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1.  Einleitung

Pflanzenschutzmaßnahmen sind zur Erhaltung der Leistungsfähigkeit von Kulturpflanzen in Landwirtschaft und Gartenbau unabdingbar. Sie tragen wesentlich zum Erzielen stabiler und hoher Erträge sowie hoher Qualität landwirtschaftlicher und gärtnerischer Erzeugnisse bei, was für die Wettbewerbsfähigkeit der Betriebe im Agrarsektor von ausschlaggebender Bedeutung ist.

Die Notwendigkeit einer nachhaltigen Landbewirtschaftung, Indikationslücken speziell im Bereich der Sonderkulturen sowie gestiegenes Umweltbewusstsein in der Bevölkerung haben zu einer verstärkten Suche nach Möglichkeiten zur ökologisch orientierten Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten und Schädlingen geführt. Eine solche Verfahrensweise stellt der biologische und biotechnische Pflanzenschutz dar, wobei darunter Verfahren verstanden werden, „die mit Hilfe biotischer Agenzien oder Manipulationen Erregerpopulationen dezimieren, ihre parasitische Leistungsfähigkeit beeinträchtigen oder deren Ziel es ist, durch Erhöhung der Widerstandsfähigkeit der Pflanzen den Befall mit Schaderregern zu reduzieren“ (Schönbeck1984). Dabei sind biologische Verfahren des Pflanzenschutzes nicht nur im ökologischen Anbau von Bedeutung, sondern sind außerdem wesentlicher Bestandteil in der integrierten Produktion.

Eines dieser biologischen Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten ist die Anwendung mikrobieller Gegenspieler. Der Antagonismus einiger Mikroorganismen zueinander ist schon sehr lange bekannt. Bereits im Jahre 1874 wies W. Roberts das antagonistische Verhalten von Bakterien gegenüber dem Pilz Penicillium glaucum in Flüssigkultur nach (Baker 1987). In den 20er Jahren des vergangenen Jahrhunderts gab es erste Anstrengungen, solche natürlichen Gegenspieler von Krankheitserregern nutzbar zu machen (Cook & Baker 1983). Insbesondere in den letzten 30 Jahren hat es eine nahezu unüberschaubare Vielzahl an wissenschaftlichen Arbeiten gegeben, die sich mit der Suche nach möglichen Antagonisten gegen die verschiedensten Pflanzenkrankheitserreger beschäftigt haben. Die Untersuchungen konzentrierten sich dabei ebenso auf pilzliche wie auch auf bakterielle Gegenspieler (Bochow 1989). Bei den Bakterien sind es sowohl gram-negative als auch gram-positive und Actinomyceten, die für eine Nutzung in biologischen Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten in Frage kommen (Koch 1996).


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Eine intensive Suche nach nutzbaren Gegenspielern von phytopathogenen Mikroorganismen findet seit Mitte der 60er Jahre des 20. Jahrhunderts statt (Baker 1987). Broadbent et al.(1971) nennen als mögliche Antagonisten gegen bodenbürtige, pilzliche Krankheitserreger fluoreszierende Pseudomonaden und eine ganze Reihe Arten der Gattung Bacillus, darunter Bacillus subtilis. Brown (1974) erwähnt neben weiteren Bakteriengattungen Bacillus-Arten als „Bio-Fertilizer“.

Mikrobielle Antagonisten lassen sich umso effektiver einsetzen, je mehr zu ihrer Wirkungsweise bekannt ist. Aus diesem Grunde konzentrieren sich Untersuchungen zu deren Nutzbarmachung nicht nur auf die Suche nach solchen potenziellen Antagonisten, sondern auch auf ihre Lebensweise und ihren Wirkmechanismus. Die Wirkungsweise solcher mikrobieller Gegenspieler ist auf die drei Grundmechanismen Konkurrenz, Parasitismus und Antibiose zurückführen (Koch 1996).

Einige Bakterienarten verfügen neben den genannten Grundmechanismen einer direkten Beeinflussung des Schadorganismus über die Möglichkeit, durch Interaktion mit der Pflanzenwurzel und Produktion bestimmter Substanzen wie Indol-3-Essigsäure und Cytokinin-ähnlichen Verbindungen sowie durch Verminderung der Ethylengehalte das Pflanzenwachstum zu fördern (Buchenauer 1998).

Für solche Bakterien, die in der Lage sind, die Pflanzenwurzel aktiv und passiv zu besiedeln und sich dort zu vermehren, wurde der Begriff Rhizobakterien geprägt. Brückner (1998) nennt weitere wichtige Voraussetzungen für die Kontrolle von bodenbürtigen Krankheitserregern, die von Rhizosphärebakterien erfüllt werden:

Idris Ahmed (2002) nennt mit der Aufschlüsselung von Phosphor für die Pflanze durch extrazelluläre Phytaseaktivität einiger Bacillus subtilis / amyloliquefaciens-Stämme noch einen anderen wichtigen Mechanismus, der für die Stimulation des Pflanzenwachstums durch Rhizosphärebakterien von Bedeutung ist.

1978 wurde der Begriff Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) geprägt (Kloepper & Schroth 1978). Er wird für Bakterienstämme verwendet, die Wachstum und Vitalität von Kulturpflanzen fördern und mit deren Hilfe zum Teil erhebliche Ertragssteigerungen erreicht wurden (Weller 1988). Sie erfüllen eine oder eine Kombination mehrerer der zuvor genannten Voraussetzungen. Der Begriff PGPR wurde zunächst für einige Stämme von Pseudomonas fluorescens und Pseudomonas putida verwendet (Weller 1988), ist heute aber auch für andere Pflanzenwachstum-fördernde Rhizobakterien, darunter Bacillus subtilis, üblich.

Bacillus spp. besitzen einen großen Vorteil in der praktischen Handhabung, da sie außerordentlich widerstandsfähige Endosporen bilden, die zu einem hohen Grad hitze- und trockenbeständig sind (Weller 1988, Sinclair 1989, Osburn et al. 1995). Den Untersuchungen von Broadbent et al. (1971) zufolge können in der Sporenform sowohl Temperaturen unter dem Gefrierpunkt als auch Hitze bis zu 90 °C überstanden werden. Des Weiteren zeichnen sich die Endosporen von Bacillus-Arten durch eine hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber Chemikalien und anderen letalen Einflussfaktoren wie z.B. der UV-Strahlung aus (Silva et al. 1978, Sousa et al. 1978, Bayliss et al. 1981, Sinclair 1989, Schröder 1991). Die Fähigkeit zur Bildung solcher Endosporen gewährleistet zur Kommerzialisierung eine gute Formulierbarkeit von Pflanzenschutz- bzw. Pflanzenstärkungsmitteln auf der Basis von Bacillus subtilis und anderer Arten dieser Gattung wegen der langen Haltbarkeit und unkomplizierter Lagerbedingungen für solche Produkte (McIntyre & Press 1991, Rosall & McKnight 1991, Bochow 1995, Schmiedeknecht et al. 1998). Diese Tatsache ist ein wesentlicher Grund dafür, dass sich insbesondere praxisorientierte Forschung der letzten Jahre nicht nur auf die Gattung Pseudomonas, sondern auch auf Bacillus-Arten, insbesondere Bacillus subtilis konzentrierte, obwohl fluoreszierende Pseudomonaden [Seite 4↓]vielfach als potentere und konkurrenzfähigere Rhizosphärebakterien im Vergleich zu Bacillus-Arten angesehen werden (Kim et al. 1997a, Kim et al. 1997b, Kilian et al. 2000).

Bereits 1983 wurde der von Broadbent et al. (1971) isolierte Stamm Bacillus subtilis A 13 als kommerzielles Produkt unter dem Namen QUANTUM-4000 angeboten. ‘Kodiak‘ ist ein Präparat auf der Basis des Bacillus subtilis-Stammes GB-03 (Mahaffee & Backman 1993). Seit 1997 ist ein von der FZB Biotechnik GmbH isolierter Bacillus subtilis-Stamm als biologisches Pflanzenstärkungsmittel auf dem Markt, zunächst unter dem Handelsnamen Rhizo-Plus, später unter der Stammbezeichnung FZB24®.

Antagonistische Effekte von Bacillus subtilis gegen eine Reihe pilzlicher und bakterieller Schaderreger konnten mehrfach nachgewiesen werden. Insbesondere konzentrieren sich die Untersuchungen auf die Unterdrückung wichtiger pilzlicher boden- und samenbürtiger Krankheitserreger wie Alternaria radicina, Fusarium spp., Leptosphaeria maculans, Pythium spp., Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum und Verticillium dahliae (Yehia et al. 1982, Gaikwad et al. 1987, Weller 1988, Hentschel 1991, Gantcheva 1993, Berg & Ballin 1994, Brannen 1995, Schmiedeknecht et al. 1996, Schmiedeknecht et al. 1997, Kim et al. 1997a, Grosch et al. 1999, Issoufou 2000, Schmiedeknecht et al. 2001, Hang et al. 2001, Zhao et al. 2001, Nguyen et al. 2002). Beispiele für bakterielle Schaderreger, gegen die Bacillus subtilis bereits erfolgreich eingesetzt wurde, sind Streptomyces scabies, Erwinia carotovora ssp. atroseptica, Erwinia carotovora ssp. carotovora und Pseudomonas solanacearum an Kartoffeln (Schmiedeknecht et al. 1996, Sunaina et al. 1997, Abdel-Alim et al. 2001, Abdel-Alim et al. 2002) sowie Xanthomonas campestris pv. cyamopsidis (Hooda et al. 1995). Doch damit ist das Leistungspotenzial dieses Bakteriums nicht erschöpft. So testeten Leibinger et al. (1997) Bacillus subtilis in Kombination mit anderen Mikroorganismen erfolgreich gegen pilzliche Nacherntekrankheitserreger an Apfel. Laux & Zeller (2000) sowie Laux & Zeller (2002) erreichten bei Versuchen zur Bekämpfung von Feuerbrand-Blüteninfektionen an Apfel und Birne durch Behandlung mit Bacillus subtilis einen Wirkungsgrad von 52 % bis 71 %.

Ebenso wird von phytoeffektiven Wirkungen von Bacillus subtilis berichtet, die in Form von Wachstumsförderung und höheren Erträgen der behandelten Kulturpflanzen [Seite 5↓]messbar sind (Chambers & Millington 1974, Broadbent et al. 1977, Yehia et al. 1982, Reddy & Rahe 1989a, Reddy & Rahe 1989b, Gantcheva 1993, Brannen 1995, Schmiedeknecht et al. 1996, Lehmann 1999, Issoufou 2000, Schmiedeknecht et al. 2001, Krebs 2002). Diese sind im Gegensatz zu dessen antifungalen und antibakteriellen Aktivitäten weitgehend unspezifisch, indem sie nicht auf spezielle Pflanzenarten beschränkt sind (Krebs et al. 1998). Die bisherige Suche nach bakteriellen Antagonisten gegen diverse Phytopathogene konzentrierte sich sehr stark auf die direkte antibiotische Wirksamkeit gegen bestimmte Schaderreger. Da die Wirkung über die Pflanze unspezifischer ist und die Kulturpflanze mit ihrer Ertragsleistung im Mittelpunkt des Interesses des Anbauers steht, sollte die Wirkung auf die bzw. mit der Pflanze zum Prüffaktor bei der Suche nach geeigneten Bacillus subtilis-Isolaten werden.

Die Wirkung nicht nur direkt gegen einen Schadorganismus, sondern auch über die Pflanze ist dafür verantwortlich, dass mit einer Introduktion des Nutzbakteriums auch in Abwesenheit von Phytopathogenen eine Erhöhung der Biomasseproduktion der Kulturpflanze, mit der oftmals eine Ertragserhöhung einhergeht, sowie eine größere Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stressoren erreicht werden kann. So stellte Tigges (1998) eine Minderung der negativen Auswirkungen von Salzstress auf Bohnenpflanzen in Flüssigkultur durch Behandlung mit Bacillus subtilis fest. Bochow et al. (2001) gelang bei unter Salzstress leidenden Auberginen- und Paprikapflanzen mit einer Applikation von Bacillus subtilis FZB24® eine Kompensation des Stresses, die sich in einer Ertragssteigerung um ein Vielfaches gegenüber unbehandelten Pflanzen niederschlug. Alemayehu & Bochow (1996) berichten von einer verminderten Toxinempfindlichkeit einer Tomatenzellsuspensionskultur durch Zugabe von Kulturfiltraten von Bacillus subtilis FZB-G. Dolej & Bochow (1996) erreichten mit Kulturfiltraten von Bacillus subtilis eine Toleranzinduktion in Tomatenpflanzen gegenüber dem phytopathogenen Pilz Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. Seidel (1997) konnte mit Ausfällungen des aufgereinigten Kulturfiltrates von Bacillus subtilis B50 Toleranzreaktionen in Gerste gegenüber Echtem Mehltau beobachten. Ahmed & Bochow (1997) wiesen Toleranzinduktion in Tomatenpflanzen gegenüber Meloidogyne-Befall durch Kulturfiltrate von Bacillus subtilis FZB C nach. Obgleich einige Kulturfiltratbehandlungen, insbesondere von der Übergangsphase und der stationären Phase der Fermentation, den Nematodenbefall des Wurzelsystems förderten, [Seite 6↓]kam es zu keiner weiteren Verminderung der Biomasseproduktion der Tomatenpflanzen gegenüber der unbehandelten, befallenen Kontrolle, teilweise wurde sogar Wachstumsförderung durch die Behandlungen beobachtet. Die Pflanzen waren also durch die Kulturfiltrat-Behandlungen besser in der Lage, die durch den Nematoden-Befall verursachten Schäden zu kompensieren. Eine Reduktion des Wurzelbefalls von Kartoffeln mit dem Zystennematoden Globodera pallida ist auch durch Behandlungen mit dem Rhizosphärebakterium Bacillus sphaericus bekannt (Hasky et al. 1996).

Weiterhin berichten mehrere Autoren von der Induktion systemischer Resistenz durch Bacillus subtilis. So gelang es Maiss (1987) durch Applikation zellfreier Kulturfiltrate des Nutzbakteriums, in Gerste und Gurken eine Resistenz gegenüber Viren zu induzieren. Raupach & Kloepper (1996) berichten von Induktion PGPR-vermittelter Resistenz in Gurkenpflanzen durch Anwendung von Bacillus subtilis. Sie konnten nach Behandlung mit dem Bakterium und darauf folgender CMV-Infektion eine verminderte Krankheitsintensität und teilweise ein völliges Ausbleiben der Symptomausprägung beobachten. DugassaGobena (1990) schloss auf Grund der von ihm gewählten Versuchsmethodik direkte fungistatische oder fungizide Wirkungen von Bacillus subtilis T99 und Streptomyces flavescens G 1111 gegen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici an Tomatenjungpflanzen aus und erklärte die krankheitsunterdrückende Wirkung der Antagonisten mit Resistenzinduktion. Gupta et al. (2000) konnten mit Kulturfiltraten aus der Übergangsphase der Fermentation des Bacillus subtilis-Stammes FZB G in Tomatensämlingen systemische Resistenz gegenüber dem phytopathogenen Pilz Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici induzieren. Issoufou (2000) fand bei seinen Untersuchungen keine Korrelation zwischen antibiotischer Aktivität von Bacillus subtilis in vitro und krankheitsunterdrückender Wirkung in vivo. Auch er vermutete daher, dass die antagonistische Wirksamkeit des Nutzbakteriums in vivo wesentlich auf Resistenzinduktion in den behandelten Pflanzen zurückgeht.

Zur Erhöhung der Wirkungssicherheit von Bacillus subtilis gegen diverse Krankheitserreger wurde versucht, das Nutzbakterium in Kombination mit anderen PGPR einzusetzen. Dadurch können in bestimmtem Maß durch Umweltbedingungen verursachte Wirkungsminderungen und eine zu hohe Spezifität eines einzelnen Antagonisten ausgeglichen und außerdem eine größere ökologische Stabilität erreicht werden (Metzler 1991). Voraussetzung für einen erfolgreichen Einsatz solcher [Seite 7↓]„Antagonistencocktails“ ist, dass sich Bacillus subtilis und die Kombinationspartner nicht antagonistisch zueinander verhalten. Eine solche kompatible Kombination ist beispielweise die von Bacillus subtilis und Talaromyces flavus zur Unterdrückung von Verticillium dahliae (Nagtzaam et al. 1998). Die gemeinsame Applikation beider Mikroorganismen wirkte sich nicht negativ auf deren Populationsdichte aus, die von Bacillus subtilis war sogar höher als bei alleiniger Anwendung. Trotz Halbierung des Inokulums beider Kombinationspartner wurde ein annähernd gleicher Bekämpfungserfolg erreicht. Von guten Ergebnissen und teilweise synergistischen Effekten durch die Kombination von Bacillus subtilis mit anderen mikrobiellen Nutzorganismen berichten Sridhar et al. (1993), Sankar & Jeyarajan (1996), Rosenkranz (1996) sowie Schmidt et al. (2002). Da zum Erreichen der gewünschten Effekte, wie Unterdrückung von Phytopathogenen und Wachstumsförderung der Kulturpflanzen, immer eine bestimmte Mindestkeimzahl von Rhizobakterien erforderlich ist, ist es auch von Interesse, sie durch Zugabe bestimmter chemischer Agenzien zu fördern. In diesem Zusammenhang besteht eine weitere Möglichkeit in der Anwendung von Bacillus subtilis in Verbindung mit biologischen oder synthetischen Pflanzenschutzmitteln. Auch in diesem Fall ist die Verträglichkeit des Nutzbakteriums mit der eingesetzten Wirkstoffkonzentration des Pflanzenschutzmittels Voraussetzung für den Erfolg einer solchen Behandlung. Dass Bacillus subtilis gut verträglich mit Pflanzenschutzmitteln in gängigen Anwendungskonzentrationen sein kann, lassen die Versuche von Mahaffee & Backman (1993) erkennen. Sie stellten fest, dass eine Behandlung von Baumwollsamen mit Metalaxyl und PCNB (Pentachlornitrobenzen) zu keiner Reduktion der Spermosphärenbesiedlung durch Bacillus subtilis GB-03 führte, sondern dass die Keimzahl des Antagonisten an fungizidbehandeltem Saatgut um bis zu einer Zehnerpotenz über der an unbehandeltem Saatgut lag. Ein Fungizid kann Schutz vor spezifischen pilzlichen Krankheitserregern bieten, wenn die Umweltbedingungen ungünstig für die Entwicklung und Aktivität des mikrobiellen Nutzorganismus sind (Lifshitz et al. 1985, Hwang & Chakravarty 1992). Lifshitz et al. (1985) und Chakravarty et al. (1990) berichten von der Effizienz solcher Kombinationen von nützlichen Mikroorganismen mit Fungiziden. Hwang & Chakravarty (1992) erreichten einen synergistischen Effekt durch Kombination von Bacillus subtilis mit dem Fungizid Anchor® (Carbathiin + Thiram) gegen Rhizoctonia solani an Erbsen. Von vielversprechenden Ergebnissen durch die gemeinsame Applikation von Bacillus subtilis mit Zineb berichten Obieglo et al. (1990) und Krebs et al. (1993). Additive [Seite 8↓]Wirkungen durch Kombination des Nutzbakteriums mit den fungiziden Wirkstoffen Captan, Vinclozolin, Iprodion, Metiram und Prochloraz in stark reduzierten Aufwandmengen beobachtete Jamal (1993).

Trotz vielfach guter Erfolge mit dem Einsatz nützlicher Rhizosphärebakterien wie fluoreszierenden Pseudomonaden und Bacillus subtilis gegen bodenbürtige pilzliche und bakterielle Schaderreger wird immer wieder auch von einer nicht ausreichenden bzw. unbeständigen Wirkung berichtet (Weller 1988, Postma & van Veen 1991, Lemanceau & Alabouvette 1993, Raaijmakers et al. 1995, Thompson et al. 1996). Einer der Gründe für die nicht immer zuverlässige Wirkung antagonistischer Rhizobakterien liegt in der ineffizienten Wurzelbesiedlung durch die introduzierten Mikroorganismen (Schippers et al. 1987, Weller 1988, Bull et al. 1991). Voraussetzung für eine allgemeine Akzeptanz von biologischen Pflanzenschutz- bzw. Pflanzenstärkungsmitteln bei Landwirten und Gärtnern und damit für den kommerziellen Erfolg dieser Produkte ist jedoch eine Wirkungssicherheit, die nicht hinter der von konventionellen chemischen Pflanzenschutzmitteln zurücksteht. Um das absichern zu können, ist eine detaillierte Kenntnis der Wirkungsweise von Präparaten auf der Basis des Nutzbakteriums Bacillus subtilis erforderlich. Folgende Grundvoraussetzungen müssen für das Zustandekommen phytoeffektiver und Pathogen unterdrückender Effekte durch Bacillus subtilis gegeben sein:

  1. Es muss eine Besiedlung der Pflanzenwurzel durch das Bakterium erfolgen.
  2. Es müssen ausreichend Bakterienzellen aktiv sein, d.h. in vegetativer, nicht versporter Form vorliegen.
  3. Die Bakterienzellen müssen phytoeffektiv wirksame sowie antifungale bzw. antibakterielle Substanzen produzieren. Dazu gehören unterschiedlichste Stoffe, die den Phytohormonhaushalt der Pflanze beeinflussen, z.B. solche, die der Pflanze als Nährstoff dienen oder Nährstoffe aus dem Boden pflanzenverfügbar machen, sowie Antibiotika, Enzyme und Siderophoren, aber auch Resistenz- und Toleranzinduktoren.

Die vorliegende Arbeit ist den ersten beiden Voraussetzungen gewidmet. Ziel der populations- und aktivitätsdynamischen Untersuchungen ist die detaillierte Ergründung des Besiedlungsverhaltens des Nutzbakteriums Bacillus subtilis in Abhängigkeit von verschiedenen ökologischen und edaphischen Faktoren. Des Weiteren soll eine [Seite 9↓]Bewertung einzelner biotischer und abiotischer Faktoren hinsichtlich ihres Einflusses auf die Populationsdichte des Bakteriums vorgenommen werden. Die Aktivität von Bacillus subtilis wird sowohl direkt über die Ermittlung des Versporungsgrades als auch indirekt über den Einfluss der Bakterienbehandlungen auf Pflanzenwachstum und Krankheitsbefall der Modellpflanzen betrachtet. Aus den Ergebnissen dieser Untersuchungen soll es möglich sein, Rückschlüsse auf die Einsatzbedingungen des Nutzbakteriums unter praktischen Bedingungen in Landwirtschaft und Gartenbau zu ziehen und die Anwendungsempfehlungen für das Pflanzenstärkungsmittel FZB24® auf der Basis von Bacillus subtilis zu konkretisieren.


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17.06.2004