Aus dem deutschen Rheumaforschungszentrum

Dissertation

Klonierung, Expression und initiale Charakterisierung vom humanen TIM3

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
Universitätsmedizin Berlin

von
Frau Shengtao Zhang
aus Hongan, Provinz Hubei, China

Dekan:
Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. O. Liesenfeld
2. PD. Dr. med. T. Kamradt

Datum der Promotion:13. 09. 04

Inhaltsverzeichnis

• 1. Einleitung
  • 1.1. T-Zellen
  • 1.2. Aktivierung und Differenzierung naiver Th-Zellen
  • 1.3. Identifizierung unterschiedlicher Th-Subpopulationen
  • 1.4. Rolle der Th-Zellen in der Pathogenese der Autoimmunerkrankungen und Allergien
  • 1.5. Das TIM3-Molekül
  • 1.6. Ziel der Arbeit
• 2. Material
  • 2.1. Bakterienstämme und Zelllinien
  • 2.2. Mäuse und Gewebe von Menschen
  • 2.3. Oligonukleotide
  • 2.4. Plasmide
  • 2.5.  Antikörper
  • 2.6.  Puffer
  • 2.7. Medien
  • 2.8. Enzyme
  • 2.9.  Peptide
  • 2.10. Zytokine
  • 2.11. Reaktionskits
  • 2.12.  Chemikalien
  • 2.13. Geräte
  • 2.14.  Kunststoffartikel und sonstige Verbrauchmaterialien
• 3.  Methoden
  • 3.1. Ex vivo Gewinnung von dendritischen Zellen
    • 3.1.1. Isolierung von mononukleären Zellen (PBMC) aus humanem Vollblut
    • 3.1.2. Anreicherung der Monocyten über Adhärenz
    • 3.1.3. Erzeugung von dendritischen Zellen aus Monocyten
  • 3.2. Isolierung der Gesamt-RNA aus dendritischen Zellen
  • 3.3. cDNA Präparation
  • 3.4. Agarosegelelektrophorese
  • 3.5. Klonierung der hTIM3 cDNA mit Topo TA Klonierungskit
    • 3.5.1. Amplifikation der hTIM3 cDNA
    • 3.5.2. Topo Klonierungsreaktion
    • 3.5.3. Transformation
    • 3.5.4. Blau-Weiß Selektion
    • 3.5.5. Analyse von positiven Kolonien
    • 3.5.6.  Sequenzierung
  • 3.6. Subklonierung in die Expressionsvektoren
    • 3.6.1. Plasmid-PCR
    • 3.6.2. Restriktionsverdau der hTIM3-cDNA und der Plasmidvektor pQE100S und pIRES2EGFP
    • 3.6.3. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen
    • 3.6.4. Ligation der DNA-Fragmente
    • 3.6.5. Transformation in TOP10 und BL21
    • 3.6.6. PCR-Screening nach positiven Kolonien
    • 3.6.7. Isolierung von Plasmid-DNA
  • 3.7. Prokaryontische Expression der extrazellulären Region vom humanen TIM3
    • 3.7.1. Kultivierung in BL21 (DE3)
    • 3.7.2. Optimierung der rekombinanten hTIM3-Proteinexpression
    • 3.7.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
    • 3.7.4. Western Blot-Analyse der Expression
    • 3.7.5.  Die Bestimmung der rekombinanten hTIM3-Protein-Löslichkeit
    • 3.7.6. Affinitätsreinigung an Nickel-Agarose
    • 3.7.7. Bestimmung der Proteinkonzentration
  • 3.8. Eukaryontische Expression von der komplett kodierenden Region
    • 3.8.1. Transiente Transfektion
    • 3.8.2. FACS-Analyse der Transfektanten
    • 3.8.3. Western Blot-Analyse der Transfektanten
    • 3.8.4. Herstellung der stabilen Transfektion
  • 3.9. Zellkultur und Zellzahlbestimmung
  • 3.10. Einfrieren und Auftauen von Zellen
  • 3.11. Durchflusscytometrie
  • 3.12. Immunisierung der BALB/c Mäuse
  • 3.13. Serumgewinnung und Bestimmung der spezifischen Immunantwort
  • 3.14.  ELISA
  • 3.15. Kultivierung der Myelomzellen
  • 3.16. Gewinnung von Feeder-Zellen aus dem Thymus
  • 3.17. Fusion
  • 3.18.  Selektion
  • 3.19. Screening
  • 3.20. Subklonierung der Hybridome
  • 3.21.  Kultivierung der Hybridome
  • 3.22. Antikörper-Isotypisierung
• 4.  Ergebnisse
  • 4.1. Generierung der DC
  • 4.2. Klonierung der hTIM3-cDNA in pCR2.1 Vektor
  • 4.3. Struktur des hTIM3-codierenden Gens
  • 4.4. Amino-säure Sequenz des hTIM3
  • 4.5. Expression des hTIM3-Proteins in BL21
    • 4.5.1. Subklonierung der hTIM3-cDNA in den Vektor pQE100S
    • 4.5.2. Optimierung der Expression
    • 4.5.3. Western Blot-Analyse der Expression
    • 4.5.4. Aufreinigung des rekombinanten Proteins
  • 4.6. Expression des hTIM3-Proteins in eukaryontischen Zellen
    • 4.6.1. Untersuchung der transfizierten Zellen durch EGFP-Koexpression
    • 4.6.2. Untersuchung der transfizierten Zellen mit polyklonalen Antikörper des immunisierten Kaninchens
    • 4.6.3. Stabile Transfektion
  • 4.7. Immunisierung der BALB/c-Mäuse und Bestimmung des spezifischen Serumtiters
  • 4.8. Fusion und Screening
  • 4.9. Isotyp-Bestimmung
• 5. Diskussion
  • 5.1. Identifikation vom humanen TIM3
  • 5.2. Expression des hTIM3-Proteins in E. coli
  • 5.3. Expression des hTIM3-Proteins in eukaryontischen Zellen
  • 5.4. Vergleich der IgG-Antwort gegen hTIM3 in den Mäusen nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen
  • 5.5. Generierung der monoklonalen Antikörper
  • 5.6. Ausblick
• 6.  Zusammenfassung
• 7. Referenzen:
• 8. Abkürzungen
• 9. Eidesstattliche Erklärung
• 10. Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Transfektionsraten (%) mit verschiedenen Plasmiden in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl

Bilder

• Abb. 1: Aktivierung und Differenzierung naiver Th-Zellen
• Abb. 2: Schematische Darstellung des Plasmidvektors pIRES2EGFP und pQE100S und Sequenz der multiplen Klonierungsstelle.
• Abb. 3: FACS-Alalyse der DC
• Abb. 4: Amplifikation der hTIM3-spezifischen cDNA
• Abb. 5: Restriktionsverdau der Minipräparationen von pCR2.1-hTIM3
• Abb. 6: Struktur des hTIM3-codierenden Gen
• Abb. 7: Die abgeleitete Amino-säure Sequenz des hTIM3
• Abb. 8: Die Zeitabhängigkeit der extrazellulären Genexpression der hTIM3
• Abb. 9: Western Blot-Analyse der Expression
• Abb. 10: SDS-PAGE Analyse von den einzelnen Reinigungsschritten des rekombinanten hTIM3-Proteins
• Abb. 11: FACS-Analyse der transfizierten Zellen durch EGFP-Koexpression
• Abb. 12: Vergleich der Transfektionsrate von verschiedenen Zelltypen
• Abb. 13: hTIM3 –Expression auf der Zelloberfläche der Transfektanten
• Abb. 14: Western Blot-Analyse der Transfektanten
• Abb. 15: FACS-Analyse der stabil transfizierten CHO-K1 Zellen durch EGFP-Koexpression
• Abb. 16: ELISA zur Bestimmung des hTIM3 spezifischen Antikörpers im verdünnten Serum der immunisierten Mäuse
• Abb. 17: FACS-Analyse zum Nachweis für hTIM3-spezifische IgG im Serum der immunisierten Mäuse
• Abb. 18: ELISA-Screening
• Abb. 19: Isotyp-Bestimmung