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5.  Diskussion

Bedeutung ökologischer und edaphischer Faktoren

Für die Beurteilung der Leistungsfähigkeit nützlicher Rhizosphärebakterien in der landwirtschaftlichen und gartenbaulichen Praxis reichen die Erfahrungen von in vitro-Tests nicht aus, da sie die unter Praxisbedingungen herrschenden ökologischen und edaphischen Faktoren nicht berücksichtigen. Diese haben entscheidenden Einfluss auf alle drei Grundvoraussetzungen für die Wirksamkeit von Nutzbakterien, nämlich deren Populationsdynamik, Aktivität und Produktion wirksamer Substanzen. Aus diesem Grund unterscheiden sich Ergebnisse aus in vivo-Versuchen oftmals deutlich von solchen aus in vitro-Tests. So stellten Grosch et al. (1999) fest, dass der Stamm Bacillus subtilis FZB37 den phytopathogenen Pilz Pythium aphanidermatum in vivo nicht wirkungsvoll unterdrücken konnte, obwohl in vorangegangenen in vitro-Tests beste Ergebnisse gegen diesen Pilz erzielt worden waren (Krebs et al. 1998). Diskrepanzen zwischen antifungaler Leistung in vitro und in vivo fanden auch Schmiedeknecht et al. (2001). Aus derartigen Erfahrungen heraus hielt es Kloepper (1991) für günstiger, sich beim Screening potenzieller Antagonisten nur auf in vivo-Versuche zu konzentrieren und entwickelte zwei in vivo-Tests als mögliche Alternative zu in vitro-Verfahren. Wegen der Bedeutung ökologischer und edaphischer Faktoren für Bacillus subtilis als Pflanzenstärkungsmittel und „Bio-Fertilizer“ soll deren Rolle in den dargestellten Versuchen besonders herausgehoben und nachfolgend diskutiert werden.

Besiedlung von Samen, Wurzeln und Substrat

Einfluss der applizierten Dosis

Die Konzentration der für die Saatgutbehandlung verwendeten Sporensuspension von Bacillus subtilis widerspiegelte sich in der am behandelten Saatgut ermittelten Keimzahl, die sich direkt proportional zum angewandten Titer verhielt. Diese Tatsache stimmt mit Erkenntnissen von McKnight & Rosall (1991) überein, die die Abhängigkeit der Besiedlungsdichte von Bacillus subtilis von der introduzierten Keimzahl und dem Wachstumsmedium herausstellen.

Die Anzahl anhaftender Bakterienkeime pro behandeltem Erbsensamen, die ca. zwei bis drei Zehnerpotenzen unter dem angewandten Titer lag, ist ein Verhältnis, das sich bei allen Versuchsreihen zeigte. Von ähnlichen Erfahrungen berichtet auch Bochow[Seite 120↓](1994). Untersuchungen von Jamal (1993) ergaben bei Tauchung von Möhrensamen ebenfalls eine Anzahl am Saatgut haftender Bacillus subtilis-Keime, die etwa zwei Zehnerpotenzen unterhalb der Konzentration der Sporensuspension lag, mit der die Tauchbehandlung erfolgte. Bei den eigenen Versuchen lagen ab Versuchsserie 2 die ermittelten Keimzahlen am behandelten Erbsensaatgut geringfügig unter denen der ersten Serie, wo bei gleicher Anwendungskonzentration von 108 cfu / ml etwa 106 cfu / Erbse erreicht wurden. Als Ursache dafür wird die Verwendung einer neuen Charge von Bacillus subtilis-Granulaten angesehen, die von der FZB Biotechnik GmbH zur Verfügung gestellt worden war. Zudem war der Stamm FZB24® ab Versuchsserie 2 durch FZB47 ersetzt worden. Fukui et al. (1994) untersuchten elektronenmikroskopisch die Besiedlung von Zuckerrübensamen durch Pseudomonas spp. und Bacillus subtilis. Sie stellten eine ungleichmäßige Besiedlung der Samen durch Bacillus subtilis fest, wobei die Verfügbarkeit von Nährstoffen für die Populationsgröße der Bakterien als limitierender Faktor gesehen wird.

Bei der Interpretation der Resultate aus den eigenen populationsdynamischen Untersuchungen ist zu beachten, dass das Erbsensaatgut vor Behandlung oberflächlich desinfiziert worden war, d.h. potenzielle Konkurrenten von Bacillus subtilis waren ausgeschaltet worden. Die Bakterien hatten damit bevorzugte Ausgangsbedingungen für eine Besiedlung von Samen und Wurzel. So ist bekannt, dass auch die Bedingungen in der Spermosphäre die Wurzelbesiedlung über Saatgutbehandlung eingebrachter Bakterien signifikant beeinflussen können (Mahaffee & Backman 1993).

Unterschiedliche Ausgangsbedingungen schlugen sich bei allen unseren Tests auch nach 30 Tagen Versuchsdauer noch in einer unterschiedlich starken Besiedlung der Rhizosphäre nieder. Besonders der Einfluss der applizierten Dosis ist nach dieser Zeit noch spürbar, was bisherige Erfahrungen bestätigt, sowohl bei Bacillus subtilis (Freier et al. 1990a, McKnight & Rosall 1991, Krebs et al. 1993, Malies 1995) als auch bei fluoreszierenden Pseudomonaden (Bull et al. 1991).

In unserer Versuchsserie 1 wurde bei alleiniger Saatgutbehandlung bei der höchsten applizierten Konzentration (109 cfu / ml) bei allen Temperaturstufen auch an der Wurzel die höchste Besiedlungsdichte festgestellt. Die Unterschiede zur Variante mit dem niedrigsten angewandten Titer (107 cfu / ml) bewegten sich bei allen verwendeten Temperaturen allerdings unterhalb einer Zehnerpotenz und waren nur selten signifikant. Das bedeutet, dass sich Differenzen in der Ausgangsbesiedlung des Erbsensamens [Seite 121↓]durch Etablierung und Vermehrung von Bacillus subtilis über den Versuchszeitraum zunehmend verringern und dass die Bakterien in Quarzsand sich bei niedrigerer introduzierter Keimzahl schneller vermehren. Möglicherweise nähert sich die Populationsdichte des Nutzbakteriums im Wurzelbereich speziell bei hoher applizierter Dosis einem kritischen Wert an, welcher der maximalen Tragfähigkeit der Pflanzenwurzel für Bacillus subtilis entspricht. Das würde erklären, weshalb in Versuchsserie 1 bei kombinierter Saatgut- und Substratbehandlung mit 109 cfu / ml durch Temperaturerhöhung kaum mehr eine größere Populationsdichte von Bacillus subtilis an Erbsenwurzeln erreicht wurde. Der ermittelte Wert lag hier bei Temperaturen von 10 °C bis 25 °C immer im Bereich von 109 cfu / g Wurzeltrockenmasse. Ähnliche Erfahrungen sind von fluoreszierenden Pseudomonaden bekannt. Kluepfel (1993) beobachtete unabhängig von der applizierten Dosis innerhalb von acht Tagen die gleiche Bakteriendichte an Weizenwurzeln und schloss daraus, dass die zu einem frühen Zeitpunkt nach Introduktion des Pseudomonas aureofaciens-Stammes ermittelten Populationsdichten an den Wurzeln deren Tragfähigkeit für diese Bakterien repräsentieren. Diese ist in sterilem Substrat größer als in natürlichem Boden.

Großen Einfluss auf die Besiedlungsdichte von Bacillus subtilis im Wurzelbereich hatte eine zusätzliche Substratbehandlung, insbesondere bei hohem angewandten Titer (109 cfu / ml). In diesem Fall lagen die ermittelten Keimzahlen im Wurzelbereich zum Teil um mehr als zwei Zehnerpotenzen über denen bei alleiniger Saatgutbehandlung. Auch von Albrecht (1995) wurde mit Substratapplikation und kombinierter Saatgut- und Substratapplikation die größte Besiedlungsdichte von Bacillus subtilis in der Rhizosphäre erreicht. Die Gründe für diese Differenzen liegen offenbar darin, dass durch eine Substratbehandlung wesentlich mehr Bakterienkeime in das Beziehungsgefüge Pflanze – Substrat gelangen als durch alleinige Saatgutbehandlung. Das verdeutlicht folgendes Beispiel auf der Basis von Daten aus Versuchsserie 1: Auf der Oberfläche mit FZB24® -Sporensuspension 107 cfu / ml behandelter Erbsensamen wurden 4,27 * 104 Bacillus subtilis-Keime je Samen ( = log cfu 4,63) wiedergefunden. Drei Samen wurden in jedes Gefäß gesät, d.h. bei alleiniger Saatgutbehandlung gelangten in 250 ml Quarzsand insgesamt 1,281 * 105 Sporen des Bakteriums. Bei kombinierter Anwendung wurden durch die Substratbehandlung zusätzlich 3,0 * 108 Bacillus subtilis-Keime (30 ml mit 1,0 * 107 Bakteriensporen) in jedes Gefäß eingebracht, also ca. 2340 mal soviel wie durch Saatgutbehandlung. So waren bei [Seite 122↓]kombinierter Anwendung nach 30 Tagen Versuchsdauer noch höhere Keimzahlen von Bacillus subtilis im Bereich der Rhizosphäre nachweisbar, obgleich der Unterschied zur alleinigen Saatgutbehandlung geringer als eine Zehnerpotenz war. Bei dem höchsten angewandten Titer von 109 cfu / ml FZB24® waren bei den niedrigeren Versuchstemperaturen (10 °C, 15 °C) nach 30 Tagen noch Unterschiede in der Besiedlungsdichte im Wurzelbereich in der Größenordnung von 103 cfu / g Wurzeltrockenmasse zwischen alleiniger Saatgutbehandlung und kombinierter Anwendung sichtbar. Ursache dafür scheint, dass die Bakterien im Wurzelraum bei höherer Ausgangskeimzahl sich langsamer vermehren – insbesondere bei niedrigen Temperaturen. Zudem dürfte bei einer Populationsdichte von etwa 109 cfu / g Wurzeltrockenmasse im Wurzelbereich durch Autokonkurrenz eine gewisse Populationssättigung erreicht sein, wodurch auch bei Steigerung der Temperatur kaum mehr eine höhere Besiedlungsdichte in der Rhizosphäre zu verzeichnen war.

Einfluss der Applikationsmethode

Eine Saatgutbehandlung ist im Vergleich zur Substratbehandlung effektiver, weil sich hier die eingebrachten Bakterien direkt an der Pflanze befinden und somit schneller und intensiver die Wurzel besiedeln können. In den eigenen Versuchen zeigte sich besonders bei einem angewandten Titer von 107 cfu / ml und niedriger Versuchstemperatur, dass eine zusätzliche Substratbehandlung zwar zu drei Zehnerpotenzen höheren Keimzahlen von Bacillus subtilis im Substrat führte, die Populationsdichte im Wurzelbereich jedoch nur unwesentlich (um weniger als eine Zehnerpotenz) erhöhte. Die von Malies (1995) gegenüber der Saatgutbehandlung favorisierte Gießbehandlung in erdeloser Kultur kann für Quarzsand (oder auch Feldboden) nicht gelten, da die räumliche Ausbreitung der Bakterienpopulation hier wesentlich langsamer vor sich geht als in einem flüssigen Medium. Nach Howie et al. (1987) sowie Weller & Thomashow (1994) ist die Wurzelbesiedlung durch PGPR ein Prozess, der sich in zwei Phasen vollzieht:

  1. Vom Samen kommen die Bakterien in Berührung mit der auskeimenden Wurzelspitze. Mit dem Wachstum derselben gelangen diese passiv in tiefere Bodenschichten. Dabei verbleiben im Zuge des Wurzelwachstums einige Bakterien an der Wurzelspitze, während andere an älteren Wurzelteilen oder in der Rhizosphäre zurückbleiben.[Seite 123↓]
  2. Die an der Pflanzenwurzel verteilten Bakterien vermehren sich, bilden in nährstoffreichen Nischen Mikrokolonien, konkurrieren mit der autochthonen Mikroflora und behaupten sich im Wurzelraum.

Dabei ist Phase (2), nämlich die aktive Besiedlung des Wurzelraumes der Pflanze, der entscheidende Punkt, der PGPR von Nicht-Rhizosphärebakterien unterscheidet. Eine Saatgut- oder Pflanzgutbehandlung (z.B. Wurzeltauchung) gewährleistet, dass sich die applizierten Bakterien bereits zur Aussaat bzw. Pflanzung an dem Ort befinden, an dem sie ihre Wirkung entfalten sollen, sodass sofort Phase (2) beginnen kann. Das bietet Zeitgewinn und damit einen Konkurrenzvorteil gegenüber bodenbürtigen pilzlichen oder bakteriellen Organismen. Wurzelbesiedlung durch Rhizosphärebakterien schließt die Verbreitung von einer Inokulum-Quelle entlang der aktiv wachsenden Wurzel sowie Vermehrung und Wachstum in der Rhizosphäre ein (Parke 1991). Diese grundlegenden Eigenschaften konnten für die verwendeten Bacillus subtilis-Stämme bereits in unserer Versuchsserie 1 eindeutig nachgewiesen werden.

Einfluss der Temperatur

Die Populationsdichte von Bacillus subtilis in der Rhizosphäre wurde als stark temperaturabhängig erkannt. Das Temperaturoptimum für die Populationsentwicklung liegt in sterilem Boden bei 25 °C (Gupta & Utkhede 1986). Dies erklärt, weshalb die in der Rhizosphäre ermittelten Keimzahlen sich mit steigender Temperatur erhöhten. Bei 30 °C wurden allerdings auch noch höhere Besiedlungsdichten von Bacillus subtilis festgestellt als bei 25 °C, jedoch ist auch das in den eigenen Versuchen verwendete Substrat Quarzsand nicht als steril anzusehen. Kilian et al. (2000) führten sich mit steigender Temperatur erhöhende Populationsdichten von Bacillus subtilis auf die entsprechend ansteigende Stoffwechselaktivität der Bakterienzellen zurück. Die in unseren Versuchsserien gefundene Temperaturabhängigkeit bei der Rhizosphären-besiedlung des Bakteriums korreliert mit Ergebnissen von Reddy & Rahe (1989a), die bei Temperaturen von 22 °C-25 °C größere Populationsdichten von Bacillus subtilis feststellten als bei 17 °C-19 °C. Jedoch ist das Populationswachstum von Bacillus-Arten auch bei niedrigen Temperaturen belegt. Kim et al. (1997b) beobachteten noch bei 4 °C Wachstum von Bacillus sp. L324-92, was allerdings auch für Vertreter dieser Gattung ungewöhnlich sein dürfte. Die Fähigkeit zur Vermehrung innerhalb eines weiten Temperaturspektrums ist von Bedeutung, um auch bei ungünstigen Temperaturverhältnissen – etwa bei kühler Witterung nach Aussaat oder Pflanzung der [Seite 124↓]Kulturpflanzen im zeitigen Frühjahr – eine ausreichende Wurzelbesiedlung durch introduzierte PGPR und damit Pathogen unterdrückende und phytoeffektive Wirkungen absichern zu können.

Hinsichtlich Abhängigkeit von Temperatur sowie Behandlungsmodus zeigten sich bei der Populationsdichte von Bacillus subtilis im Substrat ähnliche Tendenzen wie an den Wurzeln, jedoch auf niedrigerem Niveau. Niedrigere Keimzahlen des introduzierten Bakteriums im Substrat außerhalb der Rhizosphäre waren in Quarzsand zu erwarten. Die Ergebnisse stimmen überein mit Erfahrungen von Kortemaa et al. (1997) mit Streptomyces griseoviridis. Dass im Quarzsand, der für Bacillus subtilis kaum eine Lebensgrundlage bietet, teilweise dennoch recht beachtliche Keimzahlen ermittelt wurden, ist einerseits darauf zurückzuführen, dass durch das ständige Wässern der Pflanzen vom Rhizosphärenbereich sowohl Keime des Nutzbakteriums wie auch Wurzelexsudate ins Substrat abgespült wurden. Andererseits wird bei den Varianten mit Substratbehandlung auch ein großer Teil der ursprünglich introduzierten Bakterien mit erfasst, der während der gesamten Versuchsdauer versport war und sich nicht vermehrt hat.

Räumliche Verteilung an der Pflanzenwurzel

Die Besiedlung von Pflanzenwurzeln und einzelnen Wurzelabschnitten durch introduzierte Bakterien erfolgt keineswegs gleichmäßig. Einzelne Wurzeln derselben Pflanze variieren hinsichtlich ihres Alters, ihrer Morphologie und Physiologie sowie der Freisetzung von Wurzelexsudaten (Bowen & Rovira 1976, Kluepfel 1993). So hat die Tatsache, dass in der oberen Bodenschicht 25 % bis 50 % aller Wurzeln abgestorben sein können, entscheidenden Einfluss auf Populationen von Mikroorganismen (Kluepfel 1993). Auf Grund dieser Erkenntnis wurden in den eigenen Versuchen einzelne Wurzelabschnitte im Hinblick auf deren Besiedlung mit dem introduzierten Nutzbakterium Bacillus subtilis untersucht. Dabei fiel auf, dass die peripheren Wurzelteile auch bei einfacher Saatgutbehandlung in keinem Fall die am geringsten besiedelten Teile der Wurzel waren. Im Mittel wurden die höchsten Keimzahlen sogar im Bereich der Wurzelspitzen ermittelt, die jene an Wurzelmittel- und –oberteil teilweise signifikant überstiegen. Für diese Tatsache können mehrere Faktoren eine Rolle spielen, wie sie für den Besiedlungsprozess der Pflanzenwurzel auch im Allgemeinen von Bedeutung sind:

  1. Verteilung durch Sickerwasser. Durch das tägliche Gießen gelangen auf passive Weise ständig Keime von Bacillus subtilis aus den oberen Schichten des Substrats sowie aus den oberen Wurzelbereichen nach unten, also auch an die peripheren Wurzelteile. Die passive Verteilung von Mikroorganismen entlang der Wurzel durch Sickerwasser ist mehrfach belegt (Chao et al. 1986, Parke et al. 1986, Bowen 1991). Dabei hielten Parke et al. (1986) diesen Mechanismus für die Verteilung der Bakterien in tiefere Bodenschichten für entscheidender als das Mitwachsen mit der Pflanzenwurzel. Der Effekt von Sickerwasser auf die vertikale Ausbreitung der Bakterien ist zwar für die Wurzelbesiedlung eingebrachter PGPR nicht zwingend erforderlich (Bahme & Schroth 1987, Howie et al. 1987, Bull et al. 1991), kann aber eine entscheidende Rolle bei deren Transport über lange Distanzen spielen (Liddell & Parke 1989). In Quarzsand der verwendeten Korngrößenklasse ist auf Grund der grobporigen Struktur mit einer raschen Abwärtsbewegung des Gießwassers zu rechnen und damit einer raschen Verteilung von Bacillus subtilis-Keimen auch in den unteren Teilen des Versuchsgefäßes.
  2. Mitwachsen mit der Pflanzenwurzel. Durch die wachsende Wurzel werden Bakterienkeime, die sich an ihr befinden, auch in tiefere Schichten befördert (Howie et al. 1987, Bowen 1991).
  3. Höhere Vermehrungsrate an der Wurzelspitze. Die Wurzelspitzen sind die physiologisch aktiven Teile der Wurzel, geben also auch bevorzugt Wurzelexsudate ab (Kilian et al. 2000), die gerade in einem solchen Substrat wie Quarzsand die nahezu einzige Lebensgrundlage für Bacillus subtilis darstellen. Daher können sich die Bakterien vorzugsweise im Bereich der Wurzelspitzen gut vermehren, sodass in diesem Bereich auch die größte Besiedlungsdichte festzustellen war. Die Beeinflussung des Besiedlungsverhaltens durch Wurzelexsudate ist dabei kein einseitiger Prozess. Es ist bekannt, dass Rhizosphärebakterien durch Produktion von Phytohormonen, Vitaminen, Toxinen, Enzymen und anderen Verbindungen oder durch Veränderung der Nährstoffverfügbarkeit die Freisetzung von Wurzelexsudaten durch die Pflanze um mehr als 100 % erhöhen können (Kluepfel 1993).
  4. Motilität. Außer einer erhöhten Vermehrungsrate an der Wurzel kommt auch eine Eigenbewegung der Bakterienzellen im Bodenwasser in Richtung der physiologisch aktiven Wurzelspitze in Betracht. Da die Besiedlung von Kartoffelwurzeln durch [Seite 126↓]einen Pseudomonas fluorescens-Stamm, der keine funktionsfähigen Geißeln ausbilden konnte, beeinträchtigt war, hielten Schippers et al. (1987) die Motilität für einen essenziellen Faktor im Prozess der Wurzelbesiedlung durch fluoreszierende Pseudomonaden. Bowen & Rovira (1976) sahen Geißeln jedoch nicht für bedeutungsvoll für die bakterielle Eigenbewegung im Boden an. Schulz & Wolf (2001) beobachteten beim Einsatz von Pseudomonaden-Mutanten mit reduzierter in vitro Motilität sogar eine verstärkte Wurzelbesiedlung ad planta.
  5. Chemotaxis, also durch chemische Reize in ihrer Richtung beeinflusste freie Ortsbewegung von Organismen. Als Reizquelle dürften bei der Wurzelbesiedlung durch introduzierte Bakterien im Wesentlichen bestimmte Bestandteile von Wurzelexsudaten in Frage kommen, die im Bereich der Wurzelspitze in besonderem Maß produziert werden. Scher et al. (1985) betrachteten Chemotaxis als den ersten Schritt der Besiedlung von Samen und Wurzeln der Sojabohne durch Bakterien.

McKnight & Rosall (1991) untersuchten zwar nicht die Besiedlung einzelner Wurzelabschnitte durch Bacillus subtilis, stellten aber fest, dass die gesamte Wurzel 10 Tage alter Baumwollsämlinge über die gesamte Länge, auch im peripheren Bereich, mit den Bakterien besiedelt war. Albrecht (1995) beobachtete nach Saatgutbehandlung mit Bacillus subtilis zunächst eine verstärkte Besiedlung der oberen und mittleren Wurzelteile von Radieschenpflanzen gegenüber der Wurzelspitze. Am Ende des Versuchszeitraumes von 31 Tagen waren diese Unterschiede jedoch nicht mehr vorhanden. Bei Bacillus spp. deuten Versuchsergebnisse – auch die eigenen – darauf hin, dass sie die Pflanzenwurzel innerhalb kurzer Zeit recht gleichmäßig besiedeln können. Bochow (1994) nennt die Wurzelspitze als bevorzugten Besiedlungsort von Bacillus subtilis. Im Gegensatz dazu wird bei Pseudomonas-Arten zwar ebenfalls von einer Besiedlung der gesamten Wurzel berichtet (Weller 1983), vielfach wurden hier aber die größten Keimzahlen im oberen Wurzelbereich, also in der Nähe des Samens, ermittelt (Weller 1986, Bahme & Schroth 1987, Ryder & Borrett 1991, Leeman et al. 1995, Schmidt et al. 2000b). Chet et al. (1991) fanden bei Serratia marcescens im Rhizosphärenbereich die größte Populationsdichte im basalen Teil der Wurzeln, die in Richtung der Wurzelspitze zwar abnahm, an der Spitze selbst jedoch wieder anstieg. Hozore & Alexander (1991) sehen in der Mobilität von Bakterien entlang der Wurzel ein entscheidendes Kriterium für ihre Fähigkeit zur erfolgreichen Rhizosphärenbesiedlung. Weller (1988) definiert Bakterien als „Wurzelbesiedler“, [Seite 127↓]wenn sie sich nach Einbringung entlang der Pflanzenwurzel in natürlichem Boden ausbreiten, vermehren und über mehrere Wochen hinweg in Gegenwart der autochthonen Mikroflora im Boden überleben können. Anhand der vorliegenden Ergebnisse wurden für Bacillus subtilis diese Eigenschaften nachgewiesen, sodass hier von einem guten Wurzelbesiedler gesprochen werden kann. Die unterschiedlichen, sich teilweise widersprechenden Aussagen zur räumlichen Verteilung von Rhizosphärebakterien an der Pflanzenwurzel in der Literatur und die Gegenüberstellung mit den eigenen Ergebnissen machen deutlich, dass es in dieser Hinsicht offenbar art- und stammspezifische Unterschiede gibt und dass die beispielsweise für Pseudomonas spp. dargestellten Erkenntnisse nicht auf Bacillus subtilis übertragbar sind. Allerdings fanden auch Liu & Sinclair (1993) bei introduzierten Bacillus megaterium an den Wurzeln von Sojabohnen abnehmende Keimzahlen in Richtung Wurzelspitze. Die Ursachen für die Differenzen zu den eigenen Versuchsergebnissen sind offenbar in der Methodik zu suchen. Zwar sind die Wurzelspitzen bevorzugte Besiedlungsorte von Bacillus subtilis, jedoch ist andererseits dessen Etablierung in oberen, gut durchlüfteten Bodenschichten wegen seines Sauerstoffbedarfs am besten (Bochow 1989, Freier et al., 1990a). Im grobporigen Quarzsand und bei der geringen Tiefe der Versuchsgefäße war überall in den Gefäßen eine gute Belüftung gewährleistet. Dem passiven Transport der Bakterien, etwa durch Sickerwasser, wird generell sehr große Bedeutung beigemessen, da dieser die Besiedlung der peripheren Wurzelteile erleichterte.

Einfluss des Trägerstoffs

Die in den beschriebenen drei Versuchen von Versuchsserie 2 festgestellte Abhängigkeit der Populationsdichte des untersuchten Nutzbakteriums im Rhizosphärenbereich von Temperatur sowie Behandlungsmodus bestätigen die gewonnenen Erkenntnisse aus der ersten Versuchsserie. Es zeigte sich zudem, dass der zur Herstellung des Bacillus subtilis-Granulats verwendete Trägerstoff (Sand, Kaliumnitrat oder Maisstärke) keinen entscheidenden Einfluss auf das Besiedlungsverhalten des Bakteriums hat. Es ist jedoch bekannt, dass unterschiedliche Formulierungen die Überlebensfähigkeit und antifungale Leistung introduzierter Bakterien beeinflussen können (Gasoni et al. 1998). Xi et al. (1996) beobachteten eine bessere Wurzelbesiedlung von fluoreszierenden Pseudomonaden bei Applikation in Torf-Formulierung im Vergleich zu einer Formulierung als Granulat. Im Zusammenhang mit der Formulierung wird von Freier et al. (1990a) ein hoher [Seite 128↓]Versporungsgrad von Bacillus subtilis in der Kulturlösung als günstig angesehen, um hohe Überlebensraten der Bakterien im Boden zu erreichen. Da für die eigenen Versuche ausschließlich Granulat-Formulierungen mit 100 % versporten Zellen verwendet wurden und angesetzte Sporensuspensionen sofort für die entsprechenden Behandlungen verwendet wurden, ist damit von guten Voraussetzungen für die Etablierung der verwendeten Bacillus subtilis-Isolate im Substrat auszugehen.

Einfluss phytopathogener Pilze

Es ist wahrscheinlich, dass die geringere Ausgangsbesiedlung durch die etwas geringere Zahl am Saatgut anhaftender Bacillus subtilis-Keime in Versuchsserie 2 Hauptgrund für die Unterschiede in der Populationsdichte zwischen Versuchsserie 1 (ohne Pathogen) und Versuchsserie 2 (mit Phoma pinodella) ist. Der Einfluss der Anwesenheit von Phoma pinodella auf die Besiedlungsdichte von Bacillus subtilis wird als gering eingeschätzt. In Feldboden (Versuchsserie 3) wurde die Keimzahl des Nutzbakteriums an den Pflanzenwurzeln durch das Vorhandensein von Phoma pinodella nicht negativ beeinflusst. Hier wurden bei Anwesenheit des Pathogens mehrfach sogar etwas höhere Besiedlungsdichten des Bakteriums an den Pflanzenwurzeln ermittelt. Eine ähnliche Feststellung machte Weller (1983) mit einem Pseudomonas fluorescens-Stamm zur Unterdrückung von Gaeumannomyces graminis var. tritici. Auch Liu & Sinclair (1988) sowie Liu & Sinclair (1992) stellten bei Befall mit Rhizoctonia solani keine Verminderung der Besiedlungsdichte des zuvor introduzierten Bacillus megaterium-Stammes in der Rhizosphäre von Sojabohnen fest. Hwang & Chakravarty (1992) beobachteten ebenfalls keine Reduktion der Populationsdichten von Bacillus subtilis durch zwei inokulierte Rhizoctonia solani-Isolate. Andererseits ist bekannt, dass der krankheitsunterdrückende Effekt des Bakteriums auch auf eine Reduktion der Population des Pathogens zurückzuführen ist (Hwang & Chakravarty (1992).

Einfluss des Bacillus subtilis -Stammes

Einzelne Stämme des Nutzbakteriums Bacillus subtilis können sich populationsdynamisch unterschiedlich verhalten (Reddy & Rahe 1989b, Bochow 1994, Malies 1995). Unterschiede zwischen einzelnen Isolaten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, sich in stabilen Populationen in der Rhizosphäre zu erhalten, sind auch von fluoreszierenden Pseudomonaden bekannt (Loper et al. 1985). Die Bacillus subtilis-Stämme FZB24® bzw. FZB47 und FZB27 zeigten in den Versuchsserien 1 und 2 ein [Seite 129↓]sehr ähnliches Besiedlungsverhalten, wobei nach den vorliegenden Ergebnissen die Vermehrungsrate von FZB27 als etwas geringer eingeschätzt wird. Ab Versuchsserie 2 wurde an Stelle von FZB24® der Stamm FZB47 verwendet, der eine Streptomycin-resistente Mutante von FZB24® darstellt. Obwohl das populationsdynamische Verhalten der beiden Bacillus subtilis-Isolate als ähnlich angesehen wird, gab es Hinweise auf ein etwas langsameres Wachstum von FZB47. Das Problem der Verwendung ähnlich markierter Bakterienstämme für populationsdynamische Untersuchungen greifen McKnight & Rosall (1991) auf. Sie arbeiteten mit einem Rifampicin-resistenten Bacillus subtilis-Stamm. Obwohl die Autoren ein ähnliches Wachstum wie beim Ausgangsstamm beobachteten, sind sie der Meinung, dass die Veränderungen im Genotyp die Aussagekraft solcher Versuche zur Wurzelkolonisierung mit Antibiotika-resistenten Stämmen einschränken. Dass es Unterschiede zum Ausgangsstamm gab, äußerte sich auch in einem rascheren Nachlassen der Aktivität der Rifampicin-resistenten Mutante gegen Rhizoctonia solani. Die Autoren halten daher eine Markierung von Bacillus subtilis für populationsdynamische Untersuchungen mit Lux-Genen für geeigneter, da sie hier mit keinen das Besiedlungsverhalten beeinflussenden phänotypischen Veränderungen rechnen. Eine Verwendung von solcher Art markierten Isolaten war im Rahmen der eigenen Arbeit leider nicht möglich.

Einfluss des Substrates

Beim Vergleich der in Feldboden erhaltenen Resultate über das Besiedlungsverhalten von Bacillus subtilis mit den in Quarzsand gewonnenen Erkenntnissen fiel zunächst auf, dass die an den Pflanzenwurzeln ermittelten Keimzahlen des Bakteriums in Feldboden deutlich niedriger lagen als in Quarzsand. Dieses Ergebnis war zu erwarten und korreliert mit den Feststellungen von Bahme & Schroth (1987), die von introduziertem Pseudomonas fluorescens in leichtem Boden (sandiger Lehm) etwa eine Zehnerpotenz mehr Keime wiederfanden als in schwererem Boden (schluffiger Ton-Lehm). Brückner (1998) geht von einem geringen Einfluss unterschiedlicher Bodenarten auf die Populationsdichte von Rhizosphärebakterien aus, allerdings dürften die Eigenschaften der von ihm verwendeten Substrate (sL, lS und l‘‘S) auch nicht so weit auseinander liegen wie die von Quarzsand und Feldboden.

Die Gründe für den starken Einfluss des verwendeten Substrates auf die Populationsdichte von Bacillus subtilis werden in Folgendem gesehen:

  1. Der Feldboden, vermischt mit Einheitserde Typ Null, ist biologisch aktiver als Quarzsand. Das bedeutet, die introduzierten Bakterien sind einem wesentlich stärkeren Konkurrenzdruck ausgesetzt und können sich nicht so ungehindert entwickeln wie in Quarzsand. Von mehreren Autoren wird die Konkurrenz der autochthonen Mikroflora als entscheidender Einflussfaktor auf die Populationsdynamik introduzierter PGPR gesehen (Hirte 1977, Heynen et al. 1988, Bochow 1994, Bochow & Gantcheva 1995). Bei populationsdynamischen Studien an Rhizobium leguminosarum stellten Postma & van Veen (1991) eine signifikante Reduktion der Population bei Anwesenheit anderer Bakterien und Flagellaten im Vergleich zu sterilisierten Boden fest und ermittelten die geringsten Besiedlungsdichten in natürlichem Boden.
  2. Der grob gesiebte Feldboden weist eine geringere Porengröße und damit ein größeres Matrixpotenzial auf als Quarzsand. Daher ist die Durchlüftung des Substrates nicht in der Weise gewährleistet wie im Quarzsand. Viele Poren sind durch die Kapillarität mit Wasser gefüllt und damit ist der Sauerstoffvorrat im Boden geringer (Howie et al. 1987). Durch eine geringe Porengröße und schlechtere Durchlüftung wird die Entwicklung und Aktivität eines Sauerstoff liebenden Bakteriums wie Bacillus subtilis ungünstig beeinflusst (Soni & Kanwar 1989).
  3. Quarzsand ist ein Medium frei von organischer Substanz. Wie bereits diskutiert, stellen die Pflanzenwurzeln und deren Ausscheidungen (Wurzelexsudate) in einem derartigen Substrat die einzige Lebensgrundlage für die eingebrachten Bakterien dar. Die größte Attraktivität zur Besiedlung hat die Wurzel für Bakterien, die von den Wurzelexsudaten abhängig sind (Newman & Watson 1977). In dem mit Einheitserde 0 vermischten Feldboden ist auch die darin vorhandene organische Substanz eine Nahrungsquelle für Bacillus subtilis, sodass die Attraktivität der Wurzel zur Besiedlung in diesem Substrat geringer ist. Postma & van Veen (1991) kamen bei ihren Untersuchungen an Rhizobien zu ähnlichen Ergebnissen. Sie fanden heraus, dass sich die Zahl der an Bodenpartikel gebundenen Rhizobien unter wachsendem Konkurrenzdruck weniger stark reduzierte als die Gesamtpopulation und dass die Keimzahl partikelgebundener Rhizobien in nicht sterilisiertem Boden um das 10 bis 20fache gegenüber sterilisiertem Substrat anstieg.
  4. In Feldboden ist eine veränderte Zusammensetzung der Wurzelexsudate, die von der Pflanze abgegeben werden, im Vergleich zu den Bedingungen im Quarzsand [Seite 131↓]denkbar. Das könnte entsprechende Auswirkungen auf das Bakterienwachstum in der Rhizosphäre haben. So stellten Gamliel & Katan (1992) fest, dass die Zusammensetzung von Samen- und Wurzelexsudaten von Tomatenpflanzen in solarisierten Böden eine andere war als in nicht-solarisierten. In solarisierten Böden war der Anteil an Zuckern niedriger und der von Aminosäuren höher, was sich ungünstig auf das Bakterienwachstum auswirkte.
  5. Der pH-Wert des mit Einheitserde Typ Null vermischten Feldbodens lag mit 5,68 in einem für die Populationsentwicklung von Bacillus subtilis ungünstigerem Bereich im Vergleich zu Quarzsand (6,78). Reddy & Rahe (1989a) gaben neben hohen Temperaturen und hoher Bodenfeuchte auch hohe pH-Werte als günstig für das Überleben von Bacillus subtilis in der Rhizosphäre an. Ein pH-Wert von 6,5 war günstiger zu beurteilen als 4,5 und 5,5.

pH-Wert und Bodenfeuchte werden dabei zwar von Reddy & Rahe (1989a) als weniger entscheidend angesehen als die Temperatur, jedoch dürften die vier eben genannten Fakten in ihrer Summe stärkere Einflussfaktoren auf die Populationsdichte des Nutzbakteriums sein als die Temperatur. Postma & van Veen (1991) kamen zu der Erkenntnis, dass die Kombination der Zugabe von räuberischen Flagellaten und Bakterien als potenzielle Konkurrenten die Population introduzierter Rhizobien wesentlich stärker reduzierte als die Zugabe einer der beiden Organismengruppen.

Das ökologische System des mit Einheitserde Typ Null durchmischten Feldbodens ist insgesamt wesentlich komplexer als das des Quarzsandes. Die Korngröße des Bodens ist heterogener, organische Substanz ist vorhanden, der Gehalt an verfügbaren Nährstoffen, die mikrobielle Aktivität sind wesentlich höher, das Puffervermögen ist deutlich größer als in Quarzsand. Es kommen bei dem in dieser Versuchsserie verwendeten Substrat also eine ganze Reihe von Faktoren hinzu, welche die Entwicklung der eingebrachten Mikroorganismenpopulation beeinflussen. Je vielgestaltiger die ökologischen Bedingungen sind und je mehr Einflussfaktoren für das Besiedlungsverhalten des introduzierten Bakteriums von Wichtigkeit sind, desto mehr verliert der einzelne Einflussfaktor an Bedeutung. Damit ist zu erklären, weshalb selbst Temperaturdifferenzen von 10 °C in diesem Substrat nur marginale Unterschiede bei der Besiedlungsdichte von Bacillus subtilis an den Pflanzenwurzeln verursachten und der Temperatureinfluss in Feldboden eine viel geringere Bedeutung hat als in Quarzsand.


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Die Nährstoffverfügbarkeit stellt ein wichtiges Kriterium für die Zusammensetzung der autochthonen Mikroflora dar. Ihre Änderung – etwa durch Zugabe von Nährstoffen – hat Verschiebungen in der Zusammensetzung der Bodenmikroflora zur Folge, indem bestimmte Mikroorganismen gefördert, andere jedoch gehemmt werden. Utkhede & Smith (1991) fanden Hinweise darauf, dass die Anwendung von Stickstoff, allein oder in Kombination mit Phosphor, jene Mikroorganismen hemmt, die die Bodenmüdigkeit bei Apfel („Apple Replant Disease“) verursachen, bzw. deren Antagonisten fördert. Dabei ist es nicht nur von Bedeutung, welche Nährstoffe zugesetzt werden, sondern auch in welcher Form sie verabreicht werden. So erzielten Issoufou (2000) sowie Schmiedeknecht et al. (2001) in Landy-Medium oder Nährlösungen mit Nitrat-Stickstoff bessere Wachstums- und Sporulationsraten von Bacillus subtilis im Vergleich zu Nährlösungen, die nur Ammonium-Stickstoff enthielten. Für die Interpretation der eigenen Versuchsergebnisse ist diese Tatsache insofern von Bedeutung, als durch die unterschiedliche Nährstoffsituation in den verwendeten Substraten neben einer direkten Beeinflussung des Wachstums von Bacillus subtilis auch eine veränderte Konkurrenzsituation in Abhängigkeit vom Substrat zu erwarten ist, nicht nur quantitativ (ausgedrückt durch die Gesamtkeimzahl), sondern auch qualitativ (ausgedrückt durch die vorkommenden Mikroorganismenarten).

Einen stärkeren Einfluss als die Temperatur hatte bei Versuchsserie 3 die introduzierte Menge an Bacillus subtilis-Keimen. Eine höhere Ausgangsbesiedlung, die durch Erhöhung der Konzentration der applizierten Sporensuspension erreicht wurde, konnte sich wie in den Versuchen mit Quarzsand bis zum Ende der Versuche nach 30 Tagen erhalten.

Mit dem 60 Tage dauernden Langzeitversuch ließ sich nachweisen, dass die verwendeten Bacillus subtilis-Stämme FZB47 und FZB27 auch über diesen Zeitraum stabile Populationen im Feldboden bilden. Dies galt im Besonderen für FZB47, bei dem sich die Keimzahl im Substrat nach 30 und nach 60 Tagen nicht signifikant unterschied und auch tendenziell kaum eine Differenz erkennbar war. Obgleich als Begründung für diese Erkenntnis auch die Fähigkeit der Bakterien zur Bildung sehr dauerhafter Endosporen in Betracht kommt, zeigte dieser Versuch jedoch auch, dass Bacillus subtilis eine ausreichende Konkurrenzfähigkeit besitzt, um sich über einen längeren Zeitraum im Boden zu erhalten. Freier et al. (1990b) fanden bei dem Bacillus subtilis-Stamm T99 unter Praxisbedingungen einen stabilen Titer von ca. 104 cfu / g Erdsubstrat [Seite 133↓]über eine 14-monatige Versuchsdauer und interpretierten dies als Beleg für die Konkurrenzfähigeit des Bakteriums. Auch Hall & Edgar Davis (1990) konnten noch 12 und 24 Monate nach Introduktion Bacillus subtilis an Ahorn-Sämlingen nachweisen. Liu & Sinclair (1991) sowie Liu & Sinclair (1992) schreiben ihrem nahe mit Bacillus subtilis verwandten Modellorganismus Bacillus megaterium auf Grund ihrer Versuchsergebnisse eine gute Konkurrenzfähigkeit mit der autochthonen Mikroflora, eine enge Beziehung zur Kulturpflanze, die Fähigkeit zur Besiedlung von Pflanzenwurzeln und Rhizosphäre sowie eine lange Überlebensfähigkeit im Boden zu.

Populationsentwicklung innerhalb von 30 Tagen

Wichtige Erkenntnisse über die Populationsentwicklung und Aktivität der Nutzbakterien lieferten unsere Einzelversuche (s. Abschnitt 4.5), die sowohl in Quarzsand als auch in Feldboden durchgeführt wurden. Die bei dem Versuch in Quarzsand verschiedentlich festgestellte leichte Erhöhung der Populationsdichte von Bacillus subtilis in Rhizosphäre und Rhizoplane belegt, dass die Bakterien sich im Wurzelbereich nach ihrer Einbringung etablieren und vermehren können. Die bereits fünf Tage nach der Aussaat recht hohe Populationsdichte belegt die schnelle Etablierung von Bacillus subtilis im Bereich der Pflanzenwurzel. Dass in diesem Fall die größte Besiedlungsdichte und die größte Aktivität im Bereich der Rhizoplane gefunden wurden, kann als Beweis für die enge Beziehung der Bakterien mit der Pflanzenwurzel gelten.

Diese wurde auch durch einen Vorversuch belegt, bei dem unter weitgehend sterilen Bedingungen mit Bacillus subtilis behandelte Erbsenpflanzen in autoklaviertem Quarzsand angezogen wurden. Trotzdem die Erbsenwurzeln nach Versuchsende mit sterilem Wasser abgespült wurden, waren im elektronenmikroskopischen Bild eine Vielzahl von Bacillus subtilis-Zellen auf der Wurzeloberfläche zu erkennen, die teilweise in leichten Vertiefungen saßen (Abb.29 und 30). Inwiefern sie auch in die Pflanzenwurzel eindringen können, war durch den Versuch nicht eindeutig zu klären. Jedoch fanden McInroy & Kloepper (1991) sowie Pleban et al. (1995) Vertreter der Gattung Bacillus als endophytische Bakterien in mehreren Kulturpflanzen.


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Abb.29:Elektronenmikroskopische Aufnahme von Bacillus subtilis (Pfeil) an Erbsenwurzeln (Foto: Natalja Wolff)

Abb.30:Elektronenmikroskopische Aufnahme von Bacillus subtilis an Erbsenwurzeln, weiter vergrößert (Foto: Natalja Wolff)


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Auch Schippers et al. (1991) erwähnen, dass Rhizobakterien nicht nur außen im Wurzelbereich, sondern auch im Wurzelgewebe leben können. Kim et al. (1997a) konnten den introduzierten Bacillus-Stamm L324-92R12 auch im Inneren von Weizenwurzeln nachweisen.

Während in Quarzsand die Affinität von Bacillus subtilis zur Wurzel als recht hoch einzuschätzen ist, zeigte sich im Feldboden ein anderes Bild. Hier wurde die größte Aktivität des Bakteriums im Substrat ermittelt. Während im Bereich der Rhizoplane zumeist deutlich geringere Keimzahlen gefunden wurden als in Quarzsand, wurden im Substrat häufig sogar höhere Werte festgestellt. Für dieses Phänomen wird in erster Linie der Gehalt an organischer Substanz im Feldboden verantwortlich gemacht, der durch das Einmischen der auf Torf basierenden Einheitserde Typ Null noch deutlich erhöht worden war. Außerdem könnte der im Vergleich zum Quarzsand höhere Nährstoffgehalt im Feldboden eine Rolle gespielt haben. So kann Bacillus subtilis im Feldboden auch von abgestorbener organischer Substanz leben, während in Quarzsand die Wurzelexsudate der Pflanzen die nahezu einzige Lebensgrundlage für die Bakterien darstellen. Ein weiterer Punkt, der zu berücksichtigen ist, ist die mikrobielle Konkurrenz. Diese ist in dem biologisch wenig aktiven Quarzsand nur spärlich vorhanden. Gleich zu Versuchsbeginn in großer Menge appliziert, hat Bacillus subtilis hier beste Chancen, sich als Erstbesiedler auf Samen und Keimwurzel zu etablieren. Beim Feldboden gelangt das Nutzbakterium bereits in ein biologisch wesentlich aktiveres und ökologisch diverseres Substrat und ist von Anfang an dem Konkurrenzdruck von vielen Mikroorganismen ausgesetzt. Es ist bekannt, das Bacillus subtilis kein ausschließlicher Rhizosphärenbesiedler ist. Zudem wurden die in diesen Versuchen verwendeten Stämme dieses Nutzbakteriums aus der Bodenmikroflora isoliert (Freier et al. 1990a). Die Autoren ermittelten im Wurzelbereich Keimzahlen von Bacillus subtilis T99, die etwas mehr als eine Zehnerpotenz über denen im Boden lagen. Dieser Wert wurde durch unsere Einzelversuche zur Populations- und Aktivitätsdynamik in Feldboden annähernd bestätigt. In Quarzsand betrug diese Differenz bei alleiniger Saatgutbehandlung zu Versuchsbeginn bis zu drei Zehnerpotenzen, überstieg ansonsten aber kaum eine Zehnerpotenz. Chao et al. (1986) sprechen bei fluoreszierenden Pseudomonaden dagegen von Unterschieden zwischen zwei und drei Zehnerpotenzen zwischen Rhizosphärenbereich und Boden. Kim et al. (1997a) verglichen die Wurzelbesiedlung von Winterweizen durch Bacillus sp. L324-[Seite 136↓]92R12 und Pseudomonas fluorescens 2-79RN10. Sie ermittelten dabei unter Feldbedingungen Populationsdichten des Pseudomonas-Isolats, die mindestens zehnmal höher lagen als die des Bacillus-Stammes. Diese Erkenntnis steht in Einklang mit den oben genannten Aussagen und weist fluoreszierende Pseudomonaden als bessere Rhizosphärenbesiedler aus.

Das im Vergleich zum Quarzsand wesentlich komplexere und damit auch stabilere ökologische System des Feldbodens, insbesondere die Konkurrenz durch die autochthone Mikroflora, bewirkten den leichten Rückgang der Populationsdichte von Bacillus subtilis zum Versuchsende im Feldboden. Dennoch ist zu bemerken, dass dieser im Verlauf des Untersuchungszeitraumes von 30 Tagen unbeträchtlich war. Klare Tendenzen waren kaum ablesbar. Das bedeutet, dass sich die eingebrachte Bakterienpopulation auch in natürlichem Boden über einen relativ langen Zeitraum mit beträchtlicher Keimzahl erhalten kann. Reddy & Rahe (1989a) berichten zwar über einen schnellen Abfall der Populationsdichte von über Saatgutbehandlung eingebrachtem Bacillus subtilis im Wurzelraum von Zwiebelsämlingen, stellten andererseits jedoch trotzdem eine Persistenz der Bakterien über den gesamten Versuchszeitraum (14 Wochen) fest. Gründe für die rasche Abnahme der Besiedlungsdichte der Bakterien könnten außer in der Spezifität der verwendeten Isolate auch in der Konkurrenz durch die autochthone Mikroflora zu suchen sein, da die Autoren in sehr biologisch aktivem Substrat arbeiteten.

Kluepfel (1993) vermutete, dass Pseudomonas-Arten auf Grund ihrer starken Bindung an Wurzelexsudate und daher großen Affinität zur Wurzel eine besondere Rhizosphären-Kompetenz besitzen, wohingegen andere, weniger spezialisierte und weniger an die Wurzel gebundene Bakterien stärker durch biotische Faktoren wie Konkurrenz und Antagonismus beeinflusst werden. Daher sei die Entwicklung ihrer Populationsdichte schlechter voraussagbar. Obwohl die dargestellten Versuche mit einer Dauer von 30, maximal 60 Tagen, nur über einen vergleichsweise kurzen Zeitabschnitt Auskunft geben, lässt sich sagen, dass Populationen von Bacillus subtilis unter den gegebenen Versuchsbedingungen wesentlich träger reagieren als die von fluoreszierenden Pseudomonaden. Bei den verwendeten Bacillus subtilis-Isolaten war während der Versuchsdauer weder ein schneller Anstieg noch ein rascher Abfall der Besiedlungsdichte um mehrere Zehnerpotenzen zu beobachten, wie mehrfach von Pseudomonas-Arten berichtet wird (Kloepper et al. 1992, Kluepfel 1993). Als [Seite 137↓]Ursache wird der ermittelte hohe Versporungsgrad an Wurzeln und im Substrat angesehen. Dies ist einerseits von Nachteil, da der Anteil vegetativer, stoffwechselaktiver Zellen deutlich geringer ist, als die ermittelten Keimzahlen vermuten lassen, andererseits aber auch von Vorteil, weil sich die Bacillus subtilis-Population über einen längeren Zeitraum über dem natürlichen Niveau erhalten kann und damit in besonderem Maße mit einer nachhaltigen Wirkung zu rechnen ist.

Einfluss auf die autochthone Mikroflora

Die Introduktion großer Populationen von Bakterien kann zumindest temporär die autochthone Mikroflora beeinflussen (Kluepfel 1993). Kloepper & Schroth (1981) beobachteten nach Applikation von Antibiotika produzierenden, fluoreszierenden Pseudomonaden ein Absinken der Vermehrungsrate von in der Rhizosphäre lebenden Pilzen und gram-negativen Bakterien. In den eigenen Versuchen ist der Einfluss der Bacillus subtilis-Behandlungen auf die Gesamtkeimzahlen an den peripheren Wurzelbereichen sowie im Substrat jedoch als gering anzusehen. Lediglich in Quarzsand wurde 5 Tage nach der Aussaat eine signifikant höhere Gesamtkeimzahl in den mit dem Nutzbakterium behandelten Varianten festgestellt, aber auch nur dann, wenn Bacillus subtilis als Substratbehandlung appliziert worden war. Bereits nach 10 Tagen waren diese Unterschiede nicht mehr zu beobachten. Die Feststellung von Reddy & Rahe (1989b), die eine signifikante Reduzierung der autochthonen Mikroflora durch über Saatgutbehandlung eingebrachten Bacillus subtilis beobachteten, ließ sich also nicht bestätigen. Die Gesamtkeimzahlen in beiden Substraten lagen im Wurzelbereich etwa zwei bis drei Zehnerpotenzen über den im Substrat selbst ermittelten Werten. Das entspricht der Größenordnung, die Chao et al. (1986) bei fluoreszierenden Pseudomonaden fanden (s.o.). Bei Bacillus subtilis betrug diese Differenz zumeist nur eine Zehnerpotenz. In Feldboden wurden für die Gesamtkeimzahlen in der Rhizosphäre und im Substrat im Durchschnitt um etwa eine Zehnerpotenz höhere Werte ermittelt als in Quarzsand, was die zahlreicher vorhandene Mikroflora und damit den für Bacillus subtilis höheren Konkurrenzdruck in Feldboden belegt. Bei vor den Versuchen festgestellten Gesamtkeimzahlen im trockenen Substrat ergaben sich zwischen Quarzsand (log cfu 4,40) und Feldboden (log cfu 6,59) sogar Unterschiede von mehr als zwei Zehnerpotenzen, die sich im Verlauf des unter Einfluss der Temperatur und vor allem der für das Pflanzenwachstum notwendigen Feuchtigkeit verringerten. Bemerkenswert ist der rasche Anstieg der Gesamtkeimzahlen unmittelbar [Seite 138↓]nach Versuchsbeginn. Bereits nach 5 Tagen Versuchsdauer kam es auch in der unbehandelten Kontrolle in beiden Substraten zu einer Erhöhung der Gesamtkeimzahl um mehr als eine Zehnerpotenz.

Kombinierte Anwendung mit einem Neem-Präparat

Eine der entscheidenden Fragestellungen der unter Punkt 4.6 beschriebenen Komplexversuche war, inwiefern durch kombinierte Anwendung von Bacillus subtilis mit einem Bio-Fungizid auf Neem-Basis synergistische Effekte erzielt werden können. Es ist bekannt, dass die Zugabe bestimmter Stoffe die Boden-Mikroflora qualitativ und quantitativ beeinflussen kann und dass damit antagonistische Bakterien gegen diverse pilzliche Krankheitserreger gezielt gefördert werden können (Canullo et al. 1992). In Vorbereitung der Komplexversuche war zunächst von Interesse, ob durch Zusatz des Neem-Präparates Rakshak Gold das Nutzbakterium gefördert wird und sich diese Förderung in Besiedlungsdichte und Aktivität niederschlägt. Nach Aussagen von Jeyarajan et al. (1986) geht der antifungale Effekt des Zusatzes von Neem-Extrakten zum Boden in erster Linie auf die Förderung der antagonistischen Mikroflora zurück. Obwohl antibakterielle Effekte von Neem-Extrakten bekannt sind (Eppler 1994, Coventry & Allan 1997, Hulloli et al. 1998), hatten sich in vorangegangenen in vitro-Tests Hinweise auf positive Effekte bestimmter Konzentrationen von Rakshak Gold auf das Wachstum von Bacillus subtilis-Kolonien ergeben (Zimmer et al. 1999a). Auch andere Autoren berichten von z.T. positiven Effekten von Fungiziden auf Populationen nützlicher Bakterien. Siddiqi & Alexander (1991) beispielsweise stellten eine Vergrößerung der Population von Rhizobien an Leguminosen (Sojabohne und Luzerne) fest, wenn zuvor eine Saatgutbehandlung mit dem Fungizid Aliette erfolgte. Als Ursache dafür kommt in erster Linie die Unterdrückung potenzieller mikrobieller, vor allem pilzlicher Konkurrenz für die Bakterien in Betracht. Zu ähnlichen Erkenntnissen kamen Mahaffee & Backman (1993) bei Kombination von Bacillus subtilis mit den fungiziden Wirkstoffen Metalaxyl / PCNB an Baumwolle.

Obgleich die Reisolation von behandeltem Erbsensaatgut bei einem der Versuche eine signifikant höhere Zahl an den Samen anhaftender FZB47-Keime bei Zusatz des Neem-Präparates ergab, kann nicht generell von einem fördernden Effekt von Rakshak Gold auf Bacillus subtilis gesprochen werden, da bei den anderen beiden Komplexversuchen diese Tatsache nicht zutage trat. Eine Förderung der Zellteilung der Bakterien durch das Bio-Fungizid ist beim Ansatz der Versuche nicht auszumachen, da in der frisch [Seite 139↓]angesetzten Bakteriensuspension, die zur Saatgutbehandlung verwendet wurde, noch sämtliche Zellen versport vorlagen. Die Ergebnisse der Komplexversuche zeigen insgesamt, dass eine kombinierte Applikation mit dem Neem-Präparat zu keiner Erhöhung der Populationsdichte von Bacillus subtilis führte – weder im Substrat noch im Bereich von Rhizosphäre oder Rhizoplane. Damit wurden die Ergebnisse der in vitro-Tests in vivo nicht bestätigt. Der wichtigste Grund für diese Tatsache ist darin zu sehen, dass in vivo wesentlich mehr Faktoren die Entwicklung der Nutzbakterien bestimmen – in erster Linie die mikrobielle Konkurrenz an der Wurzel und im unsterilen Substrat, aber auch abiotische Faktoren. Durch sie wird die Populationsdichte von Bacillus subtilis offenbar stärker beeinflusst als durch das Neem-Präparat. Zudem wurde in vitro die fördernde Wirkung bestimmter Konzentrationen von Rakshak Gold auf die Bakterien ausschließlich anhand der Koloniegröße ermittelt. Eine größere Kolonie lässt jedoch nicht zwangsläufig auf eine höhere Keimzahl schließen. Bei Feldboden und Aussaaterde handelt es sich um Medien, die sich in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften stark vom in vitro verwendeten Nährmedium unterscheiden. Die Puffereigenschaften der Substrate ließen offenbar die fördenden Effekte von Rakshak Gold auf FZB47 nicht zum Tragen kommen. Als weiterer Faktor kommt hinzu, dass bei den in vitro-Versuchen nur eine geringe Anzahl von Organismen beteiligt waren – Bacillus subtilis, Phoma pinodella und Rhizoctonia solani. Im Gegensatz dazu war bei den Versuchen im Substrat eine Vielzahl weiterer Organismen involviert: die autochthone Mikroflora im Boden und im Wurzelbereich der Pflanzen. Die genannten Faktoren übten einen größeren Einfluss auf das Wachstum von Bacillus subtilis aus als die Zugabe des Neem-Präparates.

Durch die phytopathogenen Pilze Phoma pinodella und Rhizoctonia solani wurde die Populationsdichte von Bacillus subtilis in den Komplexversuchen kaum beeinflusst, was die Ergebnisse aus unseren Versuchsserien 2 und 3 bestätigt. Lediglich bei den Gewächshausversuchen in Feldboden und Aussaaterde kam es im Bereich der Rhizosphäre und – sofern ermittelt – teilweise auch der Rhizoplane zu niedrigeren Keimzahlen des Nutzbakteriums im Vergleich zur Variante ohne Pathogen. Ursache hierfür könnte der durch die Pilze höhere Konkurrenzdruck für Bacillus subtilis im Wurzelbereich sein. Demgegenüber steht eine teilweise höhere Populationsdichte der Bakterien im Substrat bei den mit Phoma pinodella / Rhizoctonia solani inokulierten Varianten. Hinsichtlich der Gesamtkeimzahlen in Rhizosphäre und Substrat wurde bei [Seite 140↓]allen drei Komplexversuchen keine entscheidende Beeinflussung durch den Zusatz der phytopathogenen Pilze und Rakshak Gold festgestellt. Die im Vergleich zum Substrat um durchschnittlich zwei Zehnerpotenzen höheren Gesamtkeimzahlen an der Wurzel und im wurzelnahen Bereich (Rhizosphäre) zeigen die enge Bindung vieler Mikroorganismen an die Pflanzenwurzel und die deutlich höhere mikrobielle Aktivität im wurzelnahen Bereich. In Aussaaterde war bereits im Vorfeld der Versuche eine signifikant höhere Gesamtkeimzahl ermittelt worden als in Feldboden. Als Ursache dafür werden die grobere Struktur und damit bessere Luftzirkulation in Aussaaterde sowie der höhere Gehalt an organischer Substanz gesehen. Die vor den Versuchen ermittelten Gesamtkeimzahlen waren bei beiden Substrattypen grundsätzlich und fast immer auch signifikant geringer als die Werte nach 30 Tagen Versuchsdauer. Dies bedeutet, dass durch das Einbringen der Pflanzen und der Mikroorganismen die mikrobielle Aktivität des jeweiligen Substrates deutlich erhöht wurde.

Allgemeine Aktivität von Bacillus subtilis

Nur dann, wenn die introduzierten Bakteriensporen vegetative, stoffwechselaktive Zellen hervorbringen, können entsprechende antifungale und phytoeffekive Wirkungen erwartet werden (Krebs et al. 1998). Die Aktivität von Bacillus subtilis wurde ausgedrückt durch den Versporungsgrad, der mit einer Wärmebehandlung ermittelt wurde. Albrecht (1995) konnte mit dieser Methode keine verwertbaren Ergebnisse erzielen, die eigenen Vorversuche dazu lieferten jedoch realistisch erscheinende Resultate. Dennoch ist die Interpretation des Einflusses verschiedener Faktoren auf die Aktivität von Bacillus subtilis schwierig. Das Verhältnis von aktiven zu versporten Zellen ist als Momentaufnahme zu verstehen. Es unterliegt ständiger Veränderung.

Aus den Ergebnissen der Einzelversuche zur Populations- und Aktivitätsdynamik geht hervor, dass in Feldboden der Versporungsgrad von Bacillus subtilis geringer war als in Quarzsand, das heißt die Aktivität war höher. Zudem hatte sich auch der phytopathogene Pilz gegen die natürlich vorhandene mikrobielle Konkurrenz zu behaupten. Beide Fakten erklären den besseren Pathogen unterdrückenden Effekt des Nutzbakteriums in Feldboden (s. Versuchsserie 3). Hervorzuheben ist außerdem die Rolle des pH-Wertes im Substrat. Mahaffee & Backman (1993) ermittelten eine schlechtere Wurzelbesiedlung durch Bacillus subtilis an Baumwollpflanzen, wenn deren Samen säurebehandelt, aber nicht neutralisiert waren im Vergleich zu Pflanzen aus neutralisierten Samen. Sie fanden geringere Versporungsgrade in der Spermosphäre [Seite 141↓]neutralisierter Samen und folgerten daraus, dass die niedrigeren pH-Werte in der Spermosphäre nicht neutralisierter Samen die Sporenkeimung von Bacillus subtilis hemmen. Der geringere Anteil aktiver Zellen führte entsprechend zu einer schlechteren Wurzelkolonisierung. Die Autoren beziehen sich auf Arbeiten mit Bacillus thuringiensis, dessen optimaler Boden-pH für die Sporenkeimung mit 7,0 angegeben wird, während bei pH 5,0 keine Sporenkeimung mehr erfolgt. West et al. (1985) kamen zu ähnlichen Ergebnissen bei Untersuchungen an Bacillus thuringiensis und Bacillus cereus. Sofern von einer Übertragbarkeit dieser Ergebnisse auf Bacillus subtilis ausgegangen werden kann, wäre der pH-Wert in Quarzsand (6,78) für die Aktivität der Bakterien günstiger zu beurteilen als der in Feldboden (5,68) und in Aussaaterde (5,60). Allerdings wird im konkreten Fall die Verfügbarkeit von Nährstoffen für die Bakterien als bedeutenderer Einflussfaktor auf deren Aktivität gesehen als der pH-Wert des Bodens. Schmidt et al. (2002) berichten, dass die Population von eingebrachtem Bacillus subtilis an Zuckerrübenwurzeln größtenteils aus Sporen bestand und durch Bodenmatrixpotenzial und Temperatur nicht wesentlich beeinflusst wurde. Sie konnten keine signifikante Reduktion der durch Pythium ultimum hervorgerufenen Umfallkrankheit feststellen. Auch bei den eigenen aktivitätsdynamischen Untersuchungen wurden sowohl in Quarzsand als auch in Feldboden im Wurzelbereich und im Substrat fast immer Versporungsgrade von mehr als 50 % festgestellt.

Die bei kombinierter Anwendung mit einem Neem-Präparat erkennbare Tendenz, dass die Aktivität der introduzierten Bakterien im Substrat größer war als im Bereich von Rhizosphäre und Rhizoplane, besonders deutlich bei den Versuchen in Aussaaterde, zeigt, dass Bacillus subtilis in nährstoffreicheren Substraten gut von der organischen Substanz leben kann, ohne auf die Wurzelexsudate der Kulturpflanze angewiesen zu sein. Der im wurzelnahen Bereich herrschende Konkurrenzdruck durch andere Mikroorganismen mit stärkerer Affinität zur Wurzel ist offenbar eine wesentliche Ursache für den höheren Versporungsgrad der eingebrachten Bakterien in diesem Umfeld. Diese Aussage wird dadurch gestützt, dass die ermittelten Gesamtkeimzahlen in der Rhizosphäre ca. zwei Zehnerpotenzen höher lagen als im Substrat, während sich die Besiedlungsdichte von Bacillus subtilis in Rhizosphäre und Substrat kaum unterschied. Praxiserfahrungen mit dem Nutzbakterium haben gezeigt, dass dessen positive Effekte auf die Kulturpflanzen hinsichtlich phytoeffektiver Wirksamkeit und Pathogen unterdrückender Wirkung bei leichten Böden und solchen Böden, die keine [Seite 142↓]optimalen Bedingungen für die Pflanzen boten, am größten waren. Neben der besseren Durchlüftung von leichten Böden und den damit allgemein besseren Bedingungen für das aerobe Nutzbakterium kommen der geringere Nährstoffgehalt bei ärmeren Böden und die damit stärkere Bindung von Bacillus subtilis an die Pflanzenwurzel sowie die geringere mikrobielle Konkurrenz und eine damit verbundene höhere Aktivität der Bakterien als entscheidende Ursache für diese Feststellung in Betracht.

Phytoeffektive Leistung von Bacillus subtilis

Einfluss auf das Auflaufverhalten der Testpflanzen

In allen Versuchsserien wurde das Auflaufverhalten der Erbsenpflanzen durch Bakterisierung mit Bacillus subtilis nicht beeinflusst – weder hinsichtlich Auflaufrate noch im Hinblick auf den Zeitpunkt des Auflaufens. Bei niedrigen Versuchstemperaturen von 10 °C oder 15 °C hätten am ehesten Unterschiede zwischen den Varianten auftreten können, da sich hier der Auflaufprozess wesentlich langsamer vollzog als bei hohen Temperaturen. Auch Albrecht (1995) stellte nur bei Minderqualität des verwendeten Radieschensaatgutes und damit verbundener schlechter Auflaufrate eine Verbesserung des Auflaufens bei kombinierter Saatgut- und Substratbehandlung mit Bacillus subtilis fest. Kowalski (1992) konnte ebenfalls keinen Einfluss von Bacillus subtilis-Behandlungen auf die Auflaufrate von Tomatensamen erkennen. Demgegenüber berichten Tigges & Lindner (2000) von einer Auflaufförderung bei Winterweizen und Wintergerste durch Applikation dieses Nutzbakteriums.

Einfluss auf das Wachstum von Spross und Wurzel

Die Behandlungen mit Bacillus subtilis förderten in unserer Versuchsserie 1 das Wachstum der Pflanzen, insbesondere das der oberirdischen Pflanzenteile. Eine klare Beziehung von Wachstumsförderung zur introduzierten Bakterienkeimzahl ließ sich nicht finden. Meist waren selbst scheinbar deutliche Wachstumsförderungen nicht statistisch abzusichern, was mit der außerordentlich großen Streuung der Werte sowie mit der auf Grund der Platzverhältnisse im Phytotron begrenzten Anzahl der Wiederholungen zu erklären ist. Eine besondere Rolle beim Zustandekommen phytoeffektiver Leistungen durch das Nutzbakteriums spielt der Trägerstoff Kaliumnitrat. Es wurden bei alleiniger Kaliumnitratbehandlung (also ohne Bacillus subtilis) ebenfalls nicht unbeträchtlich positive Wachstumseffekte erzielt. Da Quarzsand [Seite 143↓]als Substrat den Erbsenpflanzen kaum verfügbare Nährstoffe bietet, musste mit einem derartigen Düngeeffekt gerechnet werden. Andererseits wäre insbesondere bei hoher applizierter Dosis (Saatgut- und Substratbehandlung mit einer Bakteriensuspension der Konzentration 109 cfu / ml) auch ein gewisser Salzstress für die Erbsenpflanzen durch den Trägerstoff möglich. Es ist jedoch bekannt, dass Bacillus subtilis solchen Stress kompensieren kann (Tigges 1998, Bochow et al. 2001). In der nur mit dem Trägerstoff behandelten Variante entsprach die Menge des eingebrachten Kaliumnitrats jener Menge an Trägerstoff, die auch bei einer kombinierten Anwendung (Saatgut- und Substratbehandlung) von Bacillus subtilis in einer Konzentration von 109 cfu / ml eingebracht wurde. Zwar waren bei einigen Behandlungen mit den Nutzbakterien deutlichere Wachstumseffekte feststellbar als bei alleiniger Applikation des Trägerstoffes, eine exakte Abgrenzung zu dem durch Kaliumnitrat erreichten Düngeeffekt ist auf Grund der fehlenden Signifikanzen jedoch nicht möglich. Bei 10 °C zeigte sich ein gegenteiliger Effekt, also eine geringere Wuchsleistung der Erbsenpflanzen in den mit der Kaliumnitrat-Variante zu vergleichenden Bakterienbehandlungen. Dies könnte auf eine Überkonzentration an Bacillus subtilis-Keimen um den Samen und die Pflanzenwurzel zurückzuführen sein, die mit einer Verzögerung der Pflanzenentwicklung einhergeht, welche bei dieser niedrigen Temperatur von den Pflanzen bis zum Versuchsende nicht ausgeglichen werden konnte. Es ist denkbar, dass sich durch die hohe Keimzahl der Bakterien deren Stoffwechselprodukte (z.B. auch Antibiotika) in Konzentrationen anreicherten, die sich negativ auf die Pflanzenentwicklung auswirkten. Eine solche Möglichkeit ist aus der Literatur bekannt (Maurhofer et al. 1992). Die Stoffwechselaktivität von Bacillus subtilis bei niedrigen Temperaturen ist belegt (Kilian et al. 1998).

Ein Ergebnis unserer ersten Versuchsserie war, dass das Sprosswachstum der Erbsenpflanzen durch die einzelnen Behandlungen stärker gefördert wurde als das Wurzelwachstum. Bei einer Temperatur von 25 °C kam es sogar vielfach zu einer Reduktion der Wurzelfrischmassen gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Ähnliche Erfahrungen machten auch Reddy & Rahe (1989b). Sie fanden heraus, dass drei der von ihnen verwendeten Bacillus subtilis-Stämme das Sprosswachstum von Zwiebelpflanzen förderten, jedoch nur einer das Wurzelwachstum. Dabei sahen sie einen Hauptgrund für die ermittelte Wachstumsförderung in der Reduktion der autochthonen Mikroflora im Wurzelbereich, von der einige parasitische und nicht-[Seite 144↓]parasitische Mikroorganismen als Stressoren für die Kulturpflanze in Frage kommen. Von zahlreichen Autoren wird hingegen berichtet, dass Behandlungen mit Bacillus subtilis gerade das Wurzelwachstum förderten. In unserer Versuchsserie 1 wird die weniger starke Förderung bzw. gar Reduktion des Wurzelwachstums in erster Linie für einen Effekt des Trägerstoffes Kaliumnitrat gehalten. Bei 25 °C verursachte Kaliumnitrat allein die stärkste Verminderung der Wurzelfrischmasse, bei 10 °C wurde der zweitniedrigste Wert in dieser Variante ermittelt. Insgesamt wird eingeschätzt, dass Kaliumnitrat als Trägerstoff für die Praxis durchaus positiv zu bewerten ist, weil damit ein zusätzlicher Düngeeffekt für die Kulturpflanze erreicht werden kann. Für Versuche zum Nachweis phytoeffektiver Wirkungen von Bacillus subtilis sollte jedoch nach Möglichkeit mit anderen Trägersubstanzen gearbeitet werden. Es war zu beobachten, dass die Wachstumsförderung bei Temperaturen von 10 °C am größten war, also außerhalb des Wachstumsoptimums der Erbsenpflanzen. Auch Reddy & Rahe (1989a) ermittelten die größte Zunahme der Sprosslängen von Zwiebelpflanzen infolge der Applikation von Bacillus subtilis bei niedrigen Temperaturen. Das deckt sich mit der Aussage, dass die Anwendung dieses Nutzbakteriums besonders dann effektiv ist, wenn die Kulturpflanzen keine optimalen Entwicklungsbedingungen vorfinden, also unter biotischem oder abiotischem Stress leiden. Einer der entscheidenden Wirkmechanismen von Bacillus subtilis-Stämmen, mit denen deren stressmindernde Effekte zu erklären sind, ist der enzymatische Aufschluss von pflanzenverfügbarem Phosphor als Nährstoff für die Pflanze. Kunishi & Bandel (1991) betonen die Bedeutung der mikrobiellen Aufbereitung zur pflanzlichen Aufnahme von Phosphor, insbesondere bei Phosphor-Mangel. Idris Ahmed (2002) wies nach, dass einige Bacillus subtilis-Stämme in der Lage sind, Phytat als Bindungsform von Phosphor in der Pflanze aufzuschließen. Phytat ist ohne diesen enzymatischen Abbau nicht verfügbar für die Pflanze. So wurde die wachstumsfördernde Wirkung der extrazellulären Phytaseaktivität von Bacillus amyloliquefaciens FZB45 auf Maispflanzen bei Vorhandensein von Phytat und unter Phosphor-Mangel belegt. Gerade in Böden und Substraten ohne optimale Nährstoffversorgung kann die Verfügbarmachung von Phosphor für Wachstum und Vitalität der Pflanzen von großer Bedeutung sein.

Außerdem werden durch Bacillus spp. Auxine (IAA) sowie weitere Substanzen mit Auxin-ähnlichen Wirkungen gebildet. Sie haben eine eindeutig stimulierende Wirkung auf das Pflanzenwachstum (Chanway & Nelson 1991, Idris Ahmed 2002). Die [Seite 145↓]Produktion dieser Substanzen ist an bestimmte Entwicklungsbedingungen für die Bakterien gebunden, wie verhältnismäßig niedrige Temperatur (22 °C), geringe Durchlüftung (in Flüssigkultur) und Dunkelheit. In unserer Versuchsserie 1 könnte die Erreichung der größten phytoeffektiven Wirkung bei niedriger Temperatur (10 °C) auch mit der stärkeren Produktion solcher Auxin-ähnlichen Substanzen durch die Bakterien zu begründen sein. Auch die Ergebnisse von Beauchamp et al. (1991) mit Pseudomonas sp. zeigen, dass außerhalb des Wachstumsoptimums von Kartoffelpflanzen sowohl bei niedrigerer (12 °C) als auch bei höherer Temperatur
(28 °C) die auf Behandlung mit PGPR zurückzuführende Wachstumsförderung größer war. Über die mikrobielle Produktion von Phytohormonen, wie Cytokininen oder Auxinen bzw. ihrer Präkursoren, berichten Arshad & Frankenberger (1991). Wie aus den eben genannten Tatsachen deutlich wird, beeinflussen Umweltfaktoren nicht nur Populationsentwicklung und Aktivität von PGPR schlechthin, sondern auch deren Produktion aktiver Substanzen, die das Pflanzenwachstum sowie die Entwicklung von Pflanzenkrankheiten beeinflussen können. Dabei ist nicht nur die Bildung phytohormonell wirksamer Substanzen zu sehen, sondern auch die weiterer Metabolite, die sich direkt oder indirekt auf die Pflanzenentwicklung auswirken, wie etwa HCN-Verbindungen bei fluoreszierenden Pseudomonaden (Schippers et al. 1991).

Hinsichtlich der Bewertung des Einflusses von Bacillus subtilis auf die Wuchsleistung der Erbsenpflanzen sollen einige Vorüberlegungen angestellt werden. Die Erbse besitzt Samen mit einem großen Endosperm, d.h. vielen Reservestoffen. Dadurch war es in den Versuchen möglich, während des gesamten Zeitraumes von 30 Tagen trotz Verwendung eines nährstoffarmen Substrates (Quarzsand) ohne Düngung auszukommen, ohne dass Mangelsymptome an den Erbsenpflanzen festzustellen waren. Allerdings wirkt sich diese Tatsache auch erschwerend auf den Nachweis wachstumsfördernder und stressmindernder Wirkungen von Bacillus subtilis aus. In der ersten Versuchsserie ergaben sich somit zumeist nur tendenzielle Befunde, signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Varianten wurden kaum gefunden. Eine weitere Ursache für Schwierigkeiten beim Nachweis von Wachstumseffekten bei der Erbse als Versuchspflanze könnte die mit 30 Tagen relativ kurze Versuchsdauer sein, bei der Auswirkungen auf den Ertrag unberücksichtigt bleiben mussten. Aus technischen Gründen war eine wesentliche Verlängerung des Versuchszeitraumes jedoch nicht möglich. Das Vorhandensein des phytopathogenen Pilzes in unserer Versuchsserie 2 [Seite 146↓]führte dazu, dass in den mit Bacillus subtilis behandelten Varianten kaum Wachstumseffekte zu beobachten waren.

Durch die große Streubreite der Einzelwerte waren auch bei den Versuchen in Feldboden (Versuchsserie 3) Unterschiede im Wachstum der Erbsenpflanzen durch die in das System Pflanze - Substrat eingebrachten Mikroorganismen zumeist nicht statistisch zu sichern. Die in der Regel tendenziell höhere vegetative Leistung der mit dem Nutzbakterium behandelten Pflanzen gegenüber der mit Phoma pinodella inokulierten Kontrolle ist hauptsächlich mit deren besseren Gesundheitszustand erklärbar. Aber auch die unmittelbar wachstumsfördernde Wirkung durch Stoffwechselprodukte von Bacillus subtilis, die den Phytohormonhaushalt der Pflanze beeinflussen, ist als Ursache denkbar. Weitgehend bedeutungslos ist bei dieser Versuchsserie ein Einfluss des Trägerstoffs (Sand) auf das Pflanzenwachstum. Die im Gegensatz zu Versuchsreihe 1 hier ebenfalls geförderte Wurzelfrischmasse der Erbsenpflanzen durch Applikation des untersuchten Nutzbakteriums ist ein Indiz, dass in Versuchsserie 1 festgestellte Reduktionen der Wurzelfrischmassen im Vergleich zur Kontrolle auf den dort verwendeten Trägerstoff Kaliumnitrat zurückgehen. In der ersten Versuchsreihe kam es im Besonderen auch in solchen Varianten zu einer Verminderung der Wurzelfrischmasse, bei denen Bacillus subtilis mit einem hohen Titer angewandt worden war, d.h. auch der Trägerstoff in einer hohen Konzentration vorlag.

Der Einfluss der einzelnen Behandlungen auf das vegetative Wachstum der Erbsenpflanzen war auch bei den Kompexversuchen gering. Es wurde deutlich, dass der durch Inokultion mit Phoma pinodella und Rhizoctonia solani hervorgerufene Krankheitsbefall der Testpflanzen sich nach einer Versuchsdauer von 30 Tagen kaum in einem verminderten Pflanzenwachstum niederschlug. Bei beiden Gewächshausversuchen ließ sich unter Pathogeneinfluss sogar ein leicht verstärktes Sprosswachstum feststellen, eine Art positiver Stress durch die Krankheitserreger. Auch wenn eine Behandlung mit Bacillus subtilis FZB47 allein in den Gewächshausversuchen zu leicht erhöhtem Sprosswachstum gegenüber der unbehandelten Kontrolle führte, lassen sich Wachstumseffekte durch die introduzierten Bakterien sowie durch das Neem-Präparat auf Grund der fehlenden Signifikanzen nicht hervorheben. Das bessere Pflanzenwachstum in Aussaaterde gegenüber Feldboden weist auf ein für die Entwicklung der Erbsenpflanzen günstigeres Substrat hin. Offenbar waren die Bedingungen im Gewächshaus mit schwankender Temperatur und [Seite 147↓]Luftfeuchte für das Pflanzenwachstum förderlicher, speziell für das Sprosswachstum, als das genau definierte Temperatur- und Feuchteregime in der Klimakammer.

Antifungale Wirkung von Bacillus subtilis

In Quarzsand

Der durch Anwendung der Nutzbakterien nur geringfügig reduzierte Krankheitsbefall in unserer Versuchsserie 2 ist eine Ursache für das weitgehende Fehlen von Wachstumseffekten. Die Inokulation mit Phoma pinodella rief bei den Erbsenpflanzen einen starken Krankheitsbefall hervor. Bei anderen Versuchen hatte sich gezeigt, dass der gesundheits- und vitalitätsfördernde Effekt von Bacillus subtilis auf die Pflanzen bei einem sehr hohen Schaderregerdruck gering ist (Jamal 1993). Das ist in ähnlicher Weise auch von anderen PGPR wie fluoreszierenden Pseudomonaden bekannt (Xi et al. 1996). Bei zwei Versuchen im Vorfeld der hier beschriebenen Versuchsserie, in denen eine zusätzliche Saatgut-Inokulation mit Phoma pinodella angesetzt wurde, ergab sich ein sehr schlechter Auflauf und ein starker Krankheitsbefall an den Erbsenpflanzen, sodass die Mehrzahl der aufgelaufenen Pflanzen trotz Behandlung mit Bacillus subtilis bis zum Versuchsende abstarben. In einem künstlichen Substrat ist die Zusammensetzung der Boden-Mikroflora weniger komplex als in natürlichem Boden (Van Peer & Schippers 1989). Das ermöglicht eine rasche Ausbreitung von phytopathogenen Mikroorganismen. In dem nährstoffarmen und biologisch wenig aktiven Quarzsand ist die Affinität des Krankheitserregers zur Pflanze sehr hoch. Dementsprechend hoch war bei den eigenen Versuchen auch der Infektionsdruck auf die Pflanzenwurzel bei Inokulation mit dem Pathogen. Somit ist es nicht überraschend, dass die in vorangegangenen in vitro-Versuchen festgestellte gute Hemmung von Phoma pinodella durch Bacillus subtilis (Issoufou 2000) in dieser Versuchsserie nicht bestätigt werden konnte. Dass der Krankheitsbefall durch das Nutzbakterium trotzdem noch um bis zu 23 % vermindert werden konnte, spricht für dessen antagonistische Wirkung. Bei Temperaturen von 20 °C und 25 °C war bei jeweils zwei Varianten mit Bacillus subtilis-Behandlung die Verminderung des Krankheitsindex gegenüber der inokulierten Kontrolle signifikant, woraus sich auf eine etwas bessere antifungale Wirksamkeit bei 20 °C und 25 °C im Vergleich zu 15 °C schließen lässt. Das bestätigt Erkenntnisse von Jamal (1993). Er stellt die Temperatur als wichtigsten ökologischen Einflussfaktor für die antifungale Aktivitätsentfaltung heraus und nennt einen Optimalbereich von 20 °C bis 25 °C. Im Gegensatz dazu beobachteten Tedla & [Seite 148↓]Stanghellini (1992) einen größeren bakteriellen Antagonismus gegenüber Pythium aphanidermatum an Zuckerrübenwurzeln in natürlichem Boden bei 20 °C im Vergleich zu 27 °C. Das traf auch zu ohne Zunahme der Bakterienpopulationen. Die Autoren hielten die Konkurrenz um Nährstoffe für einen wesentlichen Grund für die Unterdrückung von Pythium aphanidermatum bei niedrigen Bodentemperaturen.

In Feldboden

Obwohl in Feldboden (Versuchsserie 3) an den Erbsenwurzeln allgemein niedrigere Populationsdichten von Bacillus subtilis ermittelt wurden als in Quarzsand, war die Wirkung gegen den pilzlichen Krankheitserreger Phoma pinodella in Feldboden deutlich besser. Dies sollte als weiterer Beleg dafür gelten, dass die gesundheits-fördernde Wirkung des Nutzbakteriums keineswegs allein von dessen Besiedlungsdichte abhängt. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen Gasoni et al. (1998) mit Pseudomonas fluorescens. Sie stellten nach 90 Tagen Lagerung der Antagonisten-Formulierung zwar einen Rückgang der Keimzahl um ein Vielfaches fest, konnten aber dadurch keine Beeinträchtigung der antifungalen Leistung gegen Rhizoctonia solani beobachten.

Der in den nicht mit Phoma pinodella inokulierten Varianten festgestellte Krankheitsbefall wird auf natürlicherweise im Boden vorkommende Krankheitserreger wie Rhizoctonia solani und Fusarium spp. zurückgeführt. Obgleich die Konzentration der inokulierten Sporensuspension von Phoma pinodella in dieser Versuchsserie von 1*105 cfu / ml auf 5*105 cfu / ml erhöht wurde, war die Symptomausbildung wesentlich schwächer als in Quarzsand, was mit den oben erwähnten besseren Puffereigenschaften des Feldbodens gegenüber Quarzsand zu erklären ist. Möglicherweise liegt darin auch die Begründung für den im Vergleich zu Versuchsserie 2 besseren Biocontrol-Effekt von Bacillus subtilis gegen Phoma pinodella. Ein zu starker Schaderregerdruck führt oftmals zu einem unbefriedigenden Bekämpfungseffekt durch Nutzbakterien. Mit dem geringeren Erregerdruck in Versuchsserie 3 kam die antagonistische Wirkung der introduzierten Bakterien stärker zum Tragen. Ein weiterer Grund für die bessere antifungale Leistung von Bacillus subtilis in Feldboden ist die höhere Aktivität des Bakteriums, ausgedrückt durch den niedrigeren Versporungsgrad, in diesem Substrat. Hwang & Chakravarty (1992) berichten, dass Bakterien mit den keimenden Sporen pilzlicher Phytopathogene um Nährstoffe konkurrieren und damit die Pathogene erfolgreich reduzieren können.


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Ein denkbarer Mechanismus für die antifungale Wirkung von Bacillus subtilis ist ferner die Reduktion der Population des Erregers. Gaikwad et al. (1987) beobachteten eine deutliche Verringerung der Population von Fusarium oxysporum im Boden nach Introduktion von Bacillus subtilis und begründeten damit die krankheitsunterdrückende Wirkung des Bakteriums.

Zu berücksichtigen ist auch die stoffliche Ebene. Umweltfaktoren beeinflussen die Produktion phytoeffektiv wirksamer Substanzen von Bacillus subtilis und anderen Rhizosphärebakterien. Das gilt auch für die Produktion antifungaler Substanzen. Diese konnten Gupta & Utkhede (1987) bei Bacillus subtilis in in vitro-Versuchen durch Zugabe von Stickstoff und Phophor zum Nährmedium steigern. Jamal (1993) erreichte durch zusätzliche Nährstoffapplikation in Form von Ammoniumnitrat und Kaliumdihydrogenphosphat zur Bakterien-Saatgutbehandlung eine verbesserte phytosanitäre Wirkung gegen Alternaria radicina. Der höhere Gehalt an Nährstoffen in Feldboden kann also für die bessere Pathogen unterdrückende Wirkung in diesem Substrat auch eine Rolle gespielt haben. Dennoch sind nicht allein hohe Nährstoffgehalte von Vorteil, sondern die Zusammensetzung des Nährmediums bzw. des Substrates. So stellten Issoufou (2000) sowie Schmiedeknecht et al. (2001) fest, dass eine geringe Verfügbarkeit von Eisen im Testmedium die Konkurrenzfähigkeit von Bacillus subtilis erhöhte und dessen antifungale Aktivität verbesserte. In einer anderen Arbeit hoben Gupta & Utkhede (1986) die Bedeutung von Temperatur und pH-Wert auch für die Produktion antifungaler Substanzen durch Bacillus subtilis hervor. Ein Maximum erreichen sie in einem Temperaturbereich zwischen 21 °C und 28 °C und bei pH-Werten zwischen 5,0 und 8,0. Die pH-Werte bei den Substraten der in dieser Arbeit dargestellten Versuche liegen ebenso im Optimalbereich. Eine Verbesserung der antagonistischen Wirksamkeit des Nutzbakteriums bei 25 °C im Vergleich zu 15 °C und 20 °C war in Feldboden nicht eindeutig auszumachen. Issoufou (2000) stellte bei höherer Temperatur eine verbesserte antifungale Wirkung von Bacillus subtilis fest. Die Produktion antifungaler Substanzen lässt sich unter kontrollierten Bedingungen durch Optimierung der Umweltfaktoren steigern und damit auch eine Verbesserung der Pathogen unterdrückenden Wirkung erreichen. Eine übermäßig hohe Konzentration, beispielsweise von Antibiotika, im Wurzelraum der Pflanzen kann aber auch phytotoxische Wirkung haben (Maurhofer et al. 1992). Dabei wird davon ausgegangen, dass bei den verwendeten Bacillus subtilis-Stämmen die Antibiotika-[Seite 150↓]Produktion für die antifungale Leistung von eher untergeordneter Bedeutung ist. Die an anderer Stelle bereits hervorgehobene Verminderung negativer Effekte abiotischer Stressoren auf die Pflanze durch Behandlungen mit dem Nutzbakterium soll als Beleg dafür gelten. So gelang es Siede & Hoppe (2000), bakterielle Antagonisten gegen die durch Mycosphaerella pinodes hervorgerufene Fußkrankheit der Erbse zu finden, bei denen keine Antibiotikabildung nachgewiesen werden konnte. Vielmehr erwiesen sich Siderophoren und gasförmige Substanzen als wichtige antifungale Faktoren.

Die Einzelversuche zur Populations- und Aktivitätsdynamik von Bacillus subtilis, erbrachten die Erkenntnis, dass in Feldboden mehr Bakterienzellen im Substrat aktiv sind als in Quarzsand. Trotz dieser Tatsache war am Ende des 60 Tage dauernden Langzeitversuchs bei FZB47 kein Absinken der Populationsdichte festzustellen. Wachstumseffekte waren jedoch auch nach dieser Zeit kaum nachweisbar, sodass auch hier keine Korrelation zwischen Keimzahl von Bacillus subtilis im Substrat und phytoeffektiver Leistung hergestellt werden konnte. Die Anzahl der Pflanzen, die im nicht sterilen Feldboden Spontaninfektionen mit Wurzel- und Fußkrankheiten zeigten, war nach 60 Tagen deutlich größer als in Versuchsserie 3 nach 30 Tagen. Trotz der am Versuchsende ermittelten hohen Populationsdichte des Nutzbakteriums wurde keine signifikante Unterdrückung dieses Krankheitsbefalls erreicht. Aus früheren Arbeiten ist geht hervor, dass die antagonistische Wirksamkeit von Bacillus subtilis gegen pilzliche Krankheitserreger mit der Pflanzenentwicklung nachlässt und die Bakterien vor allem in frühen Entwicklungsstadien der Kulturpflanzen als effektive Antagonisten anzusehen sind (Freier et al. 1990a).

Bei Kombination mit einem Neem-Präparat

Obwohl sich nach 30 Tagen Versuchsdauer bei den Komplexversuchen kaum Wachstumsunterschiede zwischen den einzelnen Varianten erkennen ließen, waren deutliche und zumeist auch statistisch zu sichernde Differenzen im Gesundheitszustand der Pflanzen sichtbar. Der mit einem Krankheitsindex von 22,2 % relativ hohe Krankheitsbefall in der unbehandelten Kontrolle beim Versuch in Feldboden lässt sich mit dem natürlichen Vorhandensein pilzlicher Krankheitserreger in dem nicht sterilisierten Substrat erklären. Der Gehalt an solchen Schaderregern ist in einem industriell hergestellten gärtnerischen Substrat, wie Aussaaterde, entsprechend geringer. Bei allen drei Komplexversuchen wiesen die Erbsenpflanzen in den mit Phoma pinodella bzw. Rhizoctonia solani inokulierten Kontrollen einen signifikant höheren [Seite 151↓]Krankheitsindex auf als jene in den nicht inokulierten Varianten. Durch Zugabe von FZB47 und / oder Rakshak Gold wurde mit einer Ausnahme eine zumindest tendenzielle, teilweise auch signifikante, Reduktion des Krankheitsbefalls erreicht.

Zur insektiziden Wirksamkeit des Neem-Wirkstoffes Azadirachtin existieren viele Erfahrungen und so haben Neem-Präparate als nützlingsschonende Insektizide verbreitet große Bedeutung erlangt (Schmutterer 1996). Zur antifungalen Wirkung einiger Neem-Extrakte ist vergleichsweise wenig bekannt. Erst durch die Arbeit von Singh et al. (1980), die eine hemmende Wirkung gegen mehrere pilzliche Krankheitserreger nachwiesen, war das fungizide Potenzial von Neem-Präparaten Gegenstand späterer Forschungsarbeiten. So stellten Grewal & Grewal (1988) eine toxische Wirkung sowohl von Samen- als auch von Blattextrakten des Neem-Baumes gegen viele Pilze unter in vitro-Bedingungen fest. Prithiviraj et al. (1998) erreichten mit dem Produkt Neemazal allein und in Kombination mit Ajoene, einem Inhaltsstoff des Knoblauchs (Allium sativum), eine Verminderung der Krankheitsintensität des Echten Mehltaus der Erbse (Erisyphe pisi). Rovesti et al. (1992) berichten von einer guten vorbeugenden und kurativen Wirkung von Neemsamen-Extrakt gegen die Echten Mehltaupilze Erisyphe graminis und Sphaerotheca fuliginea sowie außerdem gegen Puccinia recondita f. sp. tritici. Bei Zugabe eines Neem-Produkts in den Boden beobachteten Jeyarajan et al. (1986) verminderte Infektionen durch eine Reihe phytopathogener Pilze, u.a. Rhizoctonia solani. Achimu & Schlösser (1992) erreichten mit Neem-Präparaten sowohl präventiv als auch kurativ gute Bekämpfungsergebnisse gegen den Falschen Mehltau der Weinrebe, Plasmopara viticola. Weiterhin berichten Lehmann et al. (1992), Pasini et al. (1997), Coventry & Allan (1997) sowie Bhattacharya & Pramanik (1998) von einer antifungalen Wirkung von Neem-Extrakten. Lehmann et al. (1992) zeigten, dass die fungizide Wirkung nicht auf Azadirachtin, der insektiziden Hauptkomponente des Neembaumes, zurückgeht. Steinhauer (1994) gelang die Isolation einer antifungal wirksamen Verbindung aus Neemsamen-Extrakt. Der Autor hielt es jedoch für wahrscheinlich, dass mehrere Inhaltsstoffe eine das Pilzwachstum hemmende Wirkung besitzen.

Die Ergebnisse der eigenen Versuche belegen, dass Behandlungen mit Bacillus subtilis prinzipiell zu einer Verminderung des Krankheitsbefalls mit zwei bedeutenden boden- und samenbürtigen pilzlichen Phytopathogenen führen oder zumindest den Krankheitsverlauf verlangsamen. Auch dem Neem-Präparat sind gewisse fungizide [Seite 152↓]bzw. fungistatische Effekte zuzuschreiben. Neben einer Förderung der antagonistischen Mikroflora durch das Neem-Präparat kommen auch direkte Effekte gegen pilzliche Phytopathogene in Betracht (Rovesti et al. 1992).

Nutzbakterien und Neem-Präparat waren bei den Komplexversuchen in ihrer Effektivität zur Krankheitsunterdrückung etwa gleich einzuschätzen. Bei gemeinsamer Applikation von FZB47 und Rakshak Gold kam es zu keiner oder einer nur unbedeutenden weiteren Reduktion des Krankheitsindex im Vergleich zur Einzel-Anwendung. Es gab also keine Synergie-Effekte. Wirkungsgrade von kombinierter Anwendung von Bacillus subtilis mit diversen Fungiziden, die jene der jeweiligen Einzel-Anwendungen überstiegen, sind aus der Literatur bekannt (Chakravarty et al. 1990, Obieglo et al. 1990, Hwang & Chakravarty 1992). Die Kombination des Nutzbakteriums mit einem Fungizid zur Verbesserung der Wirkungssicherheit ist insbesondere dann günstig, wenn die Bakterien keine optimalen Umweltbedingungen vorfinden und ihre gewünschte Wirkung nicht entfalten können.

Während im Feldboden der durch Phoma pinodella und Rhizoctonia solani hervorgerufene Krankheitsbefall an den Erbsenpflanzen mit Hilfe von FZB47 und / oder Rakshak Gold zumeist tendenziell reduziert wurde, zeigte sich in Aussaaterde sowohl im Gewächshaus als auch in der Klimakammer eine deutlichere und oftmals signifikante Verminderung des Krankheitsbefalls. Als Grund dafür sind im Wesentlichen die unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften von Feldboden und Ausaaterde zu nennen. Die verwendete Aussaaterde war ein wesentlich leichteres, grobporigeres und damit besser durchlüftetes Substrat, das damit bessere Entwicklungsbedingungen für das aerobe Bakterium Bacillus subtilis bot. Folgerichtig wurden in den Komplexversuchen in Substrat und Rhizosphäre die größeren Populationsdichten und zumindest im Substrat auch die etwas höhere Aktivität der introduzierten Bakterien in Aussaaterde festgestellt. Zudem ist in Feldboden von einem höheren natürlichen Schaderregerdruck auszugehen als in Aussaaterde, was sich in einem deutlich höheren spontanen Befall mit pilzlichen Wurzel- und Fußkrankheiten in der unbehandelten Kontrolle in Feldboden äußerte. Es ist bekannt, dass Bacillus subtilis einen sehr hohen Schaderregerdruck nicht zu kompensieren vermag (Thompson et al. 1996). Am effektivsten ist das Nutzbakterium bei präinfektioneller Applikation und einem geringen Befallsdruck (Abdelaziz 1993).


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Durch den Einsatz von Bacillus subtilis und dem Neem-Präparat war es nicht möglich, den Befall auf das Niveau der nicht mit den Phytopathogenen inokulierten Varianten zurückzudrängen. Eine tendenzielle und oftmals auch signifikante Reduktion des Krankheitsindex wurde jedoch fast immer erreicht.

In den dargestellten Versuchsreihen konnte mehrfach keine Beziehung zwischen Keimzahl des Nutzbakteriums und dessen Wirkung auf Gesundheit der Erbsenpflanzen gefunden werden. Obwohl im Feldboden in der Rhizosphäre niedrigere Besiedlungsdichten festgestellt worden waren als im Quarzsand, war die Wirkung gegen Phoma pinodella im Feldboden wesentlich besser. Entscheidend für die antagonistische Wirkung der Bakterien ist vielmehr deren Aktivität. Wie bereits aus den dargestellten Ergebnissen hervorgeht, ließ sich auch aus den Erkenntnissen aller Versuche keine Korrelation zwischen Populationsdichte von Bacillus subtilis und dessen Wirksamkeit hinsichtlich Wachstumsbeeinflussung und Gesundheitsförderung bei den Kulturpflanzen feststellen. Das bestätigt die aus der Literatur bekannten Erkenntnisse, wie sie in Abschnitt 2.3 genannt wurden.


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17.06.2004