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4.  Ergebnisse

4.1. Generierung der DC

In einer in dieser Arbeitsgruppe angefertigten Dissertationsarbeit am Mausmodell (Bender, 2003) wurde gezeigt, dass TIM3 auf murinen dendritischen Zellen stark exprimiert wird. Wegen niedriger Zellzahl der dendritischen Zellen im peripheren Blut ist es schwierig, diesen Zellen direkt aus dem Blut zu isolieren. Die Differenzierung aus Monozyten mittels GM-CSF und IL-4 in vitro (Romani, et al., 1994; Zhou, et al. 1996) machte es möglich, dendritische Zellen zu generieren. Die so gewonnenen DC exprimierten HLA-DR, CD83 sowie auch die costimulatorischen Molekühle CD86 und CD80, aber kein CD14 (Abb.3 ).

Abb. 3: FACS-Alalyse der DC

Die über Ficoll-Gradient isolierten PBMC wurden in Vollmedium auf 2x106 Zellen/ml eingestellt und 2h in Kulturflaschen bei 37°C, 5% CO2 inkubiert und Monocyten wurden über Adhärenz angereichert. Die übernacht kultivierten Monocyten wurden mit GM-CSF und IL-4 6 Tage und zusätzlich 2 Tage mit TNFα kultiviert. Die generierten DC wurden durch FACS phänotypisiert. Dabei wurden DC als CD80-, CD86-, CD83-, HLA-DR-positiv und CD14-negativ definiert. blau: ungefärbte Zellen; grün: gefärbte Zellen.

4.2. Klonierung der hTIM3-cDNA in pCR2.1 Vektor

Zur Amplifizierung der hTIM3-cDNA wurden auch humane PBMC sowie HMC-1 (humane Mastzellllinie) (Daten nicht gezeigt) ausprobiert, doch nur aus den in vitro generierten DC konnte eine erfolgreiche Amplifikation für hTIM3-cDNA erreicht werden (Abb.4 ). Die [Seite 52↓]amplifizierte cDNA wurde wie in Kapitel 3.5 beschrieben in den Vektor pCR2.1 kloniert. Es wurden 10 Klone gepickt und auf den Einbau des korrekten Inserts untersucht. Der hier verwendete pCR2.1-Vektor bot in seiner multiplen Klonierungsstelle eine Auswahl an Schnittstellen verschiedener Restriktionsenzyme, die zum Ausschneiden des einklonierten Inserts verwendet werden konnten. Dazu wurden Plasmidpräparationen durchgeführt und anschließend mit EcoR I verdaut. In Abb.5 sind DNA Fragmente der erwarteten Größe von 1088bp (1070+18bp) bei den Klonen 7, 8, 9 und 10 zu sehen. Die Klone 1, 2, 3, 4, 5 und 6 zeigten keine Merkmale eines Restriktionsverdaus. Die Sequenzierung von zwei positiven Klonen wurde anschließend durchgeführt. Der Sequenzvergleich erfolgte auf der Internetseite http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Das Sequenzierungsergebnis war identisch mit AF450242.

Abb. 4: Amplifikation der hTIM3-spezifischen cDNA

Die Amplifikation erfolgte im 50 μl-Ansatz mit den hTIM3-spezifischen Primern ausgehend von 1,5μl cDNA. In Bahn 1-5 wurden jeweils 10 μl des PCR-Produkts pipettiert. Bahn 6-10 zeigen den β-Actin-Check der jeweiligen cDNA. An den äußeren Seiten des Gels war Marker VI aufgetragen.


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Abb. 5: Restriktionsverdau der Minipräparationen von pCR2.1-hTIM3

Die amplifizierte cDNA wurde in den Vektor pCr2.1 kloniert. Nach der Transformation wurde 10 Klone gepickt, Plasmid isoliert und mit EcoR I verdaut. Anden äußeren Seiten des Gels war Marker VI aufgetragen.

4.3. Struktur des hTIM3-codierenden Gens

Durch Vergleich mit einer genomischen Datenbank konnte die Struktur des hTIM3-codierenden Gens bestimmt werden (Abb.6). Es besteht aus 7 Exons und 6 Introns. Die hTIM3-transkribierende Region setzt sich aus den Exons 1-7 zusammen, und kodiert für Signalpeptid, IgV-Domäne, Mucin-Domäne, Transmembrane Region (TM) und Zytoplasmische Region.

Abb. 6: Struktur des hTIM3-codierenden Gen

Es besteht aus 7 Exons und 6 Introns. Die hTIM3-transkribierende Region setzt sich aus den Exons 1-7 zusammen, und kodiert für Signalpeptid, IgV-Domäne, Mucin Domäne, Transmembrane Region (TM) und Zytoplasmische Region. Die Zahlen in den Kästchen geben die Anzahl der Nucleotide für das jeweilige Exon an..


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4.4. Amino-säure Sequenz des hTIM3

Die abgeleitete Amino-säure Sequenz des hTIM3 wurde in Abb.7 gezeigt. Der Vergleich mit murinem TIM3 ergab, dass 63% Amino-säure Sequenz identisch zwischen hTIM3 und mTIM3, und 77% identisch im cytoplasmatischen Bereich (Monney, et al., 2002) sind. Aus dem offenen Leserahmen (ORF) von 903bp lässt sich für die extrazelluläre Domäne eine Größe von 19,8 kDa, für den komplett kodierende Bereich eine Größe von 30,9 kDa ausrechnen.

Abb. 7: Die abgeleitete Amino-säure Sequenz des hTIM3

Die unterschiedlichen Farben kennzeichnen die verschiedene Domänen: Signalpeptid (rot), IgV-Domäne (gelb), Mucin-Domäne (grün), transmembrane Region (blau) und zytoplasmatische Region (rosa).

4.5. Expression des hTIM3-Proteins in BL21

4.5.1. Subklonierung der hTIM3-cDNA in den Vektor pQE100S


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Zur Subklonierung der extrazellulären Region der hTIM3-cDNA in den Vektor pQE100S wurden zusätzliche Restriktionsschnittstellen an die Primersequenz angefügt. Um die Expressionseffizienz der zwei Produkte mit und ohne Signalsequenz zu vergleichen, wurden zwei verschiedene Primer für den N-terminalen Bereich generiert. Der Primer für den N-terminalen Bereich begann mit der Nde I-Schnittstelle, der erste gefolgt vom Startcodon ATG und 15 weiteren Basen, die den Anfang des Signalpeptides des hTIM3 repräsentieren, der zweite gefolgt von 18 Basen, die den Anfang der IgV-Region repräsentieren. Der C-terminale Primer enthielt Nsi I-Schnittstelle und 18 letzten Basen der Mucin-Domäne (s. Abb.7 und 2.3). Beide PCR-Produkte waren jeweils 612bp und 549bp.

PCR wurde so wie 3.5.1 beschrieben mit pCR2.1-hTIM3 durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen (Nde I und Nsi I) geschnitten und in den mit denselben Restriktionsschnittstellen ausgestatteten pQE100S-Vektor kloniert. Nach der Transformation der Ligationsansätze in den E.coli-Stamm BL21 wurden positive Klone mit PCR selektiert und anschließend sequenziert.

4.5.2. Optimierung der Expression

Um die Expression des rekombinanten Proteins zu optimieren, wurde jeweils eine Einzelkolonie mit Signalsequenz und ohne Signalsequenz über Nacht angesetzt und 2 ml dieser Vorkultur in 100 ml LB-Medium bis zu einer OD600nm = 0,6 wachsen gelassen. Die Induktion erfolgte mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen (0,5mM, 1mM, 2mM). Die SDS-PAGE-Analyse unter denaturierenden Bedingungen zeigte ein Molekulargewicht von ca. 23kDa vom exprimierten Fusionsprotein in pQE100S-hTIM3 ohne Signalsequenz an. Im Vergleich dazu ist eine theoretische Größe von ca. 19,8 kDa auszurechnen. Das Molekulargewicht vom rekombinanten Protein kann durch SDS-PAGE nur annähernd bestimmt werden. Da das Hinzufügen oder Ersetzen von Amino-säure die Proteinbanden verändern kann, ist das Molekulargewicht einige kDa höher als die erwartete Größe (Crowe, et al., 1995). Die Untersuchung der Experimente in Abhängigkeit von der Zeit ergab, dass nach 3 h das gesuchte Protein am höchsten exprimiert wurde, und keine große Unterschiede zwischen verschiedenen IPTG-Konzentrationen auftraten (Abb.8 a). Im Vergleich dazu zeigte die Proteinexpression in pQE100S-hTIM3 mit Signalsequenz ganz niedrig an (Abb.8 b), und war nur mit Western Blot nachweisbar (Daten nicht gezeigt).


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Abb. 8: Die Zeitabhängigkeit der extrazellulären Genexpression der hTIM3

Das extrazelluläre Gen mit Signalsequenz oder ohne Signalsequenz war durch PCR amplifiziert, in den pQE100S-Vektor kloniert und in den E.coli-Stamm BL21 transformiert. Expression wurde mit IPTG induziert. Die Proben von verschiedenen Zeitpunkten wurden auf 15% SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und mit Coomassie Brilliant Blue-Lösung gefärbt. (a) Die extrazelluläre Genexpression ohne Signalsequenz. (b) Die extrazelluläre Genexpression mit Signalsequenz. Ein Low Molecular Weight Marker wurde benutzt.

4.5.3. Western Blot-Analyse der Expression

Zur Kontrolle, ob das gesuchte Protein unter den oben angegebenen Bedingungen exprimiert wurde, wurde eine Western Blot-Analyse durchgeführt. Dazu wurde die Proteinfraktion nach der Expression über SDS-PAGE aufgrtrennt. Als spezifischer gegen die N-terminale Histidinsequenz gerichteter Antikörper diente mouse anti-His-IgG1. Die Proteinfraktion vor der IPTG-Induktion diente als Negativkontrolle. In Abb.9 sieht man die positive Bände nach der Induktion (Pfeil). Bei der Negativkontrolle, die Proteinfraktion vor der Induktion, konnten keine Signale detektiert werden.


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Abb. 9: Western Blot-Analyse der Expression

Die Proteinfraktion wurde über SDS-PAGE aufgrtrennt und mit dem mouse anti-His-IgG1, spezifischer Antikörper gegen Fusionsprotein, inkubiert. 0h: vor der Induktion; 3h: 3 h nach der Induktion; lös.: löslicher Proteinextrakt nach dem Zellaufschluß unter nicht denaturierenden Bedingungen; unlös.: unlöslicher Proteinextrakt nach dem Zellaufschluß unter nicht denaturierenden Bedingungen. Ein Low Molecular Weight Marker wurde benutzt.

4.5.4. Aufreinigung des rekombinanten Proteins

Da das rekombinante Protein eine 6´His-Sequenz am N-Terminus trägt, wurde die Affinität der 6xHis-Sequenz zu Ni2+-Ionen zur Aufreinigung des exprimierten Proteins an Ni-Agarose genutzt. Es bestehen zwei Möglichkeiten ein Protein auf diese Weise zu reinigen: Falls das zu reinigende Protein sich nach dem Zellaufschluss in der löslichen Phase befindet, ist das Protein unter nicht denaturierenden Bedingungen zu reinigen. Sollte das Protein membrangebunden oder in Einschlußkörperchen vorliegen, kann man unter denaturierenden Bedingungen arbeiten.

Zur Bestimmung der rekombinanten hTIM3-Proteinlöslichkeit wurde das Zellpellet nach der Induktion unter nicht denaturierenden Bedingungen aufgeschlossen. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand (löslicher Proteinextrakt) und das Pellet (unlöslicher Proteinextrakt) über SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend durch Western Blot analysiert. Wie aus Abb.9 ersichtlich, befand sich das Fusionsprotein im unlöslichen Proteinextrakt. Im löslichen Proteinextrakt konnte kein Fusionsprotein detektiert werden.

Da das gesuchte Protein in Einschlußkörperchen nach der Expression vorlag, wurde in denaturierenden Medien gearbeitet. Die über Nacht nach der Expression tiefgefrorenen Zellen wurden auf Eis aufgetaut, in Puffer A (enthält GuHCl) aufgenommen und nach dem Auflösen die nicht löslichen Bestandteile abzentrifugiert. Nach Einfüllen in Nickel-NTA-Säule wurden durch Zugabe von Waschpuffer A, B und C zuerst unspezifisch gebundene Fremdproteine entfernt und später das gesuchte Protein von Puffer D und E eluiert. Anschließend wurde das [Seite 58↓]eluierte Protein über Nacht gegen PBS dialysiert. Nach der Dialysierung wurde das Protein ausgefällt und die Hälfte in 0,5 M Zitronensäure gelöst und sofort bei -20°C tiefgefroren.

Während der Aufreinigung wurden von den einzelnen Reinigungsschritten Proben genommen und auf einem 15%igem SDS-Acrylamidgel analysiert (Abb.10). Als Kontrolle wurden die Proben vor und nach der Expression (Abb.10 0h, 3h) aufgetragen. Der klare Überstand nach dem Zellaufschluß und der nicht an Nickel-Agarose gebundene Durchlauf sind in die Spuren lysate und flow aufgetrennt. Spur A, B, C zeigen Waschschritte mit Puffer A, B, C. Spur D, E zeigen die Proteine, die von der Säule eluiert wurden. In Spur E ist eine dicke Proteinband mit der zu erwartenden Größe von ca. 23 kDa zu sehen. Um die aufgereinigten Proteine als 6´His markierte Fusionsproteine darzustellen, wurde ein parallel aufgetragenes SDS-Acrylamidgel weiterhin im Western Blot analysiert (Daten nicht gezeigt). Die Ausbeute betrug 18,7 mg pro 1000 ml Kulturmedium.

Abb. 10: SDS-PAGE Analyse von den einzelnen Reinigungsschritten des rekombinanten hTIM3-Proteins

0h : vor der Induktion; 3h: 3 h nach der Induktion; lysate: klarer Überstand; flow: Durchlauf; A,B,C: Waschschritt mit Puffer A, B, C; D,E: Eluat D,E. Ein Low Molecular Weight Marker wurde benutzt.

4.6. Expression des hTIM3-Proteins in eukaryontischen Zellen

4.6.1. Untersuchung der transfizierten Zellen durch EGFP-Koexpression

Zunächst wurden COS-7 Zellen mit dem Plasmid pIRES2EGFP, dem hTIM3 tragenden Plasmid pIRES2EGFP-hTIM3 transfiziert. Um die hTIM3-Genexpression zu vergleichen, [Seite 59↓]wurde hTIM3-cDNA mit 5’NTR (5’ nontranslated region) mit einer Länge von 87bp in den Vektor pIRES2EGFP subkloniert und parallel die Zellen transfiziert. Die Transfektionseffizienz wurde durch Detektion von EGFP mittels FACS-Analyse abgeschätzt. Die FACS-Analyse zeigte die einheitliche EGFP-Expression von verschiedenen Plasmiden. Abb. 11 zeigt die EGFP-Fluoreszenzintensität der transfizierten COS-7 Zellen 24 h nach der Transfektion mit pIRES2EGFP-hTIM3. Anhand der FACS-Analyse wurden die Transfektionsraten mit der Software CELLQuest quantifiziert. Die Resultate einer dieser Transfektionen, bei der die Zellen in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Es zeigt sich, dass eine Zellkonzentration von 3 x 105 Zellen pro Well in Bezug auf Transfektionsrate mit verschiedenen Plasmiden am günstigsten war und auch kein offensichtlicher Unterschied zwischen Plasmiden pIRES2EGFP-hTIM3 und pIRES2EGFP-hTIM3-5’NTR beobachtet wurde.

Abb. 11: FACS-Analyse der transfizierten Zellen durch EGFP-Koexpression

COS-7 Zellen wurden mit dem Plasmid pIRES2EGFP-hTIM3 transfiziert und 24 h nach der Transfektion analysiert. blau: untransfizierte Zellen; grün: transfizierte Zellen.

Tabelle 1: Transfektionsraten (%) mit verschiedenen Plasmiden in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl

Zellzahl

pIRES2EGFP

pIRES2EGFP-hTIM3

pIRES2EGFP-hTIM3-5’NTR

2x105

62,33

66,28

69,31

3x105

64,60

70,66

70,96

4x105

62,04

67,41

63,91


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Anschließend wurden verschiedene Zelltypen (COS-7, CHO-K1 und HEK 293) auf ihre Eignung als exprimierende Zelllinie untersucht. In transient transfizierten COS-7, CHO-K1 und HEK 293 Zellen mit dem Plasmid pIRES2EGFP-hTIM3 wurden die Transfektionsraten durch EGFP-Koexpression festgestellt. Im Vergleich zu CHO-K1 und HEK 293 Zellen wiesen COS-7 Zellen eine relativ höhere Transfektionsrate auf (Abb.12 ), danach konnten stabile Klone nicht erzeugt werden.

Abb. 12: Vergleich der Transfektionsrate von verschiedenen Zelltypen

COS-7, CHO-K1 und HEK 293 Zellen wurden mit dem Plasmid pIRES2EGFP-hTIM3 transfiziert, 24 h nach der Transfektion analysiert und die Transfektionsraten durch EGFP-Koexpression festgestellt.

4.6.2. Untersuchung der transfizierten Zellen mit polyklonalen Antikörper des immunisierten Kaninchens

Um hTIM3-Expression in transfizierten Zellen nachzuweisen, wurden Oberflächenfärbung und Western Blot durchgeführt. Zur Antikörpergewinnung wurden zwei Peptide (s. 2.9) aus der extrazellulären Domäne des humanen TIM3 synthetisiert, an KLH gekoppelt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Zur FACS-Analyse wurden die Zellen zunächst mit polyklonalen Antikörpern des immunisierten Kaninchens in einer Verdünnung von 1: 50 inkubiert und nach dem Waschen mit dem Cy5-konjugierten sekundären Antikörper anti-Kaninchen-IgG gefärbt. Als Negativkontrolle wurden die mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen verwendet (mock). Wie aus Abb. 13 ersichtlich, exprimierten die mitpIRES2EGFP-hTIM3transfiziertenCOS-7 Zellen(COS-7 hTIM3) hTIM3-Protein auf der Zelloberfläche. Die mit pIRES2EGFPtransfizierten Zellen(COS-7 mock) wiesen keine hTIM3-Expression auf.DieHöhe der hTIM3-Expression war mit der EGFP-Expression korreliert. Dies zeigt, dass die transfizierten Zellen in der Lage sind, ein funktionelles hTIM3-Protein zu [Seite 61↓]exprimieren. Das gleiche Ergebnis wurde auch in anderen Zelltypen (CHO-K1, HEK 293) nachgewiesen.

Abb. 13: hTIM3 –Expression auf der Zelloberfläche der Transfektanten

COS-7 Zellen wurden mit leeren Vektoren (COS-7 mock) und hTIM3 tragenden Vektoren (COS-7 hTIM3) transfiziert, mit polyklonalen Antikörper des immunisierten Kaninchens gegen hTIM3 inkubiert und anschließend mit anti-Kaninchen-IgG-Cy5 gefärbt.

Die Transfektanten wurden weiter mit polyklonalen Antikörper des Kaninchens mittels Western Blot getestet. Das Zelllysat wurde über SDS-PAGE aufgetrennt. Als spezifisch gegen hTIM3 gerichtete Antikörper diente polyklonale Antikörper des Kaninchens. Als Negativkontrolle wurden auch die mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen verwendet. Das Ergebnis des Western Blots ergab, dass ein ca. 40 kDa großes Protein (Pfeil) von den mit hTIM3-Gen tragenden Vektoren transfizierten Zellen mit polyklonalen Antikörper des immunisierten Kaninchens reagierte und größer als theoretisch ausgerechnete Größe von ca. 30,9 kDa war (Abb. 14). Dies ist sehr wahrscheinlich auf eine Glycosylierung des Expressionsproteins zurückzuführen.


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Abb. 14: Western Blot-Analyse der Transfektanten

COS-7 Zellen wurden mit leeren Vektoren (mock) und hTIM3-Gen tragenden Vektoren (hTIM3) transfiziert. Das Zelllysat wurde über SDS-PAGE aufgetrennt. Eine ca. 40 kDa großes Protein von den mit hTIM3-Gen tragenden Vektoren transfizierten Zellen reagierte mit polyklonalen Antikörpern des Kaninchens gegen hTIM3.

4.6.3. Stabile Transfektion

Um langfristige und reproduzierbare Untersuchungen durchführen zu können, wurde eine stabile Transfektion der CHO- und HEK 293-Zellen vorgenommen. Die transfizierten Zellen wurden mit Selektionsmedium (1 mg/ml G418) kultiviert. Da die Höhe der hTIM3-Expression mit EGFP-Expression korreliert ist, wurde die FACS-Sortierung auf EGFP-Koexpression durchgeführt. Nach 2-3mal Sortierungen blieben die Zellen über 90% EGFP-positiv (Abb.15). Die stabilen Transfektanten wurden im Medium ohne G418 vermehrt, geerntet und zu weiteren Untersuchungen benutzt. In stabil hTIM3 exprimierenden CHO-K1 und HEK 293-Zellen konnte die hTIM3-Expression auf der Zelloberfläche mit den polyklonalen Antikörper des Kaninchens mittels FACS-Analyse nachgewiesen werden (s. 3.8.2).


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Abb. 15: FACS-Analyse der stabil transfizierten CHO-K1 Zellen durch EGFP-Koexpression

Die transfizierten CHO-K1 Zellen wurden mit Selektionsmedium (1 µg/ml G418) kultiviert und auf EGFP-Koexpression durch FACS sortiert. Nach 2-3 Sortierungen blieben die Zellen über 90% EGFP-positiv. blau: untransfizierte Zellen; grün: stabil transfizierte Zellen.

4.7. Immunisierung der BALB/c-Mäuse und Bestimmung des spezifischen Serumtiters

Zur Erzeugung der Hybridomzelllinie wurden drei verschiedene Immunisierungsprotokolle durchgeführt. Dazu wurden die BALB/c-Mäuse mit dem löslichen und dem unlöslichen rekombinanten hTIM3-Protein, mit stabil transfizierten CHO-K1 Zellen immunisiert. Im Abstand von 3 Wochen wurden die Mäuse zweimal geboostet. Nach dem letzten Boost wurde den Mäusen Blut entnommen und der spezifische Antikörpertiter des Serums mittels ELISA und FACS-Analyse bestimmt.

Es wurde hier ein indirekter ELISA verwendet. Für die Beschichtung der ELISA-Platten wurde 50 µl der Lösung des rekombinanten Proteins (1 µg/ml in PBS) eingesetzt. Als Primärantikörper wurde das Serum (verdünnt in PBS/BSA/Tween) in unterschiedlicher Konzentration genutzt. Als positive Kontrolle wurden die polyklonale Antikörper des Kaninchens benutzt, als Negativkontrolle das normale Mausserum (NMS). Der Sekundärantikörper (Schaf-anti-Maus-IgG- und Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat) erlaubte den spezifischen Nachweis von Maus oder Kaninchen IgG. Wie Abb. 16 zeigt, wurde ein hoher hTIM3-spezifischer IgG-Titer im Serum der immunisierten Mäusen detektiert. Im Vergleich dazu wurde nur ein sehr geringes IgG-Antikörpersignal im Serum einer nicht immunisierten Maus erhalten.


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Abb. 16: ELISA zur Bestimmung des hTIM3 spezifischen Antikörpers im verdünnten Serum der immunisierten Mäuse

DieELISA-Platten wurden mit 50 μl der Lösung des rekombinanten Proteins (1 μg/ml in PBS) beschichtet. Als Primärantikörper wurde das Serum (verdünnt in PBS/BSA/Tween) in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt. NMS: normales Mausserum; Kaninchen: das Serum des immunisierten Kaninchens; CHO-hTIM3-Maus: das Serum der mit den stabil transfizierten CHO-K1 Zellen immunisierten Maus; u. hTIM3-Maus: das Serum der mit dem unlöslichen hTIM3-Protein immunisierten Maus; lös. hTIM3-Maus: das Serum der mit dem löslichen hTIM3-Protein immunisierten Maus.

Weiterhin wurden die Seren von den immunisierten Mäusen zur FACS-Analyse eingesetzt. Das Serum wurde im Verhältnis 1: 5 in PBS/BSA/Azid verdünnt, zu den transfizierten Zellen zugegeben und für 15 min auf Eis inkubiert. Die weitere Schritte wurden so wie in 3.7.2 beschrieben durchgeführt. Als negative und positive Kontrolle wurde das Serum von einem normalen Maus und vom immunisierten Kaninchen verwendet. Als sekundärer Antikörper wurden anti-mouse-IgG-Cy5 und anti-Kaninchen-IgG-Cy5 eingesetzt. Abb. 17 zeigt deutlich, dass ein spezifischer gegen hTIM3 gerichteter IgG-Antikörpertiter im Serum der mit dem unlöslichen hTIM3-Protein immunisierten Maus nachgewiesen werden konnte. Im Vergleich dazu wiesen die Seren der mit dem löslichen hTIM3-Protein und mit den stabil transfizierten CHO-K1 Zellen immunisierten Mäuse nur geringe hTIM3-spezifische IgG-Titer auf.


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Abb. 17: FACS-Analyse zum Nachweis für hTIM3-spezifische IgG im Serum der immunisierten Mäuse

Die Mäuse wurden mit dem löslichen oder unlöslichen rekombinanten hTIM3-Protein, oder mit stabil transfizierten CHO-K1 Zellen immunisiert. Nach dem letzten Boost wurde den Mäusen Blut entnommen und die hTIM3-spezifische IgG des Serums mittels FACS-Analyse bestimmt. Die stabil hTIM3-exprimierten HEK 293 Zellen wurden zur Färbung benutzt. NMS: normales Mausserum; Kaninchen: das Serum des immunisierten Kaninchens; CHO-hTIM3-Maus: das Serum der mit den stabil transfizierten CHO-K1 Zellen immunisierten Maus; u. hTIM3-Maus: das Serum der mit dem unlöslichen hTIM3-Protein immunisierten Maus; lös. hTIM3-Maus: das Serum der mit dem löslichen hTIM3-Protein immunisierten Maus.

4.8. Fusion und Screening

Die Milzzellen der erfolgreich immunisierten Mäuse wurden mit Myelomzellen zur Fusion gebracht. Zur Selektion der relevanten Hybridome wurden 3913 vereinzelte Klone einem Spezifitätstest unterzogen. Die Fusionsausbeute betrug bei 6 unterschiedlichen Fusionen 10-31%. Zum Spezifitätstest wurden ELISA- und FACS-Analyse vorgenomen. Im ELISA zeigten 33 Klone Affinität zum löslichen TIM3 und wurden weiter subkloniert. Davon zeigte nur der Klon 28H12 von einer mit dem unlöslichen hTIM3-Protein immunisierten Maus ein stärkeres Signal nach der Subklonierung und wurde weiter bearbeitet (Abb. 18). Im FACS konnte kein Antikörpersignal von den ausgewählten Klonen, das gegen hTIM3 auf der Zelloberfläche gerichtet war, beobachtet werden.


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Abb. 18: ELISA-Screening

DieELISA-Platten wurden mit 50 μl der Lösung des hTIM3-Proteins (1 μg/ml in PBS) und PBS ohne Protein beschichtet. Der Klon 28H12 zeigte nach der Subklinierung ein stärkeres Antikörpersignal. Die Y-Achse zeigt die Extinktionswerte bei der Wellenlänge von 450 nm.

4.9. Isotyp-Bestimmung

Die Bestimmung der Klasse und Subklasse eines Antikörpers diente der Auswahl der Aufreinigungsmethode sowie der Optimierung des Testsverfahrens. Der Isotyp des Antikörpers 28H12 wurde mit den Kulturüberständen mittels ELISA durchgeführt (s.3.22Antikörper-Isotypisierung). Der Antikörper 28H12 konnte dem Isotyp IgG2a zugeordnet werden (Abb. 19).

Abb. 19: Isotyp-Bestimmung

Der Isotyp des Antikörpers 28H12 wurde nach der Subklonierung mit den Kulturüberständen mittels ELISA bestimmt. Die Y-Achse zeigt die Extinktionswerte bei der Wellenlänge von 450 nm.


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28.09.2004