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6.  Zusammenfassung

Die Zytokinproduktion von Th-Zellen ist von entscheidender Bedeutung für den Verlauf von Infektionskrankheiten, Allergien und Autoimmunkrankheiten. Seit 1986 werden Th-Zellen abhängig von ihrer Zytokinproduktion in die Untertypen Th1 und Th2 eingeteilt. Bislang wurden noch keine stabile „Marker”, die unterschiedlich auf der Oberfläche der Th1- oder Th2-Zellen exprimiert werden, identifiziert. Als Ziele therapeutischer Immunmodulation könnten solche Oberflächenmoleküle dienen, die funktionell relevant für die jeweilige Th-Subpopulation sind. In den letzten Jahren wurde ein neues Molekül, TIM3, bevorzugt auf Th1-Zellen exprimiert wird und von Bedeutung für die Funktion dieser Zellen ist, identifiziert. Das TIM3 ist mit KIM1 (kidney injury molecule 1), HAVCR (hepatitis A virus cellular receptor) und TIM2 assoziiert. Sie gehören zusammen zur TIM-Genfamilie und werden auf dem murinen Chromosom 11 bzw. dem humanen Chromosom 5 (5q32.2) lokalisiert. Bis heute ist die Funktion von TIM3 unklar. Die Experimente im Mausmodell haben gezeigt, dass TIM3 bevorzugt in aktivierten Th1-Zellen exprimiert und ein negatives Signal für Th1 mediierten Immunantwort bietet. Die immunologische Funktion des humanen TIM3 Moleküls ist noch unbekannt.

Ziel dieser Arbeit war es, die hTIM3-cDNA zu klonieren, zu exprimieren und die Mäuse mit dem rekombinanten Protein zu immunisieren, um monoklonale Antikörper herzustellen. Das hTIM3-Gen wurde mittels PCR amplifiziert und in E.coli kloniert. Die Sequenzanalyse des Gens ergab einen offenen Leserahmen von 903 bp, besteht aus 7 Exons und 6 Introns. Aus dem ORF Lässt sich für die extrazelluläre Domäne eine Größe von 19,8 kDa vorhersagen, für den komplett kodierende Bereich eine Größe von 30,9 kDa.

Die rekombinante Expression des extrazellulären Teils als Fusionsproteine mit einer N-terminalen Extension von sechs Histidinen in E. coli wurde in großen Mengen hergestellt, führte aber zur Bildung von Einschlußkörperchen. Das Protein wurde deshalb in denaturierenden Medien aufgereinigt, nach der Dialysierung gegen PBS wieder ausgefallen und zum Teil in Zitronensäure gelöst. Durch Western Blot-Analyse mit Antikörper gegen His-Tag konnte das rekombinante Protein (ca. 23 kDa) nachgewiesen werden.

Die rekombinante Herstellung der komplett kodierenden Region wurde in eukaryontischen Zellen durchgeführt. Mittels Western Blot- und FACS-Analyse mit Antiserum gegen zwei Peptid aus der extrazellulären Domäne des hTIM3 wurde gezeigt, dass das auf Zelloberfläche [Seite 73↓]der transfizierten Zellen exprimierte hTIM3-Protein große Ähnlichkeit zum auf humanen Zellen exprimierten Protein hat. Mittels Western Blot konnte für das rekombinante hTIM3 ein Molekulargewicht von ca. 40 kDa bestimmt werden. Weiter wurden stabil hTIM3-exprimierte CHO-K1- und HEK-293-Zelllinien unter Selektionsdruck mit G418 und durch FACS-Sortierung auf EGFP-Koexpression erzeugt.

Um monoklonale Antikörper herzustellen, wurden die Mäuse mit dem löslichen und unlöslichen rekombinanten hTIM3-Protein, mit stabil transfizierten CHO-K1 Zellen immunisiert. Nach der Immunisierung wurde ein spezifisch gegen hTIM3 gerichteter unterschiedlicher Antikörpertiter im Serum der immunisierten Mäuse beobachtet. Im ELISA wurde ein hoher hTIM3-spezifischer IgG-Titer im Serum der immunisierten Mäusen detektiert. Mittels FACS-Analyse konnte nur ein starkes IgG-Antikörpersignal gegen hTIM3 im Serum der mit dem unlöslichen hTIM3-Protein immunisierten Maus nachgewiesen werden. Die Milzzellen der immunisierten Mäuse wurden dann mit Myelomzellen zur Fusion gebracht. Ein monoklonaler Antikörper vom Klon 28H12 wurde im ELISA-Selektionssystem generiert, aber reagierte nicht auf das hTIM3-Molekül auf der Zelloberfläche. Der gegen das lösliche hTIM3-Protein gerichtete monoklonale Antikörper 28H12 könnte weiter zur Untersuchung der löslichen Form von TIM3 benutzt werden.


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28.09.2004