmedium 1 mg/ml G-418 zugesetzt. Nach etwa einer Woche wurden die Zellen , die hoch EGFP exprimierten, durch FACS isoliert und mit Selektionsmedium (1 mg/ml G-418) in Kultur fortgesetzt. Nach 2-3 Sortierungen und 4-6 [Seite 44↓]Wochen Kultivierung mit Selektionsmedium wurden die Zellen, die in Experimenten eingesetzt werden sollten, in Kulturflaschen ohne G-418 vermehrt und geerntet. Die Passage erfolgte daraufhin alle 3 bis 4 Tage im Verhältnis 1:10.

3.9. Zellkultur und Zellzahlbestimmung

Bei der Zellkultur müssen verschiedene Vorsichtsmaßregeln beachtet werden. Alle Arbeiten müssen unter sterilen Bedingungen ausgeführt werden; sämtliche Geräte, Medien und Puffer, die mit Zellen in direkte Berührung kommen, wurden daher bei 180 °C hitzesterilisiert, autoklaviert oder sterilfiltriert. Die Handhabung der Zellen (Ausplattieren, Ernährung, Passagieren) erfolgte ausschließlich an einer sterilen Werkbank, die regelmäßig mit 70%igem Ethanol desinfiziert wurde.

Zur Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen 1: 10 mit Trypanblau gemischt. Lebende Zellen können den Farbstoff aktiv ausschließen, abgestorbene Zellen dagegen erscheinen blau. Auf diese Weise können tote Zellen bei der Zählung ausgeschlossen werden. Die Zellzahl wurde mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Zählkammer besteht aus 4 großen Quadraten, die in jeweils 16 kleinere Quadrate unterteilt sind. Unter dem Mikroskop wurden 2 große Quadrate ausgezählt, der Gesamtwert gemittelt und die Zahl der lebenden Zellen nach folgender Formel bestimmt: Zellzahl/ml = n x 10 x 104, wobei n die Anzahl der Zellen in einem großen Quadrat bildet und 10 den Verdünnungsfaktor darstellt.

Adhärent wachsende COS-7, HEK 293 und CHO Zellen wurden in RPMI 1640 mit 10% FCS, 50 µM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 5 % CO2 und 37 °C kultiviert und alle 3 bis 4 Tage nach Ablösen mit Trypsin/EDTA-Lösung im Verhältnis 1: 10 in neue Zellkulturflaschen überführt.

3.10. Einfrieren und Auftauen von Zellen

Die Zellen wurden aus den Kulturflaschen mit Trypsin/EDTA abgelöst und für 6 min bei 200 g bei RT zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in FCS mit 10% (v/v) DMSO ( 5 x 106 - 1 x 107 Zellen/ml ) aufgenommen und die Zellsuspension in Cryovials überführt. Die Zellen wurden zunächst auf –80 °C heruntergekühlt und nach 24-48 h in flüssigen Stickstoff überführt.

Um die Zelllinien zu rekultivieren, wurden die tiefgefrorene Zellen bei 37 °C schnell aufgetaut. Das vollständige Auftauen der Zellen ist hierbei zu vermeiden, um die toxische [Seite 45↓]Wirkung des Einfriermediums so gering wie möglich zu halten. Nach dem Auftauen muß das nun toxische DMSO schonend entfernt werden. Die Zellen wurden in 10 ml Kulturmedium aufgenommen, einmal abzentrifugiert und in einer Kulturflasche im entsprechenden Kulturmedium ausplattiert.

3.11. Durchflusscytometrie

Die Durchflusscytometrie ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Eine Hauptanwendung besteht darin, mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Proben bestimmte Eingensheepten von Zellen oder Zellpopulationen auf Einzelzellebene zu dokumentieren. Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern durchgeführt wird. Im Durchflusszytometer werden die Zellen einer Einzelzellsuspension wie auf einer Perlenkette einzeln aneinandergereiht durch einen Laserstrahl geführt und so zur Eigenfluoreszenz angeregt. Das resultierende Fluoreszenz- und Streulicht wird von verschiedenen Lichtdetektoren aufgefangen und nach Intensität und Farbe getrennt und vom Computer registriert. So wird für jede einzelne gemessene Zelle eine charakteristische Kombination von optischen Eigensheepten aufgezeichnet. Vom Computer können diese Eigensheepten dargestellt werden und erlauben so eine Auswertung mit Hilfe der „Cellquest Research Software“ (Becton Dickinson).

Jede der aufgezeichneten optischen Eigensheepten (Steu- und Fluoreszenzlicht) steht für eine bestimmte Charakteristik der gemessenen Zelle. Während der Messung werden die folgenden Parameter am FACScan eingestellt:

Parameter

Messgröße

Vorwärtsstreulicht

Größe der Zelle

Seitwärtssteulicht

Granularität, Struktur der Zelle

Anregungswellenlänge: 488nm

 

Fluoreszenz 1: 515-545 nm

FITC

Fluoreszenz 2: 563-607 nm

PE

Fluoreszenz 3: 620-660 nm

PE-Cy5, PerCP etc.


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3.12. Immunisierung der BALB/c Mäuse

Für die Immunisierung der BALB/c Mäuse wurde das rekombinante ausgefallene, in Zitronensäure aufgelöste hTIM3-Protein und die stabile transfizierte CHO-K1 Zellen verwendet.

Zur primären Immunisierung der Mäuse mit rekombinantem hTIM3-Protein wurde 300 mg Protein in 200 ml PBS (unlöslich) oder Zitronensäure (löslich) mit dem gleichen Volumen Freund’s komplettem Adjuvans (CFA) gemischt, mittels Ultraschall zur Emulsion hergestellt. Danach wurde den Mäusen je 100 ml der Emulsion subkutan auf jede Seite der Schwanzbasis injiziert (150 mg pro Maus). Das Boost wurde zweimal im Abstand von 3 Wochen mit Freund’s inkomplettem Adjuvans (IFA) so wie oben beschrieben durchgeführt. Zum finalen Boost wurde die gleiche Dose des Proteins ohne Adjuvans zwei Tage vor Fusion den Mäusen intraperitoneal injiziert.

Den BALB/c Mäusen wurden viermal im Abstand von 3 Wochen mit 2 ´ 107 Zellen, die in 500 ml PBS resuspendiert wurden, intraperitoneal injiziert. Das finale Boost erfolgte zwei Tage vor Fusion durch zwei anschließende intraperitoneale Injektionen in zwei Tagen.

3.13. Serumgewinnung und Bestimmung der spezifischen Immunantwort

Um eine spezifische Immunantwort gegen hTIM3 zu detektieren, wurden Blutproben von immunisierten Mäusen gewonnen. Die Mäuse wurden für kurze Zeit mit Rotlicht bestrahlt und anschließend wurde die Schwanzvene in der Nähe der Schwanzbasis vorsichtig angeritzt. Zwischen 3-5 Tropfen Blut wurden entnommen, 2 h bei RT zur Gerinnung stehengelassen und anschließend 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Das so gewonnene Serum wurde in 2,0 ml Reaktionsgefäße gefüllt und bei –20 °C gelagert.

Zur Bestimmung der spezifischen Immunantwort gegen hTIM3 wurden ELISA (s. 3.14) und FACS-Analyse mit den transfizierten Zellen so wie 3.8.2 beschrieben mit dem Kaninchen-Antiserum und den gewonnenen Mausseren durchgeführt.


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3.14.  ELISA

Zur Bestimmung des spezifischen Serumtiters gegen das in E.coli exprimierte hTIM3-Protein wurde ELISA durchgeführt. Dazu wurden zum einen die polyklonale Antikörper des Kaninchens und zum anderen die Seren der mit dem rekombinanten Protein immunisierten Mäuse verwendet.

96-Muldenplatten für ELISA wurden mit 50 µl Proteinlösung (1 µg/ml in PBS) auspipettiert und über Nacht bei 4 0C inkubiert, anschließend einmal mit Waschpuffer (PBS/0,05% Tween-20) gewaschen. Die Platten wurden mit 100 µl Blockpuffer (PBS/0,5%BSA) 1 h bei RT inkubiert und dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurden die Platten mit 100 µl Serum (verdünnt in PBS/BSA/Tween) in Verdünnungen 1:100 bis 1:409600 und die letzte Reihe mit PBS 1 h bei RT inkubiert, weiterhin wurden viermal mit Waschpuffer gewaschen. Der in PBS/BSA/Tween verdünnte, peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper anti-Kaninchen-IgG (1:40000) oder anti-Maus-IgG (1:5000) wurde 100 µl pro Well zugesetzt und 1h bei RT inkubiert, danach wurde sechsmal mit Waschpuffer gewaschen. 100 µl frisch hergestellte Substratlösung (1 TMB-Tablette in 10ml TMB-Puffer plus 2ml 30%ige H2O2) wurde dazugegeben und 5 bis 20 min bei RT inkubiert. Durch Zugabe von 50 µl 12,5%iger H2SO4 wurde die Reaktion abgestoppt, und erfolgte ein Farbumschlag von blau zu gelb. Die Extinktion wurde in einem ELISA-Meßgerät bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.

3.15. Kultivierung der Myelomzellen

7 Tage vor der Fusion wurden die Myelomzellen P3 X 63 Ag8.653 aufgetaut und im Zellkulturmedium kultiviert. Bei der Expansion wurden nur die suspendierten Zellen kultiviert, um die Adhärenz der Myelomzellen zu minimieren. Am Tag der Fusion sollen sich die Zellen in der log-Phase befinden. Die Zellen sollten eine Konzentration von 5 x 105 nie überschreiten. Für jede Fusion wurden ca. 2 x 108 Zellen vorbereitet.

3.16. Gewinnung von Feeder-Zellen aus dem Thymus

Am Tag der Fusion wurden Thymuszellen von drei naiven BALB/c Mäusen (jeweils gleiches Geschlecht wie die immunisierte Maus) als Feeder-Zellen präpariert. Dazu wurden die Mäuse durch cervikale Dislokation getötet. Der Thymus wurde entnommen, in ein Sieb überführt [Seite 48↓]und mit Hilfe eines Stempels zerrieben. Die Zellsuspension wurde bei 200 g 4 °C für 6 min zentrifugiert, die Zellen in HAT-Medium resuspendiert und gezählt.

3.17. Fusion

Zwei Tage nach der letzten Injektion wurden die Mäuse durch cervikale Dislokation getötet. Die Milz wie für den Thymus beschrieben unter sterilen Bedingungen präpariert (s. 3.16). Die gewonnenen Milzzellen wurden in serumfreiem Medium resuspendiert, gezählt, mit den in serumfreien Medium resuspendierten Myelomzellen im Verhältnis 3:1 gemischt und anschließend bei 200 g 4 °C für 6 min zentrifugiert. Die Zellen wurden einmal mit vorgewärmten serumfreien Medium gewaschen. Danach wurde der Überstand vollständig abgenommen und das Zellpellet durch vorsichtiges Klopfen gegen das Falconröhrchen resuspendiert.

Die PEG-Fusion wurde wie folgt durchgeführt:

Anschließend wurde die Zellsuspension für 6 min bei 500 g und RT zentrifugiert. Danach wurde der Überstand abgesaugt, das 50ml Falconröhrchen vorsichtig ohne das Zellpellet aufzulösen mit 50 ml serumfreien Medium (37 °C) aufgefüllt, das Pellet durch vorsichtiges Schwenken Zellschicht für Zellschicht resuspendiert und einmal gewaschen. Anschließend wurden die Zellen so wie im oberen Vorgang in HAT-Medium (37 °C) resuspendiert.

Die Fusionszellen und Feeder-Zellen wurden gemischt, auf ein Volumen von ca. 1000 ml gebracht, 200 ml / Mulde in ca. 50 96-Muldenplatten ausplatiert und bei 37 °C, 5% CO2 inkubiert.


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3.18.  Selektion

Zur Entfernung nicht gewünschter Fusionsprodukte (Myelom/Myelom) sowie nicht fusionierter Myelomzellen wurde eine Positivselektion durchgeführt. Da die Myelomzellen einen Enzymdefekt in der Hypoxantin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT) besitzen und den Aminopterin-Block des DNA-Hauptsyntheseweges durch den Einbau von supplimentiertem Hypoxantin und Thymidin nicht umgehen können, werden die im Selektionsmedium kultivierten unerwünschten Myelomzellen sterben. Überleben können nur die Hybridome, die eine intakte HGPRT durch Fusion mit einer Milzzelle erhalten haben.

3.19. Screening

Die ersten Kolonien tauchten nach 4-7 Tagen auf. Am Tag 9 wurden 150 µl Medium abgenommen und 200 µl HAT-Medium zugefügt. Hybridome wurden getestet, wenn die Kolonien mindestens 1/3 des Bodens der jeweiligen Mulde ausgefüllt hatten.

Die 200 µl Kulturüberstände (100 µl für Negativkontrolle und 100 µl für Antigen) wurden abgenommen und in ELISA oder FACS auf Antigenspezifität untersucht (s. 3.13). Dazu dienten das Antiserum des immunisierten Kaninchens als Positiv- und die mit PBS ohne Antigen beschichtete Mulden als Negativ-Kontrolle. Zum FACS-Spezifitätstest wurden die mit leeren Vektoren transfizierten HEK- oder CHO-Zellen als Negativkontrolle benutzt.

3.20. Subklonierung der Hybridome

Die positiven Klone wurden weiter in 48-Muldenplatten expandiert und mittels Grenzverdünnung subkloniert. Durch Grenzverdünnung wurden die Zellen auf eine Konzentration zwischen 10 Zellen/ml und 0,1 Zellen/ml gebracht und auf 96-Muldenplatten ausplatiert. Auf diese Weise erhält man nach zweimaliger Subklonierung mit hoher Wahrscheinlichkeit einen aus einer Zelle hervorgegangenen Zellklon, der einen monoklonalen Antikörper produziert (Coller und Coller, 1983). Die Antikörperproduktion der Klone wird mittels ELISA kontrolliert.


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3.21.  Kultivierung der Hybridome

Da die frisch fusionierten Hybridome sehr labil sind und besonders während der Selektion und Subklonierung unter unphysiologischen Bedingungen kultiviert werden, stellen sie besonders hohe Anforderungen an die Kulturbedingungen. Dazu gehören die Zugabe von 20% FCS und IL-6 und Einsatz von Thymuszellen zum Kulturmedium.

Die positiven Klone wurden stufenweise an „normale“ Kulturbedingungen adaptiert:

Adaption der Klone von einer 96-Muldenplatte mit HAT-Medium und Feeder-Zellen auf eine 48-Muldenplatte mit HT-Medium ohne Feeder-Zellen, erste Subklonierung auf 96-Muldenplatten ohne Feeder-Zellen.

Adaption der Klone von einer 96-Muldenplatte mit HT-Medium auf eine 48-Muldenplatte. Das komplette Medium wird verwendet, welches nur 10% FCS und 5 U/ml IL-6 enthält. Zweite Subklonierung auf 96-Muldenplatten.

Adaption der Klone an kleine Kulturflaschen ohne IL-6.

3.22. Antikörper-Isotypisierung

Zur Typisierung der Antikörper wurde ein Isotyp-Bestimmungskit eingesetzt. Dieser ermöglichte eine schnelle und sensitive Bestimmung der Isotyp muriner monoklonaler Antikörper (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA). Ein indirekter ELISA wurde so ähnlich wie 3.14 geschrieben durchgeführt. Die Kulturüberstände aus dem positiven Klon dienten als erster Antikörper, die Ziege-anti-Maus Antikörper (1:1000 in PBS/BSA/Tween verdünnt) als zweiter Antikörper. Als Nachweis-Antikörper wurden die Peroxidase-konjugierten Kaninchen-anti-Ziege Antikörper (1:5000 in PBS/BSA/Tween verdünnt) verwendet. Der Antikörper-Isotyp konnte dann nach der Messung am ELISA-Meßgerät bestimmt werden.


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28.09.2004