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3.  Material und Methoden

3.1. Charakterisierung der Versuchsorganismen

3.1.1. Testpflanze Erbse (Pisum sativum L.)

Die Erbse gehört zur Familie der Fabaceae (Schmetterlingsblütengewächse) (Baumann et al. 1976). Wie alle Vertreter dieser Familie lebt sie in Symbiose mit stickstoffbindenden Bakterien (Rhizobium-Arten), die in der Lage sind, den Luftstickstoff zu verwerten (Vogel et al. 1996).

Mittlere bis schwere Böden gelten für den Erbsenanbau als ertragsfähiger im Vergleich zu leichten. pH-Werte des Bodens im Bereich von 6,5-7,5 gelten als günstig.

Temperaturextreme sind für die Erbse von Nachteil. Für Trockensubstanz- und Ertragsbildung sowie für die Mineralstoffaufnahme sind Bodentemperaturen von ca. 15 °C optimal.

Die in den nachfolgend beschriebenen Versuchen verwendete Sorte ‘Bördi‘ zählt zur Sortengruppe der Markerbsen und ist hinsichtlich der Reifezeit als früh bis mittel einzustufen (nach Vogel et al. 1996).

3.1.2. Wurzelfäuleerreger Phoma pinodella (L.K.Jones) Morgan-Jones & Burch

Dieser Pilz, der lange Zeit als Phoma medicaginis Malbr. & Roum. var. pinodella (L.K.Jones) Boerema bekannt war, wird der Unterabteilung Deuteromycotina (Fungi imperfecti), Klasse Coelomycetes, Ordnung Sphaeropsidales zugeordnet (Hoffmann et al. 1994). Nach heutigem Verständnis handelt es sich bei Phoma pinodella um eine eigene Art (Boerema et al. 1993).

Auf Agar bildet der Pilz flache Kolonien mit hellgrauem bis schwarzem Luftmyzel. Die Bildung von Myzel und Pyknidien ist sehr variabel. Die Anordung der Pyknidien ist zumeist regelmäßig. Die Konidien sind ellipsoidal, 4-9 x 2-4 µm groß und teilweise zweizellig (Domsch et al. 1980).

Phoma pinodella wurde aus Ackerböden isoliert (Dorenbosch 1970). Domsch et al. (1968) fanden den Pilz in gewaschenen Bodenpartikeln mit signifikant größerer Häufigkeit nach Anbau von Erbsen als nach Anbau von Weizen oder Raps. Ebenso wurde Phoma pinodella von Samen und Stängeln der Erbse (Winter et al. 1974) und [Seite 24↓]Klee-Wurzeln (Ylimaeki 1967) sowie aus der Rhizosphäre von Kartoffelpflanzen (Domsch et al. 1980) isoliert.

Phoma pinodella gilt als schwaches Pathogen an Erbsen, Rotklee und anderen Leguminosen (Domsch et al. 1980). An Erbsen verursacht der Pilz Fuß- und Stängelfäule (Hoffmann et al. 1994). Phoma pinodella wird in der Literatur häufig zusammen mit Ascochyta pisi Lib. und Mycosphaerella pinodes (Berk. et Blox.) Stone als Erreger der Brennfleckenkrankheit der Erbse genannt und tritt auch oft im Komplex mit den anderen beiden Arten auf (Spaar et al. 1985, Crüger 1991). Während die anderen beiden Erreger vorwiegend an oberirdischen Pflanzenteilen Symptome verursachen, hat Phoma pinodella seine Hauptbedeutung als Fußkrankheitserreger und breitet sich vom Stängelgrund abwärts und aufwärts an der Pflanze aus (Crüger 1991), kann aber auch an den Hülsen auftreten und verursacht dort typische Strichelflecke (Spaar et al. 1985). Der Pilz wird hauptsächlich mit dem Saatgut übertragen (Crüger 1991), kann aber auch über den Boden infizieren. Fußkrankheiten treten bevorzugt bei 6-8 °C auf, einzelne Erbsensorten sind unterschiedlich empfindlich gegenüber diesem Krankheitserreger (Beale et al. 1991, Crüger 1991, Knappe & Hoppe 1994).

Die Palette der Bekämpfungsmöglichkeiten von Phoma pinodella ist gering. Im Wesentlichen beschränken sie sich auf phytohygienische Maßnahmen wie Anbau von Erbsen maximal alle 4 Jahre innerhalb einer Fruchtfolge und die Verwendung von gesundem Saatgut. Eine direkte Bekämpfung durch Saatgutbeizung mit fungiziden Wirkstoffen ist ebenfalls möglich, bringt aber allenfalls einen Teileffekt und gilt als unökonomisch (Crüger 1991).

Da Phoma pinodella vor allem als Fußkrankheitserreger Bedeutung hat und zuerst das Hypokotyl infiziert, bietet sich hier ein interessanter Ansatzpunkt für die biologische Unterdrückung durch mikrobielle Antagonisten (Beale et al. 1991). Die Ergebnisse von Issoufou (2000) zeigten eine gute Hemmung des Pilzes durch Bacillus subtilis-Isolate in vitro.

Für die Versuche wurden von der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft Berlin-Dahlem insgesamt 5 von der Stängelbasis infizierter Erbsen- bzw. Ackerbohnenpflanzen isolierte Phoma pinodella-Stämme zur Verfügung gestellt. Auf Grundlage eigener Pathogenitätstests wurde das Isolat 62914 für die weitere Arbeit ausgewählt, da es sich als das aggressivste erwiesen hatte und deutlich sichtbare [Seite 25↓]Symptome in Form tief schwarzer, streifenförmiger Läsionen am Hypokotyl der Erbsenpflanzen verursachte.

Die Stammhaltung der Phoma pinodella-Isolate über einen längeren Zeitraum ohne Wirtspassage erfolgte auf Slight Nutrient Agar (SNA) nach Nirenberg (1976) (Rezeptur s. Anhang 1). Das für die Versuche verwendete Isolat 62914 wurde zur Erhaltung der Virulenz einmalig vom Hypokotyl befallener Erbsenpflanzen ebenfalls auf SNA rückisoliert und für die folgenden Experimente verwendet.

3.1.3. Wurzelfäuleerreger Rhizoctonia solani Kühn

Wie Phoma pinodella, so gehört auch der Pilz Rhizoctonia solani zur Unterabteilung Deuteromycotina (Fungi imperfecti). Er wird dort der Klasse Agonomycetes zugeordnet (Hoffmann et al. 1994).

Rhizoctonia solani wurde 1858 von Julius Kühn erstmals beschrieben und zählt zu den am längsten bekannten Pflanzenpathogenen. Das Teleomorph-Stadium wurde später als Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk. beschrieben. Aus heutiger Sicht müsste der Pilz wegen der Auffindung des geschlechtlichen Stadiums taxonomisch korrekt in die Unterabteilung Basidiomycotina eingeordnet werden. Die Sammelart Rhizoctonia solani wird in Stämme mit mehrkernigen Myzelien und solche mit zweikernigen Myzelien eingeteilt. Erstgenannte Gruppe wird nach wie vor als Rhizoctonia solani bezeichnet, Vertreter der zweiten Gruppe werden als „Rhizoctonia-ähnliche Pilze“ eingestuft.

Das Myzel von Rhizctonia solani besteht aus septierten, dickwandigen, rechtwinklig verzweigten Hyphen. Als Überdauerungsorgane werden Sklerotien gebildet, aus denen bei ausreichender Feuchtigkeit zunächst subhyaline bis weiße, sich später braun verfärbende Laufhyphen entstehen. Die Ausbreitung der Hyphen an der Pflanze erfolgt sowohl inter- als auch intrazellulär, wobei kurze Seitenverzweigungen, die sich an den Laufhyphen bilden, sich appressorienartig an die Epidermiszellen der Pflanze anlegen und in diese eindringen (Schmiedeknecht 1990).

Isolate mit zwei Kernen je Zelle werden bisher in ca. 15 Anastomosegruppen (AG) unterteilt, die mit lateinischen Großbuchstaben versehen werden. Von mehrkernigen Rhizoctonia solani-Stämmen werden derzeit 11 Anastomosegruppen unterschieden, die durch arabische Zahlen gekennzeichnet werden (Nirenberg 1996). Dabei können AG [Seite 26↓]1, 4 und 5 an Leguminosen Krankheitserscheinungen hervorrufen (Nirenberg & Dalchow 1988).

Der Pilz ist ein guter Bodensaprophyt und kann sich im Boden anreichern. Als Krankheitserreger ist Rhizoctonia solani beispielweise im Kartoffelanbau von Bedeutung (Wurzeltöter- und Pockenkrankheit) (Hoffmann et al. 1994). Des Weiteren kann der Pilz bei Keimlingen vieler Pflanzenarten die Umfallkrankheit hervorrufen und ist daher besonders in der Jungpflanzenanzucht von Bedeutung (Rosenkranz 1996).

An der Gemüseerbse kann sich der Befall mit Rhizoctonia solani auf verschiedene Weise äußern. Einerseits kann bereits der gesamte Embryo des keimenden Samens zerstört werden, was sich in einem schlechten Auflaufergebnis ausdrückt. Zum anderen können primäre Sprosse geschädigt werden, die später durch Seitentriebe ersetzt werden. Die Entstehung von Wunden auf dem unterirdischen Stängel durch die Pilzinfektion führt meist zum klassischen Umfall-Symptom. Rhizoctonia solani kann auch die Keimblätter der Erbsenpflanzen zeitig vernichten, wodurch der jungen Pflanze die gespeicherten Nährstoffe entzogen werden (Braun 1930, Seidel et al. 1990).

Das Auftreten der Rhizoctonia-Krankheit an Kulturpflanzen ist in starkem Maße von Lage, Wetter und Boden abhängig. Günstige Bedingungen für den Pilz stellen beispielsweise schwere, tonig-lehmige Böden und ein kühles Frühjahr dar (Meier 1985).

Zur biologischen Bekämpfung von Rhizoctonia solani existieren bereits Erfahrungen mit einer Reihe mikrobieller Antagonisten, darunter Bacillus subtilis (Schmiedeknecht 1990, Gantcheva 1993, Albrecht 1994, Schmiedeknecht et al. 1996, Kilian et al. 1998, Schmiedeknecht et al. 1998).

Für die hier dargestellten Untersuchungen wurden von der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft Berlin-Dahlem insgesamt folgende 5 Rhizoctonia solani-Isolate zur Verfügung gestellt:

Die Stammhaltung der einzelnen Isolate erfolgte auf zuvor sterilisierten Getreideähren.

In vorausgegangenen Pathogenitätstests erwies sich das Lupinen-Isolat 66984 mit einem Anteil befallener Erbsenpflanzen von 92,9 % und einem Krankheitsindex Ki = 58,7 % als der aggressivste Rhizoctonia solani-Stamm an Erbsenpflanzen der Sorte ‘Bördi‘ (Getmanova 1997) und wurde daher für die weiteren Untersuchungen verwendet.

3.1.4. Nutzbakterium Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn

Das Nutzbakterium Bacillus subtilis ist taxonomisch in die Ordnung Eubacteriales, Klasse Schizomycetes, Familie Bacillaceae einzuordnen. Die Bakterienzellen sind stäbchenförmig mit einer Länge von 2,0–3,0 µm und einer Breite von 0,7–0,9 µm. Sie sind peritrich begeißelt und gram-positiv (Cook & Baker 1983, Sinclair 1989, Schlegel 1992).

Bacillus subtilis ist ein aerobes, mesophiles Bakterium, dass weit verbreitet im Staub und Erdboden vorkommt. Die Zellen sind in einem Temperaturbereich von 5 °C bis
55 °C aktiv (Sinclair 1989), wobei das Optimum für das Wachstum in sterilem Boden bei etwa 25 °C liegt (Gupta & Utkhede 1986). Es werden pH-Werte zwischen 4,5 und 8,5 vertragen, das Optimum liegt in einem Bereich von 6,0 bis 7,5 (Thimann 1964, Wandke 1992).

Bei Vorliegen ungünstiger Entwicklungsbedingungen ist Bacillus subtilis in der Lage, Endosporen zu bilden, die äußerst widerstandsfähig gegenüber Umwelteinflüssen sind (Sinclair 1989). Die Sporen sind in der Lage, in wässriger Bodensuspension 10minütige Wärmebehandlungen von 80 °C bzw. eine 30minütige Bodendämpfung von 60 °C zu überstehen (Broadbent et al. 1977, Cook & Baker 1983).

Sämtliche in den vorliegenden Versuchen getesteten Bacillus subtilis-Isolate1 wurden von der FZB Biotechnik GmbH isoliert und zur Verfügung gestellt. Untersuchungen erfolgten mit dem Referenz-Stamm FZB24®, der in Deutschland als Pflanzenstärkungsmittel gelistet ist, sowie mit den Stämmen FZB27 und FZB47. Die beiden letzteren Isolate besitzen eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum [Seite 28↓]Streptomycin und sind dadurch nach Reisolation von Pflanzenwurzeln oder aus dem Substrat eindeutig zu determinieren. Der Ausgangsstamm von FZB27 ist FZB13, der von FZB47 ist der Referenzstamm FZB24®. FZB47 ist in der Lage, bis zu einer Streptomycin-Konzentration von 200 µg / ml zu wachsen. Die Streptomycin-Resistenz der genannten Stämme ist chromosomal gebunden und wird somit unverändert weitervererbt (Junge et al. 1999).

3.2. Charakterisierung der verwendeten Substrate

3.2.1. Quarzsand

Für die in Quarzsand durchgeführten Versuchsreihen wurde Quarzsand Dorsilit mit einer Korngröße von 0,6 bis 1,2 mm verwendet. Das Substrat war also weitgehend gleichförmig und enthielt kaum pflanzenverfügbare Nährstoffe. Die folgenden kennzeichnenden Parameter wurden durch eigene Messung ermittelt:

Die angegebenen Werte repräsentieren jeweils den Mittelwert aus 10 Messungen. Die pH-Messung wurde mit dem Gerät pH-AGRAR 2000 und die Bestimmung der Aktivität der Bodensalze mit AM-PET 2000 direkt in kulturfeuchtem Substrat vorgenommen.

Nach Angaben des Messgeräteherstellers bedeutet der ermittelte Wert für die Aktivität der Salze in Bodenlösung von 0,08 g / l Boden eine geringe Aktivität. Bei diesem Wert ist die pflanzliche Aufnahme der Nährstoff-Elemente N, Cl und S mäßig, die von K, Na, Ca, Mg, B und Mo gering und die von P, Fe, Mn, Zn, Cu und Al unzureichend.

3.2.2. Feldboden und Einheitserde Typ Null

Verwendet wurde ein sandiger Feldboden von der Margaretenhöhe in der Nähe von Berlin-Hohenschönhausen. Nach Untersuchungen der LUFA wurden die in Tab.1 dargestellten Nährstoffgehalte ermittelt.


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Tab.1:Nährstoffgehalte des in den Versuchen verwendeten Feldbodens

Nährstoff-Element

Gehalt [g / kg]

Stickstoff

0,64

Phosphor

0,96

Kalium

1,05

Magnesium

0,66

Kalzium

0,92

Eisen (gesamt)

6,83

Der Boden wurde durch Sieben auf eine maximale Korngröße von ca. 2 mm gebracht und mit Einheitserde Typ Null vermischt. Bei Einheitserde Typ Null handelt es sich um ein aufgekalktes, aber nicht weiter aufgedüngtes Torfprodukt. Es wurde in seiner recht groben Textur belassen. Das Mischungsverhältnis Feldboden : Einheitserde Typ Null betrug 2 : 1. Im folgenden Text steht der Begriff Feldboden jeweils für die Mischung des gesiebten, sandigen Feldbodens mit Einheitserde Typ Null. Von diesem Gemisch wurden durch eigene Messungen ermittelt:

Die Messungen erfolgten wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben.

Der ermittelte Wert für die Aktivität der Salze in Bodenlösung von 0,31 g / l Boden bedeutet eine mittlere Aktivität. Bei diesem Wert ist die pflanzliche Aufnahme der Nährstoff-Elemente N, Cl und S gut, die von K, Na, Ca, Mg, B und Mo ausreichend und die von P, Fe, Mn, Zn, Cu und Al mäßig.

3.2.3. Aussaaterde

Bei dem verwendeten Kultursubstrat Floragard Aussaaterde handelt es sich um ein Torfprodukt nach DIN 11540-F50. Das Substrat besteht aus stark zersetztem Hochmoortorf (H2-H4 und H7-H9) mit allen für das Pflanzenwachstum erforderlichen Nährstoffen. Wichtige Eigenschaften des Kultursubstrats werden in Tab.2 genannt.


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Tab.2:Wichtige Eigenschaften von Floragard Aussaaterde (Herstellerangaben)

Stickstoff-Gehalt (Reinnährstoff)

50-300 mg / l

Phosphor-Gehalt (P2O5)

80-300 mg / l

Kalium-Gehalt (K2O5)

80-400 mg / l

Salz-Gehalt

1,5 g / l

Gehalt an organischer Substanz

60 %

pH-Wert (CaCl2)

5 bis 6

Die Herstellerangabe des pH-Wertes wurde durch eigene Messungen bestätigt.

Diese ergaben folgende Ergebnisse:

Die Messungen erfolgten wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben.

Der ermittelte Wert für die Aktivität der Salze in Bodenlösung von 0,74 g / l Boden bedeutet eine hohe Aktivität. Bei diesem Wert ist die pflanzliche Aufnahme der Nährstoff-Elemente N, Cl, S, K, Na, Ca, Mg, B, Mo, P, Fe, Mn, Zn, Cu und Al gut.

3.3. Versuchsdesign

3.3.1. Versuchsserie 1

Ziel der ersten Versuchsserie war die Gewinnung von Erkenntnissen über das Verhalten von Bacillus subtilis in einem nährstoffarmen, biologisch wenig aktiven Substrat.

Dazu wurden fünf Modellversuche unter kontrollierten Bedingungen im Phytotron durchgeführt. Als Substrat fand Quarzsand Verwendung. Die Samen der Testpflanzen (Erbsen) wurden einen Tag vor Versuchsbeginn 10 min in 3 %iger NaOCl-Lösung äußerlich desinfiziert und anschließend 24 h in sterilem Leitungswasser vorgequollen. Als Versuchsgefäße dienten Plastikbecher, die mit 250 ml Substrat gefüllt wurden.

In den zu beschreibenden fünf Versuchen wurden alle steuerbaren ökologischen Faktoren mit Ausnahme der Temperatur konstant gehalten. Die relative Luftfeuchte [Seite 31↓]betrug einheitlich 65 %, die Belichtungsdauer wurde mit täglich 11 h festgelegt, wobei die Beleuchtungsintensität am Versuchsboden bei ca. 6,5 klx lag. Die Versuchsdauer betrug jeweils 30 Tage. Die Versuche wurden bei den Temperaturstufen 10 °C, 15 °C, 20 °C, 25 °C und 30 °C durchgeführt, wobei die Temperatur jeweils über den gesamten Versuchszeitraum konstant gehalten wurde.

Getestet wurden zwei verschiedene Bacillus subtils-Stämme: FZB24® und FZB27. Diese lagen in Form eines Granulats mit einer Ausgangskonzentration von 1*1011 cfu / g vor, als Trägerstoff diente Kaliumnitrat. Aus diesem Granulat wurden Sporensuspensionen der Konzentrationen 107, 108 und 109 cfu / ml hergestellt. Zur Saatgutbehandlung wurden die vorgequollenen Erbsensamen 10 min in die Sporensusupension der entsprechenden Konzentration getaucht und anschließend nach einer kurzen Antrocknungsphase ausgesät. Die Saattiefe betrug 2 cm. Bei einigen Varianten wurde eine zusätzliche Substratbehandlung durchgeführt, wobei unmittelbar nach der Aussaat 30 ml Sporensuspension der entsprechenden Konzentration je Gefäß gegossen wurden. Jeder der fünf Versuche bestand aus den in Tab.3 dargestellten 14 Varianten.

In Variante 14 wurde mit einer Kaliumnitrat-Konzentration gearbeitet, die jener in den Varianten 3 und 9 entsprach. Sie diente der Ergründung des Einflusses des Trägerstoffes auf das Wachstum der Erbsenpflanzen. Von jeder Variante wurden fünf Gefäße aufgestellt, wobei jedes Gefäß einer Wiederholung entsprach. Je Versuchsgefäß wurden drei Erbsensamen eingebracht.

Für die täglichen Wassergaben wurde steriles Leitungswasser verwendet, um einen Mikroorganismeneintrag über das Wasser in das biologisch wenig aktive Medium mit geringen Puffereigenschaften weitgehend zu vermeiden. Um eine gleichmäßige Wasserversorgung zu gewährleisten, wurde jedes der Versuchsgefäße auf eine Gesamtmasse von 450 g aufgegossen.


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Tab.3:Varianten von Versuchsserie 1

Varianten-Nr.

Bacillus subtilis Stamm

Konzentration der Sporensuspension
[cfu / ml]

Saatgut-behandlung

Substrat-behandlung

1

unbehandelte Kontrolle

2

FZB24®

1*109

X

 

3

FZB24®

1*109

X

X

4

FZB24®

1*108

X

 

5

FZB24®

1*108

X

X

6

FZB24®

1*107

X

 

7

FZB24®

1*107

X

X

8

FZB27

1*109

X

 

9

FZB27

1*109

X

X

10

FZB27

1*108

X

 

11

FZB27

1*108

X

X

12

FZB27

1*107

X

 

13

FZB27

1*107

X

X

14

Kaliumnitrat

X

X

Hinsichtlich des Besiedlungsverhaltens von Bacillus subtilis wurden folgende Aspekte untersucht:


[Seite 33↓]

Über die Methodik zur Reisolation der introduzierten Bakterienstämme gibt Abschnitt 3.4.3 Auskunft.

Des Weiteren wurden folgende Wachstumsparameter der Erbsenpflanzen bestimmt:

3.3.2. Versuchsserie 2

Zur weiteren Untersuchung der Populationsdynamik von Bacillus subtilis und dessen antagonistischer Wirksamkeit gegen ein pilzliches Phytopathogen wurden drei Modellversuche unter kontrollierten Bedingungen im Phytotron durchgeführt.

Die angewandte Methodik entsprach weitgehend jener aus Versuchsserie 1. Um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten waren auch die Versuchbedingungen dieselben wie bei der vorangegangenen Versuchsreihe. Es wurde diesmal jedoch nur mit drei Temperaturstufen gearbeitet: 15 °C, 20 °C und 25 °C.

Der Bacillus subtilis-Stamm FZB24® wurde durch den Streptomycin-resistenten Stamm FZB47 ersetzt, der ansonsten in wesentlichen Eigenschaften mit FZB24® übereinstimmt (vgl. Abschnitt 3.1.4). Wie in Versuchsserie 1 wurde daneben auch noch FZB27 verwendet.

Für die Introduktion des Nutzbakteriums wurde diesmal einheitlich Sporensuspension in einer Konzentration von 108 cfu / ml verwendet. Anstelle unterschiedlicher Konzentrationen der Sporensuspension wurden bei dieser Versuchsreihe drei verschiedene Trägersubstanzen getestet: Sand, Kaliumnitrat und Maisstärke. Die verwendeten beiden Bacillus subtilis-Stämme lagen jeweils in allen drei Formulierungen vor.

Drei Tage nach der Aussaat erfolgte die Inokulation mit dem phytopathogenen Pilz Phoma pinodella, Isolat 62914. Der Pilz war zuvor auf Petrischalen mit Erbsenagar (Rezeptur s. Anhang 2) überimpft und 4-6 Wochen im Brutschrank bei 25 °C gehalten worden. Für die Inokulation wurde eine Sporensuspension mit einer Konzentration von 1*105 cfu / ml durch Abspülen der Platten mit sterilem Leitungswasser hergestellt, von [Seite 34↓]welcher jeweils 20 ml / Gefäß appliziert wurden. Die Inokulumdichte der Konidiensuspension wurde mittels Thomakammer ermittelt.

Von jeder Variante wurden fünf Gefäße aufgestellt, wobei jedes Gefäß einer Wiederholung entsprach. Je Versuchsgefäß wurden 6 Erbsensamen eingebracht.

Hinsichtlich des Besiedlungsverhaltens von Bacillus subtilis wurden folgende Aspekte untersucht:

Des Weiteren wurden folgende Wachstumsparameter der Erbsenpflanzen bestimmt:

Außerdem wurde der Krankheitsbefall bonitiert und der Krankheitsindex berechnet (s. Abschnitt 3.4.2).

3.3.3. Versuchsserie 3

Aus der Überlegung heraus, dass in den ersten beiden Versuchsserien bereits grundsätzliche Erkenntnisse über das populationsdynamische Verhalten des zu untersuchenden Nutzbakteriums gewonnen werden konnten, beschränkten sich die Untersuchungen zur Populationsdynamik sowie zur phytoeffektiven und gesundheitsfördernden Leistung von Bacillus subtilis in Feldboden auf eine, drei Versuche umfassende Reihe. Die in Quarzsand durchgeführten Versuchsserien 1 und 2 wurden hier zusammengefasst.

Die angewandte Methodik entsprach weitgehend jener aus Versuchsserie 1. Um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten waren auch hier die Versuchbedingungen dieselben wie bei den vorangegangenen beiden Versuchsreihen. Es wurde mit den drei Temperaturstufen 15 °C, 20 °C und 25 °C gearbeitet.


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Anstelle von Quarzsand wurde hier ein sandiger Feldboden in Gemisch mit Einheitserde Typ Null verwendet. In jedes Versuchsgefäß wurden 350 g dieses Substrates gefüllt.

Die verwendeten Stämme von Bacillus subtilis waren wie in Versuchsserie 2 FZB47 und FZB27. Die Notwendigkeit der Arbeit mit markierten Stämmen ergab sich hier in besonderem Maße, da in Feldboden mit einem natürlichen Vorkommen von Bacillus subtilis gerechnet werden musste. Für die Behandlung der Versuche mit dem Nutzbakterium wurde ausschließlich die Formulierung auf Sand verwendet, um eine Beeinflussung des Pflanzenwachstums durch den Trägerstoff weitgehend auszuschließen. Die Applikation der Bakterien erfolgte in Form von Sporensuspension der Konzentrationen 108 und 109 cfu / ml. Behandelt wurde das Erbsensaatgut bzw. Saatgut und Substrat in der gleichen Weise wie bei Versuchsserie 1. Bei dem Stamm FZB27 erfolgte ausschließlich die kombinierte Anwendung (Saatgut- und Substratbehandlung).

Einer jeden Variante wurde eine entsprechende, mit dem phytopathogenen Pilz Phoma pinodella inokulierte Variante gegenübergestellt. Anzucht und Inokulation des Pilzes wurden wie bei Versuchsserie 2 durchgeführt. Die Konzentration der ausgebrachten Sporensuspension von Phoma pinodella wurde gegenüber den Versuchen in Quarzsand jedoch von 1*105 cfu / ml auf 5*105 cfu / ml erhöht, um eine ausreichende Symptomausprägung zu erreichen.

Da es sich bei dem hier verwendeten Feldboden um ein Substrat mit wesentlich besseren Puffereigenschaften im Vergleich zu Quarzsand handelt, erfolgten die täglichen Wassergaben mit unsterilem Leitungswasser.

Hinsichtlich des Besiedlungsverhaltens von Bacillus subtilis wurden folgende Aspekte untersucht:

Des Weiteren wurden folgende Wachstumsparameter der Erbsenpflanzen bestimmt:

Außerdem wurde der Krankheitsbefall bonitiert und der Krankheitsindex berechnet.

3.3.4. Langzeitversuch

Hauptziel des Langzeitversuches war die Untersuchung der Überlebensfähigkeit von Bacillus subtilis im Substrat nach 60 Tagen, also der doppelten Versuchsdauer wie in den anderen Versuchen. Weiterhin galt es zu ergründen, inwiefern sich Pflanzenwachstum-fördernde Effekte durch Bacillus subtilis-Applikation nach 60 Tagen Versuchszeit zeigen.

Um die Aussagekraft der Ergebnisse abzusichern, wurde die Anzahl der Wiederholungen auf 14 erhöht, die Variantenzahl dagegen auf 5 verringert. Der Langzeitversuch bestand insgesamt aus den in Tab.4 aufgeführten Varianten.

Tab.4:Varianten des Langzeitversuchs

Varianten-Nr.

Bacillus subtilis -Stamm

Konzentration der Sporensuspension
[cfu / ml]

Saatgut-behandlung

Substrat-behandlung

1

unbehandelte Kontrolle

2

FZB47

1*108

X

 

3

FZB47

1*108

 

X

4

FZB47

1*108

X

X

5

FZB27

1*108

X

X

Als Substrat diente in diesem Versuch Feldboden + Einheitserde Typ Null (vgl. 3.2.2). Je Gefäß wurden 5 Erbsensamen eingebracht. Der Versuch wurde im Phytotron bei einer konstanten Temperatur von 20 °C durchgeführt.

Beide Bacillus subtilis-Isolate wurden in einer Formulierung auf Sand als Trägerstoff verwendet, um zusätzliche Effekte des Trägerstoffs auf das Besiedlungsverhalten des Nutzbakteriums sowie auf das Pflanzenwachstum möglichst auszuschließen. Für die [Seite 37↓]Substratbehandlungen wurden jeweils 30 ml der Bacillus subtilis-Sporensuspension entsprechender Konzentration je Gefäß eingebracht.

Wassergaben erfolgten täglich mit Leitungswasser.

Alle an dieser Stelle nicht beschriebenen Versuchsbedingungen sowie die Vorbehandlung der Samen und die Applikation der Bakterien-Sporensuspension entsprachen der in Abschnitt 3.3.1 angegebenen Methodik.

Nach Ablauf von 60 Tagen nach der Aussaat wurden folgende Daten erfasst:

3.3.5. Einzelversuche zur Populations- und Aktivitätsdynamik von Bacillus subtilis

Mit den an dieser Stelle zu beschreibenden Experimenten wurden folgende Ziele verfolgt:

Um diese Aufgabenstellungen zu bearbeiten, waren zwei Versuche erforderlich, die methodisch in ähnlicher Weise durchgeführt wurden wie die in den vorangegangenen Abschnitten beschriebenen, die Variantenaufteilung war die gleiche wie beim Langzeitversuch (Abschnitt 3.3.4). Die Applikationen erfolgten wie bei Versuchsserie 1. Die beiden Versuche unterschieden sich lediglich dadurch, dass im ersten Quarzsand als Substrat verwendet wurde, im zweiten Feldboden + Einheitserde Typ Null. Auf die Inokulation mit Phoma pinodella wurde an dieser Stelle verzichtet. Die Versuchstemperatur betrug konstant 20 °C.


[Seite 38↓]

Von jeder Variante wurden 14 Gefäße (Wiederholungen) aufgestellt, die mit jeweils 6 Erbsensamen versehen wurden. Im Abstand von 5 Tagen, also zu 6 Terminen innerhalb der Versuchszeit von 30 Tagen, wurden von jeder Variante 2 bis 3 Gefäße zu Probenahmezwecken entfernt. Es erfolgte sofort zum Entnahmetermin die Reisolation von Substratproben und Wurzelspitzen (Methodik s. Abschnitt 3.4.3), wobei bei letzteren unterschieden wurde zwischen Rhizosphäre (Wurzeln und anhaftendes Substrat) und Rhizoplane (gewaschene Wurzeln). Am ersten Probenahmetermin wurde wegen der noch gering ausgebildeten Wurzelmasse der Keimpflanzen auf die Keimzahlbestimmung in der Rhizoplane verzichtet.

Neben der Bestimmung der Populationsdichte wurde der Versporungsgrad als Maß für die Aktivität des Nutzbakteriums in Rhizoplane, Rhizosphäre sowie im Substrat ermittelt (Methodik s. Abschnitt 3.4.3).

Zur Beurteilung des Anteils von Bacillus subtilis an der gesamten Mikroorganismenpopulation im Rhizosphärenbereich und im Substrat wurde außerdem die Gesamtkeimzahl (Bakterien und Pilze) bestimmt.

3.3.6. Komplexversuche

In Ergänzung der bisher dargestellten Experimente wurden 3 Komplexversuche zum Vergleich der Wirksamkeit von Bacillus subtilis gegen zwei pilzliche Pflanzenpathogene unter Hinzuziehung eines Neem-Präparates als Bio-Fungizid durchgeführt. Folgende konkrete Zielstellungen standen dabei im Mittelpunkt:


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Als Substrat wurde bei einem der drei Versuche Feldboden + Einheitserde Typ Null (vgl. 3.2.2), bei zwei weiteren Floragard Aussaaterde (vgl. 3.2.3) verwendet. Einer der Versuche in Aussaaterde wurde unter kontrollierten Bedingungen im Phytotron bei einer konstanten Temperatur von 20 °C, einer relativen Luftfeuchte von 65 %, einer Belichtungsdauer von täglich 11 h und einer Beleuchtungsintensität am Versuchsboden von ca. 6,5 klx durchgeführt. Die Realisierung der anderen beiden Versuche erfolgte unter Gewächshausbedingungen bei einer mittleren Temperatur von ca. 20 °C (± 10 °C) und einer mittleren relativen Luftfeuchte von ca. 70 % (± 20 %).

Vorbehandlung und Aussaat der Erbsen erfolgten wie in Versuchsserie 1, Kultivierung und Inokulation mit Phoma pinodella wie in Versuchsserie 2. Um eine deutliche Symptomausprägung zu erhalten, wurde die Sporenkonzentration auf 3*106 cfu / ml erhöht. Die Inokulation wurde drei Tage nach Aussaat durchgeführt. Dabei wurden jeweils 20 ml Sporensuspension je Gefäß eingbracht.

Vorkultivierung und Inokulation des Rhizoctonia solani-Isolats erfolgte leicht verändert nach der Methode von Gantcheva (1993). Dazu wurden zunächst Myzelstücke aus der Getreideähren-Kultur auf Petrischalen mit Kartoffeldextrose-Agar (PDA) überimpft. Von einer vollbewachsenen PDA-Platte wurde dann ein ca. 1 cm2 großes Impfstück entnommen. Dieses wurde in mit 100 ml Kartoffeldextrose-Flüssigmedium (PDB) gefüllte 300 ml-Erlmeyerkolben überimpft und anschließend bei 25 °C drei Wochen im Brutschrank inkubiert. Unmittelbar vor der Inokulation wurde die gewachsene Myzeldecke entfernt. Ca. 20 g der Myzeldecke wurden anschließend in 600 ml sterilem Leitungswasser mit Hilfe eines Mixers homogenisiert. Von dieser Myzelsuspension wurden jeweils 20 ml je Aussaatgefäß eingebracht. Die Inokulation erfolgte wie bei Phoma pinodella drei Tage nach Aussaat der Erbsen.

Als Bacillus subtilis-Stamm wurde für diese Versuche ausschließlich FZB47 verwendet. Die Applikationen erfolgten wie unter 3.3.1 beschrieben mit einer Konzentration von jeweils 108 cfu / ml für Saatgut- und Substratbehandlung.

Als Bio-Fungizid kam das Neem-Präparat Rakshak Gold (Murkumbi Bio-Agro Pvt. Ltd. Belgam, Indien) mit einer Ausgangskonzentration von 10000 ppm Azadirachtin zum Einsatz. Bei diesem Mittel handelt es sich um eine Neemöl-Formulierung. Das Präparat hatte sich in vorangegangenen Versuchen in bestimmten Konzentrationen als gut verträglich für Erbsenpflanzen herausgestellt. Für die Beimischung zu der Bacillus [Seite 40↓] subtilis-Sporensuspension zur Saatgut- bzw. Substratbehandlung wurde eine Konzentration von 10 ppm Rakshak Gold gewählt. Ein Beimischen von 10 ppm dieses Neem-Präparats zu PDA hatte bei zuvor durchgeführten in vitro-Tests zu einer Hemmung des Wachstums von Phoma pinodella und zu einer Förderung des Koloniewachstums von Bacillus subtilis geführt (Zimmer et al. 1999a). Die Behandlung von Samen bzw. Substrat erfolgte mit der gleichen Konzentration.

Die Applikation des Neem-Präparates und von Bacillus subtilis wurde jeweils als Saatgut- und Substratbehandlung am Tag der Aussaat durchgeführt.

Über die einzelnen Varianten der Komplexversuche gibt Tab.5 Auskunft.

Tab.5:Varianten der Komplexversuche

Varianten-Nr.

Bacillus subtilis

Rakshak Gold

Phoma pinodella

Rhizoctonia solani

1

unbehandelte Kontrolle

2

  

X

 

3

   

X

4

 

X

  

5

X

   

6

X

 

X

 

7

X

  

X

8

 

X

X

 

9

 

X

 

X

10

X

X

X

 

11

X

X

 

X

Es wurden jeweils 6 Gefäße (= 6 Wiederholungen) aufgestellt, die mit je 6 Erbsensamen bestückt wurden. Wassergaben erfolgten täglich mit gewöhnlichem Leitungswasser.


[Seite 41↓]

Nach 30 Tagen Versuchsdauer wurden folgende Daten erfasst:

3.4. Versuchsauswertung

3.4.1. Erfassung von Wachstumsparametern der Testpflanzen

Zur Bestimmung der Sprosslänge der Testpflanzen wurde der Bereich vom Samen bis zum Ansatz des obersten Laubblattes gemessen.

Die Ermittlung der absoluten Wurzellänge erfolgte nach Newman (1966), indem das gesamte Wurzelsystem einer Pflanze in eine mit wenig Wasser gefüllte Schale mit einem 1 x 1 cm Raster gelegt und die Anzahl der Schnittpunkte mit den horizontalen und vertikalen Gitternetzlinien ausgezählt wurden. Die Wurzellänge wurde dann nach folgender Formel errechnet:

R = absolute Wurzellänge
N = Anzahl der Schnittpunkte
A = Fläche des verwendeten Rasters
H = totale Länge aller Gitternetzlinien

In einigen Versuchen wurden außer der Frischmasse auch die Trockenmassen von Spross und Wurzel ermittelt. Dazu wurden die Pflanzenteile 48 h bei einer Temperatur von 65 °C getrocknet.


[Seite 42↓]

3.4.2.  Ermittlung des Krankheitsbefalls der Testpflanzen

Die Ermittlung des Befalls von Erbsenpflanzen durch Rhizoctonia solani erfolgte nach einem fünfstufigen Bonitursystem in Anlehnung an Gooss (1976), Janke & Hubert (1987) sowie Gantcheva (1993):

In Ableitung dieses Boniturschemas erfolgte in ähnlicher Weise die Bonitur des Krankheitsbefalls durch Phoma pinodella an Erbsenpflanzen:


[Seite 43↓]

Als Ausdruck des Krankheitsbefalls wurde der Krankheitsindex nach folgender Formel berechnet:

Ki = Krankheitsindex
B = Boniturstufe
n = Anzahl der Pflanzen je Boniturstufe
N = Gesamtzahl der Pflanzen je Wiederholung bzw. je Variante
4 = höchste Boniturstufe

3.4.3. Reisolation der introduzierten Bacillus subtilis -Isolate

Nährmedium:

Zur Bestimmung der Keimzahl von Bacillus subtilis in der Rhizosphäre und im Substrat wurde Standard-I-Nähragar (Merck) mit folgenden Zusätzen verwendet:

(Rezeptur nach Grosch 1996)

Die Zusätze dienten der Unterdrückung des Wachstums von Pilzen und gram-negativen Bakterien. Da das Erbsensaatgut vor der Behandlung mit Bacillus subtilis mit Natriumhypochloritlösung äußerlich desinfiziert worden war, fand für die Reisolation des behandelten Erbsensaatgutes Standard-I-Nähragar ohne Zusätze Verwendung.

Vorgehensweise:

Zur Ermittlung der Keimzahl von Bacillus subtilis auf der Oberfläche des behandelten Erbsensaatgutes wurden jeweils 10 Erbsen (ca. 2 g) nach Antrocknung in 98 ml steriler, 0,3 %iger NaCl-Lösung 30 min bei 220 rpm geschüttelt. Danach erfolgte die Herstellung von Verdünnungsstufen. Auf die Nährbodenplatten mit Standard-I-Nähragar wurden jeweils 0,1 ml pro Petrischale pipettiert und mit einem Drigalski-[Seite 44↓]Spatel auf dem Nährboden verteilt. Die Agarplatten wurden anschließend 2 Tage bei
25 °C im Brutschrank inkubiert und danach die Bacillus subtilis -Kolonien ausgezählt. Unter Berücksichtigung der jeweiligen Verdünnungsstufe erfolgte die Berechnung der Keimzahl von Bacillus subtilis je Erbsensamen nach folgender Beziehung:

KZ = Keimzahl Bacillus subtilis je Erbsensamen
C = Anzahl der Bacillus subtilis-Kolonien je Petrischale
V = Verdünnungsstufe
N = Anzahl für die Reisolation verwendeter Erbsensamen
10 = Multiplikationsfaktor

Für die Bestimmung der Populationsdichte von Bacillus subtilis im Rhizosphärenbereich wurde von jeweils einer Erbsenpflanze je Gefäß (Wiederholung) das Substrat vorsichtig von der Wurzel abgeschüttelt und anschließend je Variante eine Mischprobe hergestellt, wobei die im Abschnitt 3.3.1 beschriebenen Wurzelabschnitte (Wurzeloberteil, Wurzelmittelstück, Wurzelspitze) getrennt reisoliert wurden. Von den Wurzelproben mit dem nach Abschütteln noch anhaftenden Substrat wurde 1 g in 99 ml steriler, 0,3 %iger NaCl-Lösung 30 min bei 220 rpm geschüttelt. Die Herstellung der Verdünnungsreihen und das Ausplattieren auf Standard-I-Nähragar mit oben angegebenen Zusätzen erfolgte wie bei der Ermittlung der Keimzahl am behandelten Erbsensaatgut. Als Bezugsgröße für die Berechnung der Populationsdichte diente die Trockenmasse der Wurzeln einschließlich des noch anhaftenden Substrates. In Abwandlung der Formel für die Berechnung der Anzahl am Erbsensaatgut anhaftender Bacillus subtilis-Keime ergibt sich für die Reisolation von Wurzelmaterial folgende Beziehung:

KZ = Keimzahl Bacillus subtilis je g Trockenmasse
C = Anzahl der Bacillus subtilis-Kolonien je Petrischale
V = Verdünnungsstufe
TM = Gesamttrockenmasse des reisolierten Wurzelmaterials mit anhaftendem Substrat
10 = Multiplikationsfaktor


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Zur Ermittlung der Keimzahl von Bacillus subtilis im Quarzsand wurden 10 g von dem Substrat in 90 ml sterilem Leitungswasser 30 min bei 220 rpm geschüttelt. Die Reisolierung erfolgte auch hier mit der bereits beschriebenen Verdünnungsplattenmethode, die Keimzahlbestimmung nach der gleichen Beziehung wie für die Reisolation von Wurzelmaterial.

Beginnend mit Versuchsserie 2 wurde anstelle von Standard-I-Nähragar wegen der kompakteren, für die Keimzahlermittlung günstigeren Kolonieform von Bacillus subtilis (Krebs 1998) Waksman-Agar (Rezeptur s. Anhang 3) verwendet. Zum Erreichen einer effektiveren Arbeitsweise wurden für die Reisolation von Wurzelteilen (Rhizosphäre bzw. Rhizoplane) und Substrat die Agarplatten ab Versuchsserie 2 in 3 möglichst gleichgroße Sektoren aufgeteilt. Pro Sektor wurden jeweils 0,02 ml von den entsprechenden Verdünnungsstufen auf den Nährboden pipettiert und mit dem Drigalski-Spatel verteilt, sodass je 3 Wiederholungen auf einer Petrischale untergebracht werden konnten. Der Multiplikationsfaktor bei der Berechnung der Keimzahl von Bacillus subtilis betrug dann entsprechend 50 anstatt 10 wie in den oben gezeigten Formeln.

Für die Bestimmung der Gesamtkeimzahl in Rhizosphäre und Substrat bei den unter 3.3.5 beschriebenen Versuchen wurde R2A-Agar nach Reasoner & Geldreich (1985) in kommerziell erhältlicher Form (DIFCO) als standardisiertes, nährstoffreiches, nichtselektives Medium verwendet. Damit kann insbesondere eine große Anzahl von Bakterienarten erfasst werden (Dechema 1992, Krebs 1998). Von der aus Wurzel- bzw. Substratproben gewonnenen Suspension wurden von verschiedenen Verdünnungsstufen je 0,1 ml je Petrischale ausplattiert. Die so beimpften Petrischalen mit R2A-Medium wurden 10 Tage bei 20 °C bebrütet und danach ausgezählt.

Zur Ermittlung des Versporungsgrades bei den unter 3.3.5 und 3.3.6 beschriebenen Versuchen wurden dieselben Reagenzgläser der Verdünnungsreihe, aus denen Sporensuspension zur Feststellung der Populationsdichte von Bacillus subtilis auf das Nährmedium ausplattiert wurde, anschließend in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 80 °C 20 min erhitzt, um vegetative Zellen des introduzierten Bakteriums abzutöten. Danach wurde erneut ausplattiert. Aus der Differenz der ermittelten Keimzahlen vor und nach der Wärmebehandlung erfolgte die Berechnung des Versporungsgrades [%].


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3.4.4.  Statistische Auswertung

Bei Vorliegen von Normalverteilung und Varianzhomogenität wurden die ermittelten Boniturdaten mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse verrechnet. Der Mittelwertvergleich erfolgte mit Hilfe des TUKEY-Tests bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p = 0,05.

Da bei der Berechnung des Krankheitsindex auf Boniturnoten als nicht metrisch skalierte Variable zurückgegriffen wurde, fand hier für die Mittelwertvergleiche der Kruskal-Wallis-Test (H-Test) Verwendung.

Bei der Keimzahlermittlung wurden die errechneten Werte zur Erreichung einer Varianzhomogenität in den dekadischen Logarithmus (log cfu Bacillus subtilis / g Wurzel- bzw. Substrattrockenmasse) überführt.

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Computerprogramm SPSS für Windows (Version 8.0).


Fußnoten und Endnoten

1 In der vorliegenden Arbeit werden die Begriffe „Stamm“ und „Isolat“ synonym verwendet.



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17.06.2004