1. Einleitung

• 1.1. T-Zellen

• 1.2. Aktivierung und Differenzierung naiver Th-Zellen

• 1.3. Identifizierung unterschiedlicher Th-Subpopulationen

• 1.4. Rolle der Th-Zellen in der Pathogenese der Autoimmunerkrankungen und Allergien

• 1.5. Das TIM3-Molekül

• 1.6. Ziel der Arbeit

2. Material

• 2.1. Bakterienstämme und Zelllinien

• 2.2. Mäuse und Gewebe von Menschen

• 2.3. Oligonukleotide

• 2.4. Plasmide

• 2.5.  Antikörper

• 2.6.  Puffer

• 2.7. Medien

• 2.8. Enzyme

• 2.9.  Peptide

• 2.10. Zytokine

• 2.11. Reaktionskits

• 2.12.  Chemikalien

• 2.13. Geräte

• 2.14.  Kunststoffartikel und sonstige Verbrauchmaterialien

3.  Methoden

• 3.1. Ex vivo Gewinnung von dendritischen Zellen

  • 3.1.1. Isolierung von mononukleären Zellen (PBMC) aus humanem Vollblut

  • 3.1.2. Anreicherung der Monocyten über Adhärenz

  • 3.1.3. Erzeugung von dendritischen Zellen aus Monocyten

• 3.2. Isolierung der Gesamt-RNA aus dendritischen Zellen

• 3.3. cDNA Präparation

• 3.4. Agarosegelelektrophorese

• 3.5. Klonierung der hTIM3 cDNA mit Topo TA Klonierungskit

  • 3.5.1. Amplifikation der hTIM3 cDNA

  • 3.5.2. Topo Klonierungsreaktion

  • 3.5.3. Transformation

  • 3.5.4. Blau-Weiß Selektion

  • 3.5.5. Analyse von positiven Kolonien

  • 3.5.6.  Sequenzierung

• 3.6. Subklonierung in die Expressionsvektoren

  • 3.6.1. Plasmid-PCR

  • 3.6.2. Restriktionsverdau der hTIM3-cDNA und der Plasmidvektor pQE100S und pIRES2EGFP

  • 3.6.3. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen

  • 3.6.4. Ligation der DNA-Fragmente

  • 3.6.5. Transformation in TOP10 und BL21

  • 3.6.6. PCR-Screening nach positiven Kolonien

  • 3.6.7. Isolierung von Plasmid-DNA

• 3.7. Prokaryontische Expression der extrazellulären Region vom humanen TIM3

  • 3.7.1. Kultivierung in BL21 (DE3)

  • 3.7.2. Optimierung der rekombinanten hTIM3-Proteinexpression

  • 3.7.3. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

  • 3.7.4. Western Blot-Analyse der Expression

  • 3.7.5.  Die Bestimmung der rekombinanten hTIM3-Protein-Löslichkeit

  • 3.7.6. Affinitätsreinigung an Nickel-Agarose

  • 3.7.7. Bestimmung der Proteinkonzentration

• 3.8. Eukaryontische Expression von der komplett kodierenden Region

  • 3.8.1. Transiente Transfektion

  • 3.8.2. FACS-Analyse der Transfektanten

  • 3.8.3. Western Blot-Analyse der Transfektanten

  • 3.8.4. Herstellung der stabilen Transfektion

• 3.9. Zellkultur und Zellzahlbestimmung

• 3.10. Einfrieren und Auftauen von Zellen

• 3.11. Durchflusscytometrie

• 3.12. Immunisierung der BALB/c Mäuse

• 3.13. Serumgewinnung und Bestimmung der spezifischen Immunantwort

• 3.14.  ELISA

• 3.15. Kultivierung der Myelomzellen

• 3.16. Gewinnung von Feeder-Zellen aus dem Thymus

• 3.17. Fusion

• 3.18.  Selektion

• 3.19. Screening

• 3.20. Subklonierung der Hybridome

• 3.21.  Kultivierung der Hybridome

• 3.22. Antikörper-Isotypisierung

4.  Ergebnisse

• 4.1. Generierung der DC

• 4.2. Klonierung der hTIM3-cDNA in pCR2.1 Vektor

• 4.3. Struktur des hTIM3-codierenden Gens

• 4.4. Amino-säure Sequenz des hTIM3

• 4.5. Expression des hTIM3-Proteins in BL21

  • 4.5.1. Subklonierung der hTIM3-cDNA in den Vektor pQE100S

  • 4.5.2. Optimierung der Expression

  • 4.5.3. Western Blot-Analyse der Expression

  • 4.5.4. Aufreinigung des rekombinanten Proteins

• 4.6. Expression des hTIM3-Proteins in eukaryontischen Zellen

  • 4.6.1. Untersuchung der transfizierten Zellen durch EGFP-Koexpression

  • 4.6.2. Untersuchung der transfizierten Zellen mit polyklonalen Antikörper des immunisierten Kaninchens

  • 4.6.3. Stabile Transfektion

• 4.7. Immunisierung der BALB/c-Mäuse und Bestimmung des spezifischen Serumtiters

• 4.8. Fusion und Screening

• 4.9. Isotyp-Bestimmung

5. Diskussion

• 5.1. Identifikation vom humanen TIM3

• 5.2. Expression des hTIM3-Proteins in E. coli

• 5.3. Expression des hTIM3-Proteins in eukaryontischen Zellen

• 5.4. Vergleich der IgG-Antwort gegen hTIM3 in den Mäusen nach verschiedenen Immunisierungsprotokollen

• 5.5. Generierung der monoklonalen Antikörper

• 5.6. Ausblick

6.  Zusammenfassung

Tabelle 1: Transfektionsraten (%) mit verschiedenen Plasmiden in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellzahl

Abb. 1: Aktivierung und Differenzierung naiver Th-Zellen

Abb. 2: Schematische Darstellung des Plasmidvektors pIRES2EGFP und pQE100S und Sequenz der multiplen Klonierungsstelle.

Abb. 3: FACS-Alalyse der DC

Abb. 4: Amplifikation der hTIM3-spezifischen cDNA

Abb. 5: Restriktionsverdau der Minipräparationen von pCR2.1-hTIM3

Abb. 6: Struktur des hTIM3-codierenden Gen

Abb. 7: Die abgeleitete Amino-säure Sequenz des hTIM3

Abb. 8: Die Zeitabhängigkeit der extrazellulären Genexpression der hTIM3

Abb. 9: Western Blot-Analyse der Expression

Abb. 10: SDS-PAGE Analyse von den einzelnen Reinigungsschritten des rekombinanten hTIM3-Proteins

Abb. 11: FACS-Analyse der transfizierten Zellen durch EGFP-Koexpression

Abb. 12: Vergleich der Transfektionsrate von verschiedenen Zelltypen

Abb. 13: hTIM3 –Expression auf der Zelloberfläche der Transfektanten

Abb. 14: Western Blot-Analyse der Transfektanten

Abb. 15: FACS-Analyse der stabil transfizierten CHO-K1 Zellen durch EGFP-Koexpression

Abb. 16: ELISA zur Bestimmung des hTIM3 spezifischen Antikörpers im verdünnten Serum der immunisierten Mäuse

Abb. 17: FACS-Analyse zum Nachweis für hTIM3-spezifische IgG im Serum der immunisierten Mäuse

Abb. 18: ELISA-Screening

Abb. 19: Isotyp-Bestimmung