Zusammenfassung

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Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Charakterisierung der Affinitäts- und Spezifitätsreifung des murinen anti-c-myc-Antikörpers 9E10. Hierfür sollten Keimbahnrückmutanten des 9E10 gentechnisch hergestellt und in ihrem Bindungsverhalten zum 11-mer myc-tag-Peptid (EQKLISEEDLN) und einer verkürzten 8-mer Variante des Epitopes (KLISEEDL) charakterisiert werden.

Die murinen Gensegmente VH3.3:39, DFL16.1 und JH4 sowie 21.2* und J1 konnten als die Keimbahngensegmente zu 9E10 identifiziert werden. Insgesamt wurden sieben Einzelrück-mutanten in den CDRs H1, H2, H3, L1 und L3, zwei komplette Rückmutanten jeweils der VH- bzw. VL-Domäne und eine komplette 9E10-Rückmutante mit insgesamt zwanzig Aminosäureaustauschen charakterisiert. Es ist gelungen die Keimbahnrückmutanten des 9E10-Antikörpers als funktionelles Fab in E. coli zu exprimieren, wobei das Protein sowohl aus der periplasmatisch löslichen Fraktion als auch durch Rückfaltung aus inclusion bodies erhalten werden konnte.

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Es wurde festgestellt, dass das 9E10-Fab an ein längeres c-myc-Peptid mit der Sequenz A408EEQKLISEEDLLRKRREQL427 mit 750-fach höherer Affinität (KD = 1,2 ± 0,3 nM, bestimmt mit der SPR-Methode) als an das kürzere 11-mer myc-tag-Peptid bindet. Das Keimbahngen-kodierte 9E10-Fab weist keine mit den hier untersuchten Methoden nachweisbare Bindung an das 11-mer myc-tag-Peptid und das verkürzte 8-mer Peptid auf. Es konnte jedoch eine Bindung des Keimbahngen-kodierten 9E10-Fabs zum immobilisierten 20-mer c-myc(408-427)-Peptid mit einer Dissoziationskonstante KD von 3,93 ± 0,04 µM (SPR) bestimmt werden. Längenanalysen am myc-Peptid zeigen, dass die Affinitätszunahme zum 20-mer Peptid auf die Verlängerung des C-Terminus zurückzuführen ist. Mit Hilfe der Substitutionsanalysen am 20-mer c-myc(408-427)-Peptid wurde das vom 9E10 erkannte Epitop um vier Aminosäuren (420-423) auf die Sequenz E410QKLISEEDLLRKR423 und die darin sehr selektiv erkannten Schlüsselpositionen um L419 auf L413ISEXXL419 erweitert. In einem Strukturmodell wird die Konformation des verlängerten C-Terminus des gebundenen Peptides als eine sich fortsetzende α-Helix vorgeschlagen.

Durch die Charakterisierung der Bindung der 9E10-Keimbahnrückmutanten an myc-Peptide unterschiedlicher Affinität konnten selbst geringe Auswirkungen der Rückmutationen auf die Affinität und Spezifität analysiert werden. Der ca. 3300-fache (SPR) Affinitätsgewinn zum immobilisierten 20-mer c-myc(408-427)-Peptid während der 9E10-Affinitätsreifung kommt durch eine Zunahme der Assoziations- und Abnahme der Dissoziationsgeschwindigkeit des Komplexes zustande, wobei die Änderungen in der Assoziationsgeschwindigkeit überwiegen. Die Reifung der VH-Domäne hat den größeren Effekt auf den Assoziationsprozess, während die der VL-Domäne stärker die Dissoziation beeinflusst. Rückmutationen in der VH-Domäne führen sowohl zu einem Affinitäts- als auch zu einem Spezifitätsverlust des 9E10-Antikörpers. Die CDR-H3 trägt einen wesentlichen Beitrag zur Affinitätsreifung. Die VL-Domäne dient dabei mit der CDR-L1 und -L3 als Bindungsplattform für die lange und flexible CDR-H3 und führt auf diese Weise zu einer höheren Affinität von 9E10. Dabei kommt der längeren CDR-L1 der VL-Domäne eine neue bedeutende Rolle zu, nämlich die der Stabilisierung der Bindungskonformation der flexiblen CDR-H3-Schleife. Der Affinitätsgewinn während der Reifung des 9E10-Antikörpers resultiert vorrangig nicht aus zusätzlichen Kontakten zum Peptid, sondern vor allem aus der Beeinflussung der Konformation oder der Flexibilität der an der Bindung beteiligten CDRs, insbesondere der CDR-H3 und -H2. Die Einzelrückmutationen der 9E10-Reste, die im direkten Kontakt zum Peptid stehen, bewirken nur einen schwachen Verlust der Selektivität zu einzelnen Positionen im Peptid. Die wesentlichen Wechselwirkungen zum humanen c-myc-Peptid sind im ungereiften 9E10-Fab bereits vorhanden. So ist die selektive Erkennung der Schlüsselpositionen LISEXXL im humanen c-myc-Peptid im Anfangsstadium der Affinitätsreifung von 9E10 bereits stark ausgeprägt und wird lediglich fein modelliert.


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30.03.2007