Institut für Biochemie der Charité-Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

" Charakterisierung von Varianten des anti-c-myc-Antikörpers 9E10 mit Keimbahngen-orientierten Aminosäureaustauschen "

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Diplom-Biochemikerin Kristina Zubow
geboren am 03.02.1976 in Simferopol (Krim)

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

Dekan: der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Wolfgang Höhne
2. Prof. Dr. Burkhard Micheel
3. Prof. Dr. Stefan Dübel

eingereicht: 10.07.2006

Datum der Promotion: 08.01.2007

Inhaltsverzeichnis

• 1  Abkürzungsverzeichnis
• 2  Zusammenfassung
• 3  Einleitung
  • 3.1  Das Adaptive Immunsystem
    • 3.1.1  Reifung der B-Lymphozyten
  • 3.2 Antikörper
    • 3.2.1  Struktur und Funktion
    • 3.2.2 Molekulare Basis der Antikörper-Antigen-Erkennung
    • 3.2.3 Antikörperdesign
  • 3.3 Der anti-c-myc-Peptid-Antikörper 9E10
  • 3.4 Die Affinitätsreifung von Antikörpern
    • 3.4.1  Die hypervariable CDR-H3
  • 3.5 Peptidspot-Analysen
• 4  Zielstellung
• 5  Material und Methoden
  • 5.1  Material
    • 5.1.1  Chemikalien
    • 5.1.2 Lösungen, Puffer und Nährmedien für Arbeiten mit E. coli
    • 5.1.3 Puffer und Lösungen für Proteinexperimente
    • 5.1.4 Puffer und Lösungen für DNA-Experimente
    • 5.1.5 Synthetische Oligonukleotide
    • 5.1.6 Synthetische Peptide
    • 5.1.7 Plasmid und Bakterienstämme
    • 5.1.8 Kits, Proteine und sonstige Substanzen
  • 5.2 Methoden
    • 5.2.1  Herstellung der 9E10-Rückmutanten
      • 5.2.1.1  Ortsgerichtete Mutagenese mittels PCR
      • 5.2.1.2 Ligation in pASK85-9E10
      • 5.2.1.3 Transformation in superkompetente XL-1-Zellen
      • 5.2.1.4 Selektion der mutierten DNA
      • 5.2.1.5 Sequenzierung der DNA
    • 5.2.2 Präparative Fab-Synthese in E. coli
      • 5.2.2.1  Fab-Expression
      • 5.2.2.2 Fab-Isolierung aus dem Periplasma
      • 5.2.2.3 In vitro Fab-Rückfaltung
    • 5.2.3 Reinigung von Fab mittels Metallaffinitätschromatographie
    • 5.2.4 Biochemische Charakterisierung von 9E10-Fab und Rückmutanten
      • 5.2.4.1  Peptidspot-Analysen
      • 5.2.4.2 K_D-Bestimmung im ELISA
      • 5.2.4.3 Bestimmung der kinetischen Konstanten und K_D mittels SPR
    • 5.2.5 Modellierung der Bindung des c-myc(410-427)-Peptides an 9E10
    • 5.2.6 Standardmethoden
    • 5.2.7 Keimbahngensequenzanalyse mit Datenbanken
    • 5.2.8 Programm für Moleküldarstellungen
• 6  Ergebnisse
  • 6.1  Identifizierung der Keimbahngene zu 9E10
  • 6.2 Verteilung der somatischen Mutationen im 9E10 und Auswahl der Einzelrückmutanten
  • 6.3 Epitopverlängerung und Modellierung der Bindung an 9E10
  • 6.4 Mutagenesestudien an 9E10 und bakterielle Fab-Expression in E. coli
  • 6.5 Reinigung der Fab-Fragmente
  • 6.6 Biochemische Charakterisierung von 9E10-Fab und Keimbahnrückmutanten
    • 6.6.1  Charakterisierung der Bindungskonstanten an c-myc-Peptide
      • 6.6.1.1  Bestimmung von K_D im ELISA
      • 6.6.1.2 Bestimmung von K_D und der kinetischen Konstanten k_on und k_off mit SPR
    • 6.6.2 Charakterisierung der Bindungsspezifität
      • 6.6.2.1  Substitutionsanalysen an c-myc-Peptiden
      • 6.6.2.2 Längenanalysen am c-myc-Peptid
      • 6.6.2.3 Kreuzreaktivitätsanalysen mit homologen myc-Peptiden
• 7  Diskussion
  • 7.1  Identifizierung der Keimbahngene zu 9E10
  • 7.2 Bakterielle Expression von 9E10-Fab und Rückmutanten
  • 7.3 Charakterisierung der Bindungseigenschaften von 9E10-Fab
  • 7.4 Charakterisierung der Bindungseigenschaften von Rückmutanten
    • 7.4.1  Einfluss von Einzelrückmutationen auf die Bindungseigenschaft
      • 7.4.1.1  Die Einzelrückmutationen H^H31S, R^H53G und G^H52S
      • 7.4.1.2 Die neutrale Einzelrückmutation H^H58Y
      • 7.4.1.3 Die Einzelrückmutationen S^H100hY sowie F^L30I und T^L91S
    • 7.4.2 Einfluss der rückmutierten V-Domänen auf die Bindungseigenschaft
    • 7.4.3 Bindungseigenschaft der 9E10-Keimbahngenrückmutante
  • 7.5 Fazit der Affinitätsreifung von 9E10
  • 7.6 Fehlerbetrachtung der Peptidspot-Analysen
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Eidestattliche Erklärung
• Anhang

Tabellen

• Tabelle 5.1. : PCR-Ansatz und Syntheseprogramm für die Herstellung der Konstrukte H^H31S, G^H52S, S^H100hY, F^L30I, L_Keimbahn und H_Keimbahn .
• Tabelle 5.2.: In der PCR eingesetzte Primer für die Herstellung der Konstrukte H^H31S, G^H52S, S^H100hY, F^L30I, L_Keimbahn und H_Keimbahn und Größe der amplifizierten DNA-Fragmente.
• Tabelle 5.3. : Herstellung von R^H53G
• Tabelle 5.4. : Herstellung von H^H58Y
• Tabelle 5.5. : Ansatz für eine Assemblierungs-PCR zur Herstellung der Konstrukte H^H31S, G^H52S, L_Keimbahn und H_Keimbahn .
• Tabelle 5.6. : Syntheseprogramm für die Assemblierungs-PCR. * 40°C für die Synthese von L_{Kei m bahn} und H_{Kei m bahn}.
• Tabelle 5.7. : PCR-Ansatz und Syntheseprogramm zur Herstellung des Konstruktes T^L91S.
• Tabelle 5.8. : Ansatz für die Ligation der DNA und für den Verdau der methylierten parentalen DNA für die Herstellung von T^L91S.
• Tabelle 5.9. : Identifikation der mutierten Regionen in den Plasmiden pASK85-9E10(x) mit Restriktionsenzymen.
• Tabelle 5.10. : Reinigungsschema. *¹Die Mengenangaben beziehen sich auf die Reinigung der Proben mit selbst hergestellten Säulen. *²Zeigt den Waschpuffer für eine Reinigung an der Chromatographieanlage und *³ die Waschpuffer für eine Reinigung an selbst hergestellten Säulen.
• Tabelle 5.11. : Absorption der Fab-Fragmente bei 280 nm.
• Tabelle 6.2.: Mutationshäufigkeit der Purine und Pyrimidine in den V-Regionen des 9E10.
• Tabelle 6.10. : Vergleich der Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_D und der freien Standardenergie ΔG° von Fab 9E10 und Rückmutanten bei der Bindung an das myc-tag-Peptid im ELISA. Die ΔΔG°-Werte zeigen hier die energetischen Änderungen bei jeder Rückmutation relativ zu 9E10⁽¹⁾. Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten.
• Tabelle 6.12. : Vergleich der Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_D und der freien Standardenergie ΔG° von Fab 9E10 und von den Rückmutanten bei der Bindung an das c-myc(408-427)-Peptid im ELISA. Die ΔΔG°-Werte zeigen hier die energetischen Änderungen bei jeder Rückmutation relativ zu 9E10⁽¹⁾. Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten.
• Tabelle 6.14. : Vergleich der Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten k_on und k_off bei der Bindung der Keimbahnrückmutanten und des gereiften 9E10-Fab an die myc-Peptide. Die Konstanten wurden mit der Methode der Oberflächenplasmonresonanz ermittelt. Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten. Die Änderungen in den Konstanten sind relativ zu 9E10-Fab⁽¹⁾.
• Tabelle 6.18. : Darstellung des K_D der Bindung des 9E10-Fab und seiner Rückmutanten an das myc-tag bzw. myc(408-427)-Peptid, errechnet aus k_on und k_off, die nach der SPR-Methode gemessen wurden. Die ΔΔG°-Werte zeigen hier die energetischen Änderungen bei jeder Rückmutation relativ zu 9E10⁽¹⁾. Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten.
• Tabelle 6.19. : Übersicht über die Substitutionsanalysen an den myc-Peptiden mit dem Fab von 9E10 bzw. der Rückmutanten. Die intensiven Bindungssignale an das Wildtyppeptid sind mit „+“, die schwachen mit „(+)“ und die nicht detektierbaren mit „-“ gekennzeichnet. Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten. Die Abkürzung n. g. steht für nicht gemessen.
• Tabelle 6.32.: Sequenzen der untersuchten myc-Peptide. Die Schlüsselpositionen im humanen c-myc-Peptid sind unterstrichen.

Bilder

• Abb.3.1. : Schematische Darstellung der Bildung eines Antikörpers in B-Lymphozyten. Gezeigt sind die Genumordnungen der murinen H- und L-Kettengene (am Beispiel der κ-Kette) im Knochenmark und die Hypermutationen in den variablen Regionen während der Antikörperaffinitätsreifung in den Keimzentren.
• Abb. 3.2. : Darstellung eines IgG und einer variablen Domäne. (A.) Peptidrückgrat der leichten (blau) und schweren Kette (rot) mit den jeweiligen Domänen. Die Kohlenhydrate sind grün dargestellt. (B.) V-Domäne am Beispiel der leichten Kette mit den β-Strängen (hellblau) und den CDRs (rot) (nach Harris et al., 1998).
• Abb.3.3. : Komplexbildung zwischen einem Antigen (Ag) und einem Fab-Fragment eines Antikörpers nach einem Ein-Schritt-Mechanismus. Die Gleichgewichtsassoziationskonstante K_A und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante K_D ergeben sich aus den kinetischen Konstanten für die Assoziation (k_a) und die Dissoziation (k_d).
• Abb.3.4. : Schematische Darstellung des (A.) induced fit- und des (B.) lock and key-Bindungsmechanismus. Die Antikörperbindungstaschen sind in grau und die Antigene farbig gezeichnet.
• Abb.3.5. : Darstellung des Peptidrückgrates der Proteine Myc (grau) und Max (blau), die untereinander und mit der DNA (gelb) interagieren, aus einer Kristallstruktur. Hervorgehoben sind die α-helikalen Aminosäurereste 408-434 (rot) in einer α-Helix des Myc-Proteins, die mit der des Max-Proteins zu einem coiled coil assoziiert sind (nach Nair et al., 2003, 1NKP).
• Abb. 3.6. : Kristallstruktur zweier 9E10-Fab-Fragmente im Komplex mit dem myc-tag-Peptid (grün, A.) in einer asymmetrischen Einheit bei 2,7 Å Auflösung. (A.) Dargestellt ist das Peptidrückgrat der schweren (rot) und leichten (blau) Kette des bindenden (rechts) und des nicht bindenden (links) Fab-Fragmentes sowie die Wassermoleküle (Punkte). (B.) Hier ist das Peptidrückgrat des myc-tag-Peptides (gelb) bei der Bindung an die variablen Domänen V_H (rot) und V_L (blau) gezeigt (nach Krauß et al., 2007).
• Abb. 3.7. : Draufsicht auf die Antigenbindungsstelle des 9E10 geformt von den Domänen V_H (rot) und V_L (blau). Das Peptid (gelb) bindet außerhalb der konventionellen Bindungsstelle zwischen den beiden Domänen (Pfeil). Die CDR-H3 (rote Oberflächendarstellung) interagiert mit der CDR-L1 (blaue Oberflächendarstellung) und CDR-L3 (hellblaue Oberflächendarstellung) (nach den Kristallstrukturdaten von N. Krauß).
• Abb.3.8. : Kristallstrukturen der 9E10-CDR-H3 (Reste 92-104, Nummerierung nach Kabat) in den Kopf-an-Kopf dimerisierten Fab-Fragmenten. In 1. ist die Cα-Atomüberlagerung der bindenden (rot) und der nicht bindenden Konformation (blau) und in 2. die Ausbildung eines dreisträngigen antiparallelen β-Faltblattes zwischen der CDR-H3 (rot) und dem N-Terminus des myc-tag-Peptides (gelb) zu sehen. (2.) Darstellung der bindenden Konformation mit den zahlreichen aromatischen Resten in der Kopf-Region (nach den Kristallstrukturdaten des 9E10-Fab von N. Krauß).
• Abb.3.9. : Schematische Darstellung einer Substitutionsanalyse zur Identifizierung von Schlüsselpositionen. (A.) Die linke Reihe repräsentiert die Wildtypsequenz des Peptides. An diesem Beispiel wird die Bindung eines Fab-Fragmentes an ein Peptid (B.) über einen Enzym markierten sekundären Antikörper (C.) nachgewiesen (Zwei-Schritt-Detektion)
• Abb. 3.10. : Substitutionsanalysen an den Peptiden myc-tag (a.) und einem verkürzten myc (KLISEEDL, (b.)). Der gebundene 9E10-Antikörper wurde über einen HRP-markierten anti-Maus-IgG-Antikörper detektiert, und die Membranen wurden mit Diaminobenzidin (a.) bzw. einem Chemilumineszenzsubstrat (b.) entwickelt (Hilpert et al., 2001).
• Abb.6.1. : Sequenzvergleich der 9E10-V-Regionen mit hochhomologen murinen Ig-Keimbahngensegmenten. (A) Vergleich des V_H-Gens mit den Keimbahngensegmenten VH3:3.39, DFL16.1 und JH4 sowie (B.) des V_L-Gens mit 21-2* und J1. Die in den 9E10-Genen (oben) und in den Keimbahngenen (unten) kodierten Aminosäuren sind dargestellt. Die Definition der CDRs erfolgte nach Kabat (1991).
• Abb. 6.3. : Lösungsmittel zugängliche Oberfläche der 9E10 variablen Domänen (grau) mit den somatischen Mutationen (rot). Das myc-tag-Peptid ist in Gelb gezeigt. Bei den beschrifteten Resten handelt es sich um die für die Einzelrückmutationen ausgewählten Positionen. (A.) Vorderansicht, (B.) Rückansicht und (C.) Draufsicht auf den 9E10-myc-Peptid-Komplex.
• Abb. 6.4. : Modell der Bindung eines C-terminal verlängerten myc-Peptides. (A) Die Cα-Atom-Überlagerung des myc-tag-Peptides (410-420), entnommen der Komplexstruktur mit 9E10-Fab (rot), mit der Myc-α-Helix (408-427), aus einer Kristallstruktur (grün, 1NKP) und einer ¹H-NMR-Struktur (blau, 1A93), zeigt für alle Moleküle eine gleiche α-helikale Konformation der Reste 415-420. (B) Modell einer möglichen Bindungskonformation eines C-terminal verlängerten myc-Peptides (410-427) (blau) in der Bindungstasche des 9E10 (Oberflächendarstellung). Die Konformation der Reste 410-419 (rot) entspricht der des myc-tag Peptides in der Komplexkristallstruktur.
• Abb. 6.5. : Gentechnische Herstellung einer Rückmutante am Beispiel von 9E10 H^H31S. Dargestellt sind Ethidiumbromid-angefärbte Agarosegele (2%) der (A.) gereinigten, aus dem pASK85-9E10 amplifizierten DNA-Fragmente 207 bp (1-3) und 315 bp (4-6) und (B.) des Assemblierungsproduktes (479 bp) aus der Synthese des Konstruktes pASK85-9E10(H^H31S). Die abgeschätzte DNA-Menge pro Bande beträgt ca. je 5; 15 und 50 ng. M entspricht dem Marker Smart DNA Ladder.
• Abb. 6.6. : Western-Blots der bakteriellen Produktion von Fab. Die Proben wurden zuvor in 12% nicht reduzierender SDS-PAGE aufgetrennt. (A.) Fab-Expressionsmuster zweier Klone von 9E10 (2, 3, 7 und 8) und der Rückmutante H^H31S (4, 5, 9 und 10) in JM83-Zellen (8 µl von 100 µl PP). Die Bahnen 1 und 6 entsprechen der löslichen periplasmatischen Fraktion von nicht mit dem Expressionsvektor transformierter Zellen (8 µl von 1:100 Konzentrierung der ZK). In den Bahnen 1-5 erfolgte der Nachweis der schweren Kette und in den Bahnen 6-10 der der leichten Kette, wie unter (B.) beschrieben wird. (B.) Nachweis der murinen leichten Kette (1-3) mit anti-kappa-Ig-HRP und der schweren Kette über den His-tag (4-6) mit (anti-His(6)-Ig-HRP) in der unlöslichen (je 1 µl von 1:100 Konzentrierung der ZK (1, 3, 4 und 6)) periplasmatischen Fraktion inklusive der Sphäroplasten der zur 9E10-Expression nicht induzierten (1 und 4) und induzierten (3 und 6) XL-1-Zellen. Zum Vergleich dient das lösliche Periplasma induzierter Zellen (je 18 µl von 1:100 Konzentrierung der ZK (2 und 5)). M entspricht dem Molekulargewichtsmarker.
• Abb. 6.7. : Elutionsprofil der chromatographischen Reinigung von periplasmatisch löslichem Fab 9E10 H^H31S über den His-tag, detektiert über Absorption bei 280 nm (Bereich: 0,2 AU). (1.) Auftragen des dialysierten löslichen Periplasmas auf die Säule, (2.) Waschen der Säule und (3.) Eution.
• Abb. 6.8. : Western-Blot und SDS-PAGE der 9E10-Fab-Reinigung. (A.) Western-Blot der 9E10-Fab-Reinigung aus XL-1-Zellen. Die Proben wurden in 12% nicht reduzierender SDS-PAGE aufgetrennt. Dargestellt sind die lösliche periplasmatische Fraktion (8 µl von ca. 60 ml (1)), der Durchlauf der Säule (8 µl von ca. 60 ml (2)), das Waschen der Säule (8 µl von 30 ml (3)), das Eluat (8 µl von 5 ml (4)) und das eingeengte Eluat (0,1 µg (5)). Die Bahn 6. repräsentiert das lösliche Periplasma von nicht transformierten Zellen. Die Bahn 7. enthält die Positivkontrolle aus einem nicht gereinigten 9E10 H^H31S-Fab. Der Nachweis erfolgte mit einem spezifischen Antikörper gegen das murine IgG. (B.) 15% nicht reduzierende SDS-PAGE der gereinigten Fab-Fragmente 9E10 H^H31S (2) und H^H58Y (3) sowie zum Vergleich von 9E10-Fab (1), gewonnen aus einer proteolytischen Abspaltung des Ig (Ch. Scholz), mit je 1 µg Protein. M entspricht dem Molekulargewichtsmarker.
• Abb. 6.9. : Western-Blot von rückgefalteten und gereinigten L_Keimbahn/H_Keimbahn Fab (1,5 µg). Die Proben wurden in 12% SDS-PAGE aufgetrennt. Bahn 1 zeigt die schwere Kette im Fab (ca. 46 kD) und als einzelne Kette (ca. 30 kD), nachgewiesen über den His-tag im nicht reduzierenden Lauf, Bahn 3 – die einzelne schwere Kette im reduzierenden Lauf. Gleiches gilt für die Fab-Kontrolle in Bahn 2 und 4. M entspricht dem Molekulargewichtsmarker.
• Abb.6.11. : Vergleich der Bindung des 9E10-Fab an das lösliche (A.) 20-mer c-myc(408-427)-Peptid, das mit einer höheren Affinität gebunden wird, und (B.) an das 11-mer myc-tag-Peptid in einem kompetitiven ELISA.
• Abb. 6.13. : Kompetition der Bindung von (a.) 9E10-Fab und (b., c.) von Fab der kom pletten 9E10-Keimbahnrückmutante an das immobilisierte c-myc(408-427) Peptid mit (a., b.) löslichem c-myc(408-427) bzw. (c.) einem randomisierten Peptid (LDIKLQERESRKLRQEEAEL) im ELISA.
• Abb. 6.15. : Bestimmung der kinetischen Konstanten kon und koff bei der Bindung unterschiedlicher Konzentrationen des 9E10-Fab an das (A.) myc-tag- und (B.) c-myc(408-427)-Peptid mit der SPR-Methode. Die Laufgeschwindigkeit des Puffers beträgt 10 µl/min. Die unteren Graphen zeigen die Übereinstimmung der experimentellen Daten mit dem Modell der Ein-Schritt-Bindung. Δ gibt die Abweichung zwischen den experimentell ermittelten Werten und dem mathematischen Modell an.
• Abb.6.16. : Bestimmung des K_D der Bindung des 9E10-Fab an das myc-tag-Peptid mit der SPR-Methode. SPR-Sensorgramm der Bindung unterschiedlicher Konzentrationen von 9E10-Fab an die myc-tag-Peptid beschichtete Chipoberfläche bei einer Pufferlaufgeschwindigkeit von 1 µl/min.
• Abb. 6.17. : SPR-Sensorgramm der Bindung unterschiedlicher Konzentrationen der kompletten Fab-Keimbahnrückmutante H_Keimbahn/L_Keimbahn an das c-myc(408-427)-Peptid und die Übereinstimmung der Daten mit dem Modell der Ein-Schritt-Bindung.Δ gibt die Abweichung zwischen den experimentell ermittelten Werten und dem mathematischen Modell an.
• Abb. 6.20. : Substitutionsanalysen am c-myc(408-427)-Peptid mit 9E10-Fab sowie den Keimbahnrückmutanten L_Keimbahn/H_9E10 , L_9E10/H_Keimbahn, und L_Keimbahn/H_Keimbahn . Die Substitutionsmatrizes sind von links nach rechts nach den abnehmenden Affinitäten der Fabs zum Wildtyppeptid (bestimmt mit der ELISA-Methode) sortiert. Die Kontrolle erfolgte mit dem Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten). Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und die Pfeile deuten auf Änderungen in der Selektivität. Die rote Markierung zeigt den mit einer höheren Selektivität erkannten Bereich des 9E10-Fab-Fragmentes.
• Abb. 6.21. : Graphische Darstellung der abnehmenden selektiven Erkennung der Position E^P417 bedingt durch Rückmutationen in dem Fab-Fragment L_9E10/H_Keimbahn (blau). Das 9E10-Fab (schwarz) und L_Keimbahn/H_9E10-Fab (rot) dienen dem Vergleich. Gezeigt wird die Bindung an ausgewählte an der Position 417 gegen I, K und L substituierte 20-mer c-myc(408-427)-Peptide in den Substitutionsanalysen. Die Bindung an das Wildtyppeptid in der selben Substitutionsreihe dient dem Vergleich.
• Abb.6.22. : Substitutionsanalysen am myc-tag-Peptid mit den Keimbahnrückmutanten 9E10 H^H58Y, H^H31S, G^H52S, R^H53G, S^H100hY, F^L30I, T^L91S, L_9E10/H_Keimbahn, L_Keimbahn/H_9E10 und mit 9E10-Fab zum Vergleich. Die Substitutionsanalysen sind von links nach rechts nach den abnehmenden Affinitäten (bestimmt mit der SPR-Methode) der Fab-Fragmente zum Wildtyppeptid sortiert. Die Kontrolle erfolgte mit dem Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten). Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und die Pfeile deuten auf Änderungen in der Selektivität.
• Abb. 6.23. : Graphische Darstellung der abnehmenden selektiven Erkennung des myc-tag-Peptidrestes E^P417 bedingt durch Rückmutationen in den Fabs L_9E10/H_Keimbahn und 9E10 R^H53G (A. und B.) und des Restes D^P418 bedingt durch Rückmutationen in dem Fab L_9E10/H_Keimbahn (C.). (A., C.) Gezeigt werden die Intensitäten der Bindung des 9E10 (schwarz) und L_Keimbahn/H_9E10 (rot) im Vergleich zu L_9E10/H_Keimbahn (blau) an ausgewählte an der Position 417 (A.) und 418 (C.) substituierte Peptide in den Substitutionsanalysen. In (B.) wird die Bindung der Einzelrückmutante 9E10 R^H53G (rot) an die an der Position 417 substituierten Peptide mit der der Fabs 9E10, 9E10 T^L91S (grau), L_Keimbahn/H_9E10 (gestrichelt) und L_9E10/H_Keimbahn (weiß) verglichen. Die Bindung an das Wildtyppeptid in der selben Substitutionsreihe dient dem Vergleich.
• Abb. 6.24: Substitutionsanalysen am c-myc(412-419)-Peptid mit den Fab-Keimbahnrückmutanten H^H58Y, H^H31S, G^H52S, L_Keimbahn/H_9E10 und 9E10. Die Substitutionsanalysen sind von links nach rechts nach den abnehmenden Affinitäten der Fab-Fragmente zum Wildtypen des 11-mer myc-tag-Peptides (bestimmt mit der ELISA-Methode) sortiert. Die Kontrolle erfolgte mit dem Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten). Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und der Pfeil deuten auf Änderungen in der Selektivität.
• Abb. 6.25. : Graphische Darstellung der abnehmenden selektiven Erkennung der Position E^P417 im 8-mer c-myc(412-419)-Peptid bedingt durch die Fab-Einzelrückmutation H^H31S im 9E10 (rot). Gezeigt wird die Bindung an ausgewählte an der Position 417 gegen G, L, M und Y substituierte 8-mer Peptide in den Substitutionsanalysen. Zum Vergleich ist die Intensität der Bindung an die jeweiligen Peptide der Fabs 9E10 (schwarz), H^H58Y (grau), G^H52S (gestrichelt) und L_Keimbahn/H_9E10 (weiß) gezeigt. Die Bindung an das Wildtyppeptid in der selben Substitutionsreihe dient dem Vergleich.
• Abb. 6.26. : Substitutionsanalysen am c-myc(408(E⁴⁰⁹F)-427)-Peptid mit 9E10-Fab sowie der Fab-Keimbahnrückmutante L_Keimbahn/H_Keimbahn. Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und die Pfeile deuten auf Änderungen in der Selektivität.
• Abb.6.27.: Substitutionsanalysen am c-myc(410-427)-Peptid mit 9E10-Fab sowie mit der Fab-Keimbahnrückmutante L_Keimbahn/H_Keimbahn. Die Kontrolle erfolgte mit dem Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutante). Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und die Pfeile deuten auf Änderungen in der Selektivität.
• Abb. 6.28. : Graphische Darstellung der Unterschiede in der selektiven Erkennung der Schlüsselposition E^P416 im 18-mer c-myc(410-427)-Peptid zwischen dem 9E10-Fab (schwarz) und der Rückmutante L_Keimbahn/H_Keimbahn (rot). Gezeigt wird die Bindung an ausgewählte an der Position 417 gegen A, F, I, L, M, N, Q, W und Y substituierte Peptide. Die Bindung an das Wildtyppeptid in der selben Substitutionsreihe dient dem Vergleich.
• Abb. 6.29.: Reproduzierbarkeit der Bindung von L_Keimbahn/H_9E10 an das myc-tag-Peptid in den Substitutionsanalysen. (1) Membran aus einer myc-Peptidspotsynthese getestet mit dem (a.) in vitro rückgefalteten Fab (130 µg) und dem (b.) periplasmatisch löslichen Fab (20 µg). Das Bindungssignal wurde 2 min (a.) und 5 sec (b.) lang detektiert. (2.) Bindung des in vitro rückgefalteten Fab (130 µg) an eine Membran aus einer anderen myc-Peptidspotsynthesecharge. Das Bindungssignal wurde 10 min lang detektiert.
• Abb. 6.30. : Graphische Darstellung der Reproduzierbarkeit der Intensitäten der Bindung von periplasmatisch löslichen und in vitro rückgefalteten Fab L_Keimbahn/H_9E10 an das myc-tag-Peptid in den Substitutionsanalysen. Gezeigt wird die Bindung vom in vitro rückgefalteten Fab (grau) und periplasmatisch löslichen Fab (weiß) an myc-tag-Peptide auf einer Membran aus der selben Synthese und vom in vitro rückgefalteten Fab (schwarz ) an myc-tag-Peptide aus einer unabhängigen Synthese.
• Abb. 6.31.: Längenanalysen am c-myc-Peptid. Gezeigt wird auf den Peptidspotmembranen der Einfluss der Peptidlänge auf die Affinität des 9E10-Fab und der Fab-Keimbahnrückmutanten L_Keimbahn/H_9E10, L_9E10/H_Keimbahn und L_Keimbahn/H_Keimbahn. Die Spots zeigen Peptide, die jeweils um eine Aminosäure, ausgehend von der Sequenz EQKLISEEDLL, auf AE(F⁴⁰⁹)EQKLISEEDLLRKRREQL und EQKLISEEDLLRKRREQL verlängert wurden. Die relativen Intensitäten der Bindung der Peptide sind im prozentualen Verhältnis zum 18-mer Peptid (=100%) dargestellt. Das Kontrollexperiment zeigt den Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten). Detektiert wurde bis zur Sättigung des intensivsten Signals.
• Abb. 6.33.: Bindung von 9E10-Fab und seiner Rückmutanten L_Keimbahn/H_9E10 (LKB/H9E10), L_9E10/H_Keimbahn (L9E10/HKB) sowie L_Keimbahn/H_Keimbahn (LKB/HKB) an homologe 20-mer myc-Peptide mit sequentiellen Ursprung in den murinen, avianen und viralen Myc-Proteinen. In der Bindungsanalyse mit dem substituierten 20-mer(E⁴⁰⁹F) Peptid haben alle Peptide den zusätzlichen N-terminalen Austausch E^P409F. Die Kontrollexperimente zeigen den Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten).
• Abb. 7.1. : Der N-Terminus des myc-tag-Peptides (grün) ist von den Tyrosinresten 99, 100 und 100a in der CDR-H3-Schleife umgeben.
• Abb.7.2. : Simulierte SPR-Diagramme dreier Moleküle, die mit gleicher Affinität (K_D = 10 nM) jedoch mit unterschiedlichen kinetischen Parametern interagieren. Das Diagramm A zeigt eine langsame Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeit (k_on = 10⁴ M^-1 s^-1 undk_off = 10^-4 s^-1). Im Diagramm B sind mittelschnelle Kinetiken (k_on = 10⁵ M^-1 s^-1 und k_off = 10^-3 s^-1) und im Diagramm C schnelle (k_on = 10⁶ M^-1 s^-1 und k_off = 10^-2 s^-1) zu sehen (nach Andersson, 2004).
• Abb.7.3: Modellierte Bindung des verlängerten Epitops (E⁴¹⁰QKLISEEDLLRKR⁴²³) an den 9E10. Die Aminosäuren 410-419 entsprechen der Konformation des Peptides im Komplex mit 9E10 aus der Kristallstrukturanalyse. Die Konformation der Aminosäuren 420-423 (blau) des Peptides ist modelliert. Vom 9E10-Antikörper ist die Lösungsmittel zugängliche Oberfläche dargestellt. In Rot wird die C-terminale α-Helix gezeigt.
• Abb. 7.4.: Bindung des Peptidrestes E^P417 durch die Reste H^H31, R^H53 und S^H30 im 9E10. Die Abstände zwischen den Atomen sind in Å angegeben.
• Abb. 7.5.: Interaktionen des C-Terminus (415-420) des Peptides mit dem 9E10. (A.) Darstellung der Lösungsmittel-zugänglichen Oberfläche des 9E10. Der C-Terminus des Peptides wird in einer α-helikalen Konformation erkannt, die unter anderem durch die vom 9E10 vorgeformten Bindungstaschen für die Seitenreste E^P416 und E^P417 ermöglicht wird. (B.) Darstellung möglicher intramolekularer Wasserstoffbrücken am N-Terminus der α-Helix. Eine mögliche Wasserstoffbrücke des Oγ-Atoms des S^P415 zum N-Atom der Peptidbindung an der Position i+4 kann die Fortsetzung der α-Helix am N-Terminus mimen (Rückgrat der α-Helix im c-Myc-Protein, grün). (C.) Darstellung der möglichen Wasserstoffbrücken des O-Atoms der Peptidbindung der Aminosäure H^H31, wobei wieder die Fortsetzung der α-Helix durch eine Wasserstoffbrücke zur Position i+4 gemimt werden kann (Rückgrat der α-Helix im c-Myc-Protein, grün). Die Abstände zwischen den Atomen sind in Å angegeben.
• Abb. 7.6.: Lage der Aminosäure G^H52 in der CDR-H2 der 9E10-V_H-Domäne (rot). Der Abstand zum myc-Peptidrest E^P416 (grün) beträgt 3,58 Å.
• Abb. 7.7.: Lage der Aminosäure H^H58 in der 9E10-V_H-Domäne (rot). Der Abstand zur V_L-Domäne (blau) beträgt 4,88 Å (V^L94).
• Abb. 7.8.: Dargestellt sind die Aminosäuren S^H100h in der V_H-Domäne (gelb) und T^L91 in der V_L-Domäne (blau) in der Nähe der Basis der CDR-H3. Die Aminosäure T^L91 steht im direkten Kontakt zu den Aminosäuren S^H100h und Y^H100g, während S^H100h auch einen Kontakt zu R^H95 bildet. Von den V-Domänen ist die Lösungsmittel zugängliche Oberfläche dargestellt. Das myc-tag-Peptid ist grün dargestellt.
• Abb. 7.9.: Die Aminosäure F^L30 in der V_L-Domäne ist Bestandteil eines Clusters gebildet von aromatischen Resten der CDR-H3 (rot) und CDR-L1 (blau). Das Peptid (grün) bindet außerhalb der konventionellen Bindungstasche.
• Abb. 7.10. : Bindungstasche des Peptidschlüsselrestes I^P414, die unter anderem vom 9E10-Rest T^H100d in der CDR-H3 und vom Peptid (grün) ausgekleidet wird. Beide Reste sind 3,84 Å voneinander entfernt.
• Abb. 7.12. :Bindungstasche des Peptidschlüsselrestes E^P416, die unter anderem von den CDR-H3-Resten E^H97 und Y^H100f sowie von den CDR-H2-Resten G^H52 und S^H52a ausgekleidet wird. Die Abstände zwischen den Atomen sind in Å dargestellt. Vom 9E10 ist die Oberfläche zusätzlich gezeigt.
• Abb. 7.13. : Seitenansicht (A.) und Draufsicht (B.) auf die Bindungsregion des 9E10-Antikörpers mit den charakterisierten rückmutierten Resten (rot). Die rückmutierten Einzelpositionen S^H100h , F^L30 , T^L91 sowie G^H52 haben einen Einfluss auf die Affinität, wobei S^H100h als Bestandteil der CDR-H3 und F^L30 in der CDR-L1 den größten Effekt haben. Die rückmutierten Einzelpositionen H^H31 und R^H53 verfeinern die selektive Erkennung der Peptidposition E^P417. Der neutrale Rest H^H58 ist in Gelb und die nicht charakterisierten Aminosäuren in Schwarz dargestellt. Von der V_H-Domäne ist die Oberfläche und von der V_L-Domäne das Peptidrückgrat gezeigt. Das Peptid (410-423) ist in Blau dargestellt.