Einleitung

Allgemeines

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Die Evolution hochaffiner, spezifisch bindender Proteine ist noch weitgehend unerforscht. Um die Evolution von Proteinen verstehen zu können, sucht man nach den jeweiligen Vorläufergenen in verschiedenen Organismen. Die Suche nach solchen Vorläufergenen gestaltet sich jedoch schwierig. Zwar ändern sich Proteinstrukturen im Laufe der Evolution langsam, die genomischen Sequenzen unterliegen jedoch einer schnelleren Änderung. Antikörper sind Immunglobulinproteine mit einer hohen primären Diversität, die von Kiefermäulern aus dem Unterstamm der Wirbeltiere gebildet werden. Um die Evolution von Antikörpern verstehen zu können, wird nach V-Domänen-ähnlichen Immunglobulin-kodierenden Genen bei den Wirbellosen gesucht. Antikörper können in einem Organismus jedoch auch eine molekulare Evolution (Affinitätsreifung) durchlaufen. Diese molekulare Evolution in einem Organismus kann anhand bekannter Keimbahngensequenzen, die innerhalb einer Art einen überschaubaren Pool bilden, studiert werden. Bei einem Kontakt mit einem Antigen, können die in den Keimbahngensequenzen kodierten Antikörper mutieren. Dieser Prozess der Antikörperaffinitätsreifung ist Teil einer Antwort des adaptiven Immunsystems auf Krankheitserreger. Die Affinitätsreifung ist auf somatische Hypermutation in den funktionalen Genen der variablen Regionen zurückzuführen. Sie bewirkt nicht nur eine zunehmende Affinität, sondern nach gängiger Meinung auch eine höhere Spezifität des Antikörpers zum Antigen (z.B. Demirel und Lesk, 2005, Wedemayer et al., 1997, Jimenez et al., 2004). Die Entschlüsselung des Genoms und die Sequenzierung der Antikörper kodierenden V-, D- und J-Gensegmente in der Keimbahn verschiedener Organismen lieferten hierzu einen wichtigen Meilenstein. Strukturanalysen von Antikörper-Antigen-Interaktionen können dabei als Modelle für Protein-Protein- bzw. Protein-Ligand-Interaktion dienen. Viele Grundprinzipien der molekularen Erkennung konnten so definiert werden, viele Faktoren bleiben dennoch unverstanden.

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Zahlreiche Arbeitsgruppen haben sich in letzter Zeit mit den molekularen Ursachen für die hohe Affinität und Spezifität von gereiften Antikörpern beschäftigt. Die Herangehensweisen sind unterschiedlich. So werden die Bindungseigenschaften von Antikörpern gegen dasselbe Antigen aus einer primären (Keimbahn-kodiert, moderate Affinität, geringere Spezifität) und sekundären (viele Mutationen, höhere Affinität, höhere Spezifität) Immunantwort miteinander verglichen (Manivel et al., 2000). Antikörper aus derselben genetischen Linie, isoliert aus unterschiedlichen Stadien der Immunantwort und gegen dasselbe Antigen werden analysiert und Konsensusmutationen identifiziert (Li et al., 2003). Die schrittweise und kombinierte Rückmutation eines gereiften Antikörpers auf die Keimbahngensequenz ist ein gängiger Ansatz zur Studie der Affinitätsreifung von Antikörpern. Auch die Vormutation eines Keimbahngen-kodierten Antikörpers auf die Sequenz des gereiften ist ein oft gewählter Ansatz. Kombiniert man die Daten aus diesen beiden Ansätzen erhält man eine sehr effiziente Methode, um Schlüsselpositionen sowohl für die Änderungen in der Affinität als auch in der Spezifität auszumachen (z.B. Yin et al., 2001). Kooperative Effekte zwischen einzelnen somatischen Mutationen werden untersucht (z.B. Yang und Schultz, 1999). Parallel dazu läst sich die Kreuzreaktivität und Polyspezifität der Antikörper in den unterschiedlichen Reifungsstadien vergleichen (z.B. Sethi et al., 2006). Eine Vielzahl von Antikörpern gegen Haptene, aber nur wenige gegen Peptide und Proteine wurde bisher studiert. Daneben gibt es Arbeiten zur Reifung von katalytischen Antikörpern und Schwereketten-Antikörpern. Ein besonderer Schwerpunkt dieser Arbeiten liegt in der Charakterisierung des Einflusses somatischer Mutationen auf die Struktur der Antigenbindungstasche.

Die hohe Variabilität der Antikörper macht sie für neue Anwendungen insbesondere in der Humantherapie interessant. Antikörper und ihre Derivate stellen über 30% der heute in der Entwicklung befindlichen Biopharmazeutika dar (Laffly und Sodoyer, 2005). Der Einsatz von in vitro generierten Antikörpern in der Biotechnologie und als Therapeutika gewinnt dabei zunehmend an Bedeutung. Das Wissen über die Reifung von Antikörpern fließt in das Design von Antikörperbibliotheken mit ein. Die Analyse der Affinitätsreifung von Antikörpern würde nicht nur zum Verständnis der spezifischen Antwort des adaptiven Immunsystems auf Krankheitserreger führen, sie könnte zudem einen Beitrag für das Verständnis der Evolution der molekularen Erkennung von Proteinen im Allgemeinen leisten. Dabei ermöglicht die Technologie der Proteinherstellung, kombiniert mit strukturellen, thermodynamischen, kinetischen Analysen und der Charakterisierung von Proteindynamiken, das Studium von molekularen Erkennungen.

3.1  Das Adaptive Immunsystem

Die Evolution des Immunsystems bot den Wirbeltieren zum Überleben in einer artenreichen Umgebung einen hocheffizienten Verteidigungsmechanismus gegen Krankheitserreger. Ähnliche Systeme findet man auch bei Wirbellosen. So besitzen Insekten zelluläre Abwehrmechanismen, bilden Lysozym und sind in der Lage, bei Stimulation Abwehrproteine (defense proteins), wie z.B. die bakteriziden Cecropine, zu synthetisieren.

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Im Gegensatz zur angeborenen Immunität der Wirbeltiere, die eine allgemeine sofortige Antwort auf Krankheitserreger über phagozytische Zellen und Keimbahn-kodierte Proteine vermittelt, ist die adaptive Immunität spezifischer. Sie ermöglicht eine Anpassung des Organismus an eine Infektion mit sich ändernden Pathogenen durch eine Erkennung nahezu aller biologischen Moleküle. Diese spezifische Antwort ist erworben und wird von nicht Keimbahn-kodierten Rezeptoren, die in immunologischen Zellen gebildet werden, vermittelt. Die adaptive Immunität basiert auf den Reaktionen der im Blut und in der Lymphe zirkulierenden Leukozyten und insbesondere der Lymphozyten, die ihren Ursprung im Knochenmark haben. Es gibt zwei Arten von Lymphozyten: die B- und die T-Lymphozyten. Die B-Lymphozyten reifen nach einer Stimulation zu Antikörper sezernierenden Plasmazellen aus. Die Antikörper, die Antigene mit hoher Affinität und Spezifität binden, haben eine hohe Diversität, die aus einem begrenzten Pool von Keimbahngenen, generiert wird. Sie sind eine der Antworten des adaptiven Immunsystems auf eine hohe biologische Diversität von Pathogenen. Bei den T-Lymphozyten unterscheidet man zwischen cytotoxischen T-Zellen und Zellen, die B-Lymphozyten und Makrophagen aktivieren können. Die charakteristischen Merkmale der adaptiven Immunität ist das Vorhandensein von Antikörpern, T-Zellrezeptoren, MHC (major histocompatibility complex), RAG (Rekombination-aktivierende Gene) und Gewebe, in denen Lymphozyten entstehen und durch Antigene stimuliert werden. Ein adaptives Immunsystem mit den hier aufgezählten Merkmalen findet man bei Säugern, Vögeln, Reptilien, Amphibien, Knochenfischen und Knorpelfischen. Ihr Ursprung ist auf die Wirbeltiere (Gnathostomata) zurückzuführen (Cannon et al., 2002; Litman et al., 1999). Jüngste Arbeiten mit Neunaugen (exogene Fischparasiten), die zu kieferlosen Wirbeltieren gehören, belegen, dass auch jene eine adaptive Immunität entwickelt haben. Die im Neunauge entdeckten variablen Lymphozytenrezeptoren (VLR= variable lymphocyte receptor) zeigen eine somatische Diversität, die denen der Antikörper ähnlich ist (Pancer et al., 2004). Cannon et al. (2002) studierten das Genom des Lanzettfischchen (Wirbellose) und fanden Sequenzen einer variablen Multigenfamilie kodierend für zwei ununterbrochene Immunglobulindomänen und eine Chitin-bindende Domäne VCBP (V region containing chitin-binding proteins). Trotz der vielen Unterschiede der VCBPs zu Antikörpern und T-Zellrezeptoren könnten sie der Anfang der Evolution eines adaptiven Immunsystems sein, da auch VCBPs Signalpeptide zur Sekretion aufweisen, eine Chitin-bindende Domäne zur potentiellen Bindung an Parasiten und Immunglobulindomänen zur möglichen Auslösung einer Immunantwort (Litman et al., 1999). Vieles bleibt dennoch unklar und die Suche nach dem Ursprung des adaptiven Immunsystems geht weiter.

Bei der Bildung von Antikörpern, die eine spezielle Errungenschaft des adaptiven Immunsystems bei Kiefermäulern (Gnathostomata) darstellen, sind die B-Lymphozyten entscheidend. Im Folgenden wird näher auf die immunologischen Prinzipien des Menschen und der Maus eingegangen.

3.1.1  Reifung der B-Lymphozyten

Antikörper werden in immunologischen Zellen – den B-Lymphozyten gebildet. Jeder B-Lymphozyt trägt auf seiner Oberfläche einen Membran-gebundenen Antikörper, bestehend aus einer leichten und schweren Kette, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind. Werden die Zellen aktiviert, sezernieren sie den Antikörper.

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Die B-Lymphozyten gehen aus einer allgemeinen lymphatischen Vorläuferzelle im Knochenmark hervor, wo sie auch zu naiven Lymphozyten reifen. Im Knochenmark finden im Zellkern auf den Chromosomen 12 (schwere Kette der Maus), 6 (κ leichte Kette der Maus) und 16 (λ leichte Kette der Maus) Genumordnungen statt, wodurch die vererbten Gensegmente V (variable), D (divers) und J (joining) zu funktionellen Genen zusammengesetzt werden (Abb.3.1., Genumordnungen). Die variable Region der schweren Kette wird als erste gebildet. Sie setzt sich aus einem großen Pool von VH- (Maus: ~170 Gene, Riblet, 2004), D- (Maus: ~13 Gene, Riblet, 2004) und JH- (Maus: 4 Gene, Riblet, 2004) Gensegmenten zusammen. Die variable Region der leichten Kette hingegen wird nur aus den V- (Maus, κ: ~93 Gene, Martinez et al., 2001, λ: 3 Gene, Lefranc et al., 2004) und J- (Maus, κ: 5 Gene, Martinez et al., 2001, λ: 3 Gene, Lefranc et al., 2004) Gensegmenten gebildet. Die Rekombination wird über flankierende DNA-Sequenzen gesteuert und unter anderem von den speziellen Enzymen RAG-1 und RAG-2 katalysiert. Die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) ist vor allem während der Umlagerung der schweren variablen Region aktiv und baut zusätzlich Nukleotide (N-Nukleotide, nichtmatrizenkodiert) an den Verbindungsstellen der Gensegmente zufällig ein und erhöht damit die Diversität dieser Bereiche. Ist die somatische Rekombination abgeschlossen, werden auf der Oberfläche der Zellen membrangebundene monospezifische Antikörper exponiert. Dieses Prinzip der Präsentation von Antikörpern auf der Zelloberfläche ermöglicht eine direkte Verknüpfung des Phänotypens des Antikörpers mit seinem Genotypen. Solche Genumordnungen ermöglichen aus einer kleinen Zahl von Gensegmenten eine große Vielfalt zu erzeugen. Kombiniert man dazu die verschiedenen leichten und schweren Ketten untereinander, ist eine theoretische Variabilität von ca. 106 möglich. Jedoch sind nicht alle Ketten untereinander kombinierbar und einige Gensegmente werden häufiger verwendet als andere. Die Diversität der Fragmente wird jedoch nochmals durch den späteren Prozess der Hypermutation (Abb. 3.1., Affinitätsreifung) gesteigert. Entwickeln die Zellen eine Bindung an körpereigene Substanzen, werden sie eliminiert oder inaktiviert.

Abb.3.1. : Schematische Darstellung der Bildung eines Antikörpers in B-Lymphozyten. Gezeigt sind die Genumordnungen der murinen H- und L-Kettengene (am Beispiel der κ-Kette) im Knochenmark und die Hypermutationen in den variablen Regionen während der Antikörperaffinitätsreifung in den Keimzentren.

Nach der Reifung gelangen die B-Lymphozyten über das Blut in die Lymphe und somit in die so genannten peripheren lymphatischen Organe, zu denen die Lymphknoten, die Milz und das lymphatische Gewebe der Schleimhäute zählen, und treffen dort auf Antigene, die ebenfalls zu diesen Orten transportiert und festgehalten werden. So z. B. bekommen in den Keimzentren von Follikeln der Lymphknoten die B-Lymphozyten Kontakt zu ihrem spezifischen Antigen und zur T-Lymphozyten, die sie zu Proliferation stimulieren. Bindet ein Oberflächenrezeptor eines B-Lymphozyten an ein Antigen, erzeugt diese Zelle identische Nachkommen mit der gleichen Spezifität (klonale Selektion). Die Bindung eines Antigens an einen B-Zellrezeptor hat für die Zelle die folgenden zwei Konsequenzen: Die Signaltransduktion, die zur Aktivierung der B-Zelle führt, und die Endozytose des Antigen-B-Zellrezeptor-Komplexes, die zur Fragmentierung des Antigens und zur Peptidpräsentation auf den MHCs führt. Bei einer thymusabhängigen Stimulation binden zusätzlich T-Zellrezeptoren spezifisch an Peptid-MHCII-Komplexe der B-Lymphozyten, die wiederum spezifisch an ein Antigen gebunden und dieses über Endozytose aufgenommen haben. Die Stimulation der B-Lymphozyten löst in den Genen der variablen Regionen den für die Affinitätsreifung der Antikörper entscheidenden Prozess der somatischen Hypermutation aus. Verbunden mit der Hypermutation werden Zellen mit hochaffinen Rezeptoren selektiert. Pro Zellteilung mutiert in den betroffenen Regionen ein Basenpaar pro 1000 Basenpaare. Bezogen auf die Länge der variablen Regionen kann in jeder zweiten Zelle während der Zellteilung eine Aminosäure im Molekül mutiert werden. Diese Mutationen häufen sich insbesondere in so genannten hot spot-Regionen auf der DNA. Die DNA-Polymerasen erkennen die Motive WA (A/T, A), TW (T, A/T) und RGYW (A/G, G, C/T, A/T) als hot spots (Rogozin et al., 2001). Das Enzym AID (activation-induced deaminase) löst den Prozess durch die Deaminierung der Base Cytosin zu Uracil aus (Noia und Neuberger, 2002). Diese Deaminierung kann zu einer Transition während der Replikation führen oder zu einem Austausch der modifizierten Base durch die UDG (uracil DNA glycosylase) mit anschließender Reparatur der DNA. Die Affinitätsreifung von Antikörpern wird vor allem in T-Lymphozyten abhängigen Immunantworten beobachtet. In dieser molekularen Evolution werden Antikörpermutanten mit einer hohen Rate als Konsequenz auf den Antigenkontakt generiert und hochaffine Mutanten selektiert. Führen die Mutationen zu einer schlechteren Bindung an das Antigen, das von follikulären dendritischen Zellen präsentiert wird, sterben die Zellen. Es herrscht eine ständige Konkurrenz zwischen Antikörpern mit geringerer und höherer Affinität um die Bindung und Aufnahme der Antigene. Nur solche B-Lymphozyten können der Apoptose entgehen, die ein Antigen endocytiert haben und Peptide auf den MHCII-Rezeptoren für eine Stimulation durch T-Lymphozyten präsentieren konnten. Die Beteiligung der T-Lymphozyten an der Selektion stellt zudem sicher, dass B-Lymphozyten mit Bindung an körpereigene Antigene nicht selektiert werden. Stille Mutationen unterliegen ebenfalls einer positiven Selektion. Die T-Lymphozyten vermitteln auch den Klassenwechsel durch DNA-Umlagerungen, wodurch Antikörper mit verschiedenen Effektorfunktionen gebildet werden können. Die selektierten B-Lymphocyten differenzieren weiter zu Antikörper sezernierenden Plasmazellen oder zu Gedächtniszellen. Die thymusunabhängige Reifung bewirkt weder einen Isotypenwechsel noch eine Gedächtniszellausbildung, sie kann aber eine Rolle bei der Reifung von B-Lymphozyten gegen Nichtproteinantigene spielen. Sind die Zellen zu Effektorzellen ausdifferenziert, verlassen sie die Lymphknoten.

3.2 Antikörper

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Antikörper sind wichtige Bestandteile der humoralen Immunantwort. Sie besitzen die Fähigkeit, mit nahezu jedem Antigen hochaffine und spezifische Bindungen einzugehen. Ihre Erforschung begann 1890 durch Behring und Kitasato, die im Blutserum einer geimpften Person Antikörper entdeckten. In B-Zellen gebildet, werden Antikörper bei einer Infektion des Organismus in großen Mengen sezerniert und leisten einen bedeutenden Beitrag zur Bekämpfung eines Pathogens. Im Jahre 1975 gelang es Köhler und Milstein (Köhler und Milstein, 1975) murine monoklonale Antikörper bekannter Spezifität mit der von ihnen etablierten Hybridomtechnologie unbegrenzt zu produzieren. Sie fusionierten einen spezifischen Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten mit einer speziellen Myelomzelle und schufen damit eine hybride unsterbliche Myelomzelllinie. Damit waren auch Sequenzierungen von Antikörpern bestimmter Spezifität im großen Umfang möglich. Nach der ersten dreidimensionalen Struktur 1975 durch Edmundson et al. (Edmundson et al., 1975) sind zahlreiche weitere Strukturen von Antikörpern, insbesondere von den Antigen-bindenden Fragmenten, geklärt worden. Detaillierte Informationen zur ererbten genetischen Kodierung der Antikörper waren über die Sequenzierung von Keimbahngenen oder cDNA-Kopien möglich. Mit dem Maus-Genomprojekt ist nun auch das gesamte Genom der Maus mit allen genetisch kodierten Bestandteilen des Immunsystems sequenziert worden (Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002).

Antikörpermoleküle werden mittlerweile gut verstanden. Neben ihrer Eigenschaft Antigene zu binden, werden zahlreiche Antikörper mit katalytischen Aktivitäten beschrieben. Viele dieser katalytischen Antikörper wurden in vitro aus großen kombinatorischen Bibliotheken generiert. Schultz und Lerner (Schultz und Lerner, 2002) postulieren eine weitere immunologische Bedeutung von Antikörpern. Diese liegt darin, mittels katalytischer Aktivität Pathogene oxidativ zu zerstören. Ihre Annahme basiert auf der Beobachtung, dass alle Antikörper eine intrinsische Fähigkeit zur Oxidation von Wasser zu Wasserstoffperoxid und anderen reaktiven Sauerstoffarten besitzen. Die Rolle nach einer biologischen Bedeutung katalytisch aktiver Antikörper bleibt zurzeit dennoch offen.

Antikörper finden in der wissenschaftlichen Forschung und Medizin eine breite Anwendung als diagnostische Sonden und Therapeutika zur spezifischen Bindung von Zielmolekülen. Insbesondere murine Antikörper werden aufgrund ihrer leichten Gewinnung weit erforscht. Diese Fülle an Informationen und Daten zur Antikörpern ermöglichen weitergehende Arbeiten zur molekularen Entstehung der Affinität und Spezifität dieser Moleküle. Mit der Erforschung der molekularen Evolution von Antikörpern, die sich in einem lebenden Organismus vollzieht, will man weiterhin auch die Evolution von hohen Affinitäten in Protein-Ligand-Interaktionen verstehen lernen und dieses Wissen dazu nutzen, in künstlichen Bibliotheken Proteine mit veränderten Bindungseigenschaften herzustellen (z. B. Antikörperdesign).

3.2.1  Struktur und Funktion

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Antikörper gehören zur der großen Immunglobulinsuperfamilie, zu denen auch die T-Zell-rezeptoren, die MHCs und NKRs (NKR = natural killer cell receptor) gehören (Barclay et al, 1997). Immunglobulindomänen findet man auch in Muskelproteinen und Kinasen innerhalb der Zelle (Harpaz und Chothia, 1994). Aber auch in wirbellosen Tieren und in einigen Bakterien sind Immunglobulindomänen gefunden worden (Teichmann und Chothia, 2000; Holmgren und Branden, 1989). Immunglobulindomänen kommen in einer Vielzahl von Proteinen vor, die keine umfangreiche Diversität aufweisen (Kaufman, 2002). Die Proteine dieser Klasse kennzeichnen sich durch die Immunglobulinfaltung mindestens einer ihrer Domänen. Diese wiederum bestehen aus zwei β-Faltblättern, die über konservierte Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Es wird zwischen den C- und V-Domänen in Antikörpern unterschieden. Die V-Domänen besitzen einen zusätzlichen Strang in jedem Faltblatt und spielen die wesentliche Rolle in der Antigenerkennung. Die C-Domänen dagegen lösen durch Bindung an Rezeptoren einen Effektormechanismus zur Eliminierung eines Pathogens aus, wobei die unterschiedlichen Immunglobulinklassen, die von den C-Domänen gestellt werden, auch unterschiedliche Antworten auslösen. Proteine, die der Immunglobulinsuperfamilie angehören, sind an Erkennungsprozessen, wie der Antigenerkennung und der Zell-Zell-Interaktion beteiligt. Antikörper im Menschen und in der Mausexistieren in fünf verschiedenen Klassen (IgG, IgE, IgA, IgM und IgD) und unterteilen sich nochmals in Subklassen (Maus: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3; Mensch: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2). Sie unterscheiden sich in der Struktur ihrer C-Domänen, der Verteilung im Körper und der biologischen Funktion. Antikörper übernehmen so eine Rolle von Adaptermolekülen zwischen der spezifische Erkennung eines Antigens durch den Fab-Teil und das Auslösen einer immunologischen Antwort durch Interaktionen des Fc-Teils mit Effektormolekülen (Fc-Rezeptoren und Komplementproteine) des Immunsystems. Antikörper werden von zwei leichten und zwei schweren Ketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 3.2.A.), gebildet.

Abb. 3.2. : Darstellung eines IgG und einer variablen Domäne. (A.) Peptidrückgrat der leichten (blau) und schweren Kette (rot) mit den jeweiligen Domänen. Die Kohlenhydrate sind grün dargestellt. (B.) V-Domäne am Beispiel der leichten Kette mit den β-Strängen (hellblau) und den CDRs (rot) (nach Harris et al., 1998).

Die Fab-Teile setzten sich gleichermaßen aus jeweils zwei variablen (V-Domänen, Fv) und zwei konstanten Domänen (C-Domänen) der leichten und schweren Kette zusammen. Eine Ausnahme macht die zusätzliche Klasse der Schwereketten-Antikörper, denen die leichte Kette fehlt. Diese Antikörper wurden als erste in Kameliden beschrieben (Hamers-Casterman et al., 1993). Die Fc-Teile variieren in der Anzahl der konstanten Domänen (IgM und IgE jeweils drei statt zwei) und bestehen nur aus der schweren Kette. Die posttranslationale Modifizierung der konstanten Domänen mit Kohlenhydraten spielt eine wichtige Rolle in der spezifischen Wechselwirkung der konstanten Domänen mit Rezeptoren und eine in der korrekten Antikörperfaltung (Wright und Morrison, 1997). Die Gelenkregion (hinge), die sich zwischen der C1- und der C2-Domäne befindet, kann in der Länge variieren und ist glykosylierbar. Ihre Bedeutung liegt in der Flexibilität des Fc-Teils, die entscheidend für die Bindung an den entsprechenden Fc-Rezeptor ist (Burton, 1990). Der IgE-Antikörper besitzt zusätzlich noch eine Gelenkregion zwischen der C2- und C3-Domäne. Die V-Domänen variieren in ihrer Sequenz, daher auch die Bezeichnung V (variable). Die Sequenzvariabilität verteilt sich jedoch ungleichmäßig und konzentriert sich in drei Loop-Regionen, die als hypervariable Regionen (CDRs, Abb. 3.2.B.) benannt werden und an der Antigenbindung beteiligt sind. Konservierte Aminosäuren findet man bevorzugt in den vier Gerüstregionen (FR), die auch die β-Faltblätter, bestehend aus vier bzw. fünf β-Strängen, ausbilden und die strukturelle Basis der Domäne bestimmen. Die variablen Domänen bestehen somit aus einer strukturell und sequenziell variablen Bindungsregion (hauptsächlich CDRs) und einem konservierten Gerüst (FRs).

3.2.2 Molekulare Basis der Antikörper-Antigen-Erkennung

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Antikörper können in ihrer Bindungstasche Antigene unterschiedlicher Größe, Form und Ladung (Haptene, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate und Nukleinsäuren) reversibel binden. Diese Komplexbildung zwischen dem Antigen und dem Antikörper lässt sich thermodynamisch und kinetisch beschreiben. Die Bindung im Komplex ist nicht-kovalenter Natur und kommt durch eine Vielzahl schwacher Wechselwirkungen zustande. Die stärkste dieser Wechselwirkungen ist die elektrostatische Wechselwirkung permanent geladener Gruppen. Sie verliert jedoch stark an Attraktivität in wässriger Umgebung durch die hohe Dielektrizitätskonstante des Wassers. Van-der-Waals-Kräfte und Wasserstoffbrücken-bindungen (12-38 kJ/mol) liefern in der Summe der Bindungen über die gesamte Kontaktfläche hohe Affinitäten. Wesentlich für die freie Energie der Bindung sind auch die hydrophoben Wechselwirkungen, wobei ihre Stärke proportional der dem Wasser abgewandten Oberfläche ist. Hydrophobe Kontakte können durch den Entropiegewinn des Wassers zu einem großen Anteil der freien Energie der Bindung beitragen. Effektiv sind die beschriebenen Interaktionen in einer Distanz von 1-3 Å. Die Antigen-Fab-Komplexbildung ist der vereinfachten Reaktion in der Abb. 3.3. zu entnehmen.

Abb.3.3. : Komplexbildung zwischen einem Antigen (Ag) und einem Fab-Fragment eines Antikörpers nach einem Ein-Schritt-Mechanismus. Die Gleichgewichtsassoziationskonstante KA und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD ergeben sich aus den kinetischen Konstanten für die Assoziation (ka) und die Dissoziation (kd).

Die thermodynamische Eigenschaft dieser Bindung im Gleichgewicht lässt sich über die Gleichgewichtskonstante KA bestimmen, die eine Aussage über die Stärke (Affinität) der Assoziation zwischen zwei Molekülen macht. KA beschreibt die Bildung des Komplexes, während der Zerfall der Komplexe von dem reziproken Wert - der Gleichgewichts-dissoziationskonstante KD - beschrieben wird. Die Geschwindigkeit mit der sich der Komplex ausbildet, wird mit der Geschwindigkeitskonstante ka (Assoziation, kon) und der Zerfall mit der Konstante kd (Dissoziation, koff) wiedergegeben. Gibt es keine großen Konformations-änderungen beider Bindungspartner, so kann die Assoziation sehr schnell ablaufen. Bei sehr schnellen Kinetiken wird die Diffusion der Moleküle für die Reaktion geschwindigkeits-bestimmend. Diffusions-kontrollierte Prozesse liegen dann im Bereich von 109 - 1011 M-1 s-1 für den ka und 109 - 1012 s-1 für den kd (Ferscht, 1999). Die Assoziations-geschwindigkeitskonstante von Protein-Interaktionen wird stark von der Geometrie der Interaktion und der elektrostatischen Anziehungskräfte beeinflusst und kann untere Werte von 104 M-1 s-1 erreichen. Sehr stabile Komplexe können langsam bis in einen Bereich von kd = 10 s-1 dissoziieren, wenn starke Kräfte, die für die Bindung zuständig sind, überwunden werden müssen.

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Biologisch relevante KD-Werte befinden sich im Bereich ≤ 10-3 M, wie unter anderem am Beispiel von Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen berichtet wurde (Müller-Loennies et al., 2000). Die Affinitäten von in vivo gebildeten Antikörpern reichen vom µM- bis in den pM- und in einem bekannten Fall sogar bis in den sub pM-Bereich (Rathanaswami et al., 2005), obwohl Foote und Eisen (1995) in vivo eine Affinitätsobergrenze von 100 pM angeben. Demnach haben B-Zell-präsentierte Antikörper mit einer Affinität unterhalb dieser Grenze keinen Selektionsvorteil. Der Grund hierfür sei die Unfähigkeit der Zellen, bedingt durch den Endozytoseprozess, langsamere Dissoziationskinetiken der Oberflächenrezeptoren zu unterscheiden. Die Selektionsgrenze für kd wird von den Autoren auf 10-3-10-4 s-1 geschätzt. Ein maximaler ka für die Bindung eines Antigens an einen Antikörper liegt nach Foote und Eisen (1995) bei 105-106 M-1 s-1. Eine von den Diffusionskoeffizienten der reagierenden Moleküle kontrollierte Kinetik bringt keinen Selektionsvorteil mehr. Dieses Limit wäre mit somatischen Punktmutationen nicht mehr zu überwinden.

Ein in vitro generierter Antikörper wurde in der Literatur mit KD im fM-Bereich (48 fM) beschrieben (Boder et al., 2000). Dieser selektierte Antikörper demonstriert, dass Antikörper nicht für die in vivo Obergrenze für die Affinitätsreifung verantwortlich sind. Die freie Energie der Bindung ΔG (= ΔH-TΔS) biologischer Reaktionen ist stark exergonisch und liegt im Bereich von -20 bis -80 kJ/mol.

Zahlreiche Methoden wie zum Beispiel der ELISA, die Isotherme Titrationskalorimetrie, die Gleichgewichtsdialyse, das Radioimmunassay (RIA), die Fällung, die Filtration, die Fluoreszenzmessungen und die SPR (su r face plasmon resonance, Oberflächen-plasmonresonanz) wurden entwickelt, um Bindungsgleichgewichte und Kinetiken der Antigen-Antikörperkomplexe zu studieren. Mit der Methode von Friguet et al. ist es möglich, mit einem kompetitiven ELISA Gleichgewichtskonstanten der Bindung in Lösung zu messen (Friguet et al., 1985). Diese Methode erfordert keine Markierung des Antikörpers oder des Antigens, womit sichergestellt wird, dass die gemessenen Konstanten charakteristisch für den nativen Antikörper bzw. das native Antigen sind. Messungen nach der SPR-Methode (Jonsson et al., 1991) erlauben zusätzliche Aussagen über die Kinetiken der Komplexbildung an immobilisierten Liganden.

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Bei nicht-kovalenten Bindungen ist die freie Energie einer Bindung abhängig von der Komplementarität der wechselwirkenden Oberflächen, die zur Verstärkung attraktiver und zur Minimierung abstoßender Wechselwirkungen führen. Die Spezifität eines Antikörpers definiert sich aus der Diskriminierung zwischen vielen Substanzen im Bezug auf die Bindung in der Bindungsregion und drückt aus, dass die Reaktion mit dem zur Immunisierung verwendeten Antigen am stärksten ist. Die höhere Affinität zu spezifischen Liganden resultiert demzufolge in stärkeren Interaktionskräften zwischen der Bindungsregion des Antikörpers und der des Antigens. Insbesondere die elektrostatischen Wechselwirkungen können eine große Rolle für die Bindungsspezifität spielen. Durch die Minimierung der Wasser-exponierten apolaren Moleküloberfläche wird die freie Energie der Bindung dadurch negativer, dass z.B. bei der Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes an der Moleküloberfläche lokalisierte Wassermoleküle freigesetzt werden,wodurch die Entropie des Wassers steigt. Die Diskriminierung großer Antigene oder ihrer Reste gegenüber kleinen ist einfach zu erklären. Antigenbindungstaschen können zu klein sein, um größere Antigene (Reste) zu binden. Für kleinere Antigene oder Antigenreste treten dagegen keine sterischen Hinderungen auf. Es kann aber zum Verlust der freien Bindungsenergie führen, wenn z. B. in einem Antigenrest, der in einer hydrophoben Seitenrestbindungstasche des Antikörpers gebunden wird, eine Methylgruppe durch einen Austausch des Seitenrestes wegfällt, wie z. B. bei der Umwandlung von Alanin in Glycin. Antigene mit einem Alaninrest werden somit spezifischer gebunden als solche mit einem Glycin an derselben Position. Das heißt also, eine maßgeschneiderte Bindungstasche kann die Abwesenheit von Gruppen erkennen. Selbst bei gleich großen Aminosäureresten, wie z.B. bei Threonin und Valin, kann zwischen der polaren Hydroxy- und der apolaren Methylgruppe unterschieden werden. Die Komplementarität zweier Oberflächen kann durch den Austausch von kontaktierenden AS-Resten oder nicht-kontaktierenden Resten, die die Konformation der kontaktierenden Reste beeinflussen, erreicht werden.

Ist die Antikörperbindungstasche und/oder das Antigen flexibel, können Abstände der Kontaktoberfläche angepasst werden. Hieraus resultiert auch die Hypothese des induced fit für Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Der induced fit-Mechanismus (induzierte Anpassung) beschreibt den Prozess der dynamischen Erkennung des Antigens. Die Antikörperbindungstasche ist erst nach der Bindung des Antigens dazu komplementär. Dahingegen wird nach dem lock and key-Mechanismus (Schloss-Schlüssel) das Antigen nur dann gebunden, wenn es zur Bindungstasche des Antikörpers komplementär ist (Abb. 3.4.). Eine Kreuzreaktivität bezeichnet die Bindung verschiedener Substanzen in derselben Bindungstasche, wenn diese Substanzen ähnliche Kontaktflächen haben. Dieses Bindungsverhalten von Antikörpern wird als Strukturselektivität bezeichnet. Die strukturellen Änderungen in der Struktur der Bindungsstelle können sich stark auf die Affinität auswirken. So kann eine reduzierte Flexibilität des Antigens und der Bindungsregion des Antikörpers die freie Bindungsenergie aufgrund eines günstigeren Beitrages der Entropie positiv beeinflussen und somit zu einer erhöhten Affinität beitragen.

Abb.3.4. : Schematische Darstellung des (A.) induced fit- und des (B.) lock and key-Bindungsmechanismus. Die Antikörperbindungstaschen sind in grau und die Antigene farbig gezeichnet.

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Die höchsten Bindungskonstanten (pM-Bereich) wurden vor allem bei Antikörpern gegen kleine starre Moleküle gefunden, während Antikörper gegen Moleküle mit einer Vielzahl von Freiheitsgraden (z.B. Peptide) eher Bindungskonstanten im μM-Bereich aufweisen. Merkmale, die eine Kreuzreaktivität ermöglichen, können eine lückenhafte Komplementarität der interagierenden Oberflächen und eingeschränkte Seitenketten-Umlagerungen sein. Die Polyspezifität hingegen kommt durch die Bindung strukturell verschiedener Substanzen und damit einem unterschiedlichen Bindungsmodus zustande. Für gewöhnlich werden z.B. Haptene und kurze Peptide, in Taschen oder Gruben zwischen den variablen Domänen der schweren und leichten Kette gebunden. Ein gängiges Merkmal der Antikörper-Peptid-Wechselwirkung ist das β-Turn-Motiv des Peptides (Sundberg und Mariuzza, 2002). Große Antigene, wie z.B. Proteine, werden dagegen über ein großes Areal gebunden. Wassermoleküle können den Fit in der Antigen-Antikörper-Interaktionsfläche verbessern und als Adaptermoleküle beim Fehlen einer optimalen Komplementarität fungieren. Den Wassermolekülen kommt hiernach eine wichtige Rolle in der Antigenbindung zu.

3.2.3 Antikörperdesign

Zum Studium der Antigenbindungsfähigkeit des Antikörpers lassen sich die Antigen-bindenden Fragmente als Fab, F(ab)2, Fv (v = variable), scFv (sc = single chain) mit flexiblen Polypeptidlinker, dsFv (ds = disulfide), Diabody (scFv)2 und scFv-Fusionsproteine gentechnisch herstellen, wobei die Fragmente Fab und F(ab)2 auch durch proteolytische Abspaltung vom kompletten Antikörper zu gewinnen sind. Die Herstellung solcher auf einzelne Funktionen reduzierter Antikörper ermöglicht eine gezielte Charakterisierung und Modifikation der jeweiligen Domänen. Zudem ist die Anwendung kleinerer Antikörperfragmente in einigen medizinischen Anwendungen aufgrund ihrer geringeren Immunogenität und höheren Mobilität (Gewebegängigkeit) sinnvoller. Die in der Molekularbiologie gut etablierte PCR-Technik ermöglicht die Amplifikation von DNA der variablen Regionen und nachfolgende genetische Manipulationen, wie z. B. die ortsgerichtete Mutagenese.

Die gentechnisch hergestellten Antikörperfragmente können in vivo oder in vitro synthetisiert werden. In vivo Expressionen von korrekt gefalteten und funktionellen Antikörpern oder Antikörperfragmenten sind in transgenen Pflanzen und Tieren (Hiatt et al., 1989, Pollock et al., 1999), in Hefe (Ning et al., 2003), im Bakulovirus-Expressionssystem (Cao et al., 2004), in Säugerzellkulturen (Grunberg et al., 2003) und in Bakterien wie E. coli (Fernandez et al., 2004) beschrieben worden. Die zellfreie Proteinsynthese in vitro (Jiang et al., 2002) ist eine alternative Methode zur Antikörperproduktion, jedoch zurzeit nur im Labormaßstab möglich. Die Expression kleiner Antikörperfragmente (z.B. scFv oder Fab) in E. coli bietet die Möglichkeit der schnellen und billigeren Produktion bedingt durch das schnelle Wachstum und die einfache Kultivierung der Zellen. E. coli läst sich einfach mit gentechnisch veränderten Konstrukten (Plasmidvektoren) transformieren. Die Expression in E. coli wird durch die N-terminale Fusion von Antikörperfragmenten mit Signalpeptiden erreicht, die das Protein ins Pepriplasma, wo Chaperone die Faltung und die Ausbildung von Disulfidbrücken unterstützen, delegieren. Auch korrekt im Cytoplasma gefaltete Fabs (Levy et al., 2001) oder über den α-Hemolysin Weg sekretierte (Fernandez et al., 2000) wurden beschrieben. Jedoch können nicht alle Antikörperfragmente in E. coli exprimiert werden. Gründe hierfür sind Faltungsprobleme, Cytotoxizität, proteolytischer Abbau, Aggregation oder die Notwendigkeit der Glykosylierung.

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Künstliche Antikörperbibliotheken eröffnen die Möglichkeit, Antikörper mit gewünschten Eigenschaften aus einem großen Repertoire zu selektieren. Künstliche Antikörperbibliotheken können das Immunsystem, z.B. in der Generation, von Antikörpern gegen Autoantigene, physiologisch instabile oder toxische Haptene oder gegen Übergangszustandsanaloga für die Selektion neuer Katalysatoren übertreffen. Die Phagen-Display-Technik (McCafferty et al., 1990), das Bakterien-Display (Samuelson et al., 2002), das Hefe-Display (Feldhaus et al., 2003), die APEX-Technologie (anchored periplasmic expression, Harvey et al., 2004), die eine Verankerung von Proteinen an die periplasmatische Seite der inneren Membran von E. coli erlaubt, die in vitro Display-Technologien, wie das Ribosomen-Display (Groves und Osbourn, 2005), und das m-RNA-Display (Hanes et al., 2000) mit einer Diversität von bis zu 1014 Molekülen und einige weitere neue Antikörper-Display-Technologien wurden hierfür etabliert. Die strukturelle Diversität von Antigenen ist weitaus höher als die Diversität dieser Bibliotheken. Normalerweise erfolgt in den in vitro Selektionsmethoden keine begleitende Affinitätsreifung der Antikörper wie in den B-Lymphozyten, die zur einer höheren Variabilität führt. Das Ribosomen-Display ahmt die natürliche in vivo Affinitätsreifung von allen anderen in vitro Methoden am besten nach. Beim Ribosomen-Display werden Punktmutationen, die die Affinität und Spezifität erhöhen können, während der reversen Transkription und der PCR-Amplifikation nach einer jeden Selektionsrunde eingebaut. Mit dem Verständnis der Affinitätsreifung von Antikörpern und der Identifikation von hot spot-Positionen könnte man mit einer limitierten Anzahl von Mutationen die zum Erfolg führende Diversität einer Bibliothek erhöhen. Das Ziel der in vitro Evolutionsmethoden ist es, mit den in vivo Reifungsmechanismen bezüglich Affinität und Spezifität der Antikörper konkurrieren zu können.

3.3 Der anti-c-myc-Peptid-Antikörper 9E10

Der monoklonale Antikörper 9E10 (IgG1/κ) wurde aus einer Maus des Stammes Balb/c isoliert, die zuvor mit einem synthetischen Peptid immunisiert wurde, dessen Sequenz Teil einer α-Helix des humanen p62c-Myc-Protoonkoproteins (A408EEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA439) ist (Evan et al., 1985). Diese Region ist direkt in einer Interaktion mit dem Max-Protein involviert (Blackwoodund Eisenmann, 1991). Das c-Myc-Protein spielt eine wesentliche Rolle in der Regulation des Zellzyklus. Eine abnormale Expression des Gens dieses Transkriptionsfaktors findet man in maligne entarteten Zellen. Die Kristallstruktur in der Abbildung 3.5. zeigt die Wechselwirkung von Regionen des humanen c-Myc- und Max-Proteins mit einem DNA-Fragment (Nair et al., 2003). Daneben ist die Ausbildung eines coiled coil (superspiralisierte α-Helices) zwischen zwei α-Helices des Myc(393-434)-Proteins mit den Aminosäureresten 408-434 und des Max-Proteins gut zu erkennen. Daten aus einer 1H-NMR-Struktur (Lavigne et al., 1998) belegen die Interaktion zwischen den α-Helices dieser beiden Proteine. Das humane p62c-Myc-Protein kann spezifisch mit dem 9E10-Antikörper im Elektroblot detektiert werden. Die native Konformation als auch eine denaturierte Form des Proteins wird laut Evan et al. (1985) vom 9E10-Antikörper nicht erkannt. Diese Eigenschaft ließ sich mit der Art der Bindung des Peptides begründen, wie durch die Klärung der Komplexkristallstruktur (9E10/myc-tag-Peptid) gezeigt werden konnte (Krauß et al., 2007) und im späteren Teil der Arbeit näher erläutert wird.

Abb.3.5. : Darstellung des Peptidrückgrates der Proteine Myc (grau) und Max (blau), die untereinander und mit der DNA (gelb) interagieren, aus einer Kristallstruktur. Hervorgehoben sind die α-helikalen Aminosäurereste 408-434 (rot) in einer α-Helix des Myc-Proteins, die mit der des Max-Proteins zu einem coiled coil assoziiert sind (nach Nair et al., 2003, 1NKP).

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Das Peptid E410QKLISEEDL419 wurde als das Epitop des 9E10-Antikörpers beschrieben und wird als Affinitätstag zur Detektion und Reinigung rekombinanter Proteine eingesetzt (Munro und Pelham, 1986; LaVallie und McCoy, 1995). Die häufig verwendete myc-tag-Sequenz EQKLISEEDLN mit der zusätzlichen C-terminalen Aminosäure N, die das Original L ersetzt, fällt auf eine spezielle Vektorkonstruktion zurück (z. B. Hoogenboom et al., 1991). Paschke et al. (2001) entwickelten einen mit einer Tev-Protease versehenen myc-tag, den MyCUT-tag mit der Sequenz EQKLISEENLYFQG, der zur proteolytischen Abspaltung rekombinanter Phagen vom gIIIp-Fusionsprotein verwendet wird. Der 9E10-Antikörper findet also eine breite Anwendung in der medizinischen Krebsforschung und der Biotechnologie zur spezifischen Detektion des humanen c-Myc-Proteins und des myc-tags. Jedoch wurde auch später eine Kreuzreaktivität des 9E10-Antikörpers mit dem murinen c-Myc-Protein von Mai, Martensson und Siegel berichtet (Mai und Martensson, 1995; Siegel et al., 1998).

Die 9E10 variablen Regionen wurden sequenziert und rekombinant als scFv bzw. in Fusion mit murinen konstanten Regionen als Fab in E. coli exprimiert (Fuchs et al., 1997 und Schiweck et al., 1997). Die Sequenz der VH-Domäne zeigt eine sehr lange CDR-H3 bestehend aus 18 Aminosäuren. Auch die VL-Domäne weist eine um 4 Aminosäuren verlängerte CDR-L1 auf. Schiweck et al. zeigten weiterhin, dass eine einzeln in E. coli exprimierte 9E10 VH-Domäne mit der verlängerten CDR-H3 löslich ist, jedoch keine Bindung an das myc-tag-Peptid der Sequenz EQKLISEEDLN aufweist.

Ein KD der Bindung von 9E10-Fab an ein myc-tag-Peptid, das N-terminal mit einem Fluorophor (Abz, 2-Aminobenzoesäure) versehen ist, wurde mit 80 ± 5 nM mittels Fluoreszenztitration bestimmt (Schiweck et al., 1997). Andererseits wird ein höherer KD von 560 ± 190 nM zum nicht markierten myc-tag-Peptid für einen 9E10-IgG im kompetitiven ELISA von Hilpert definiert (Hilpert et al., 2001). Ein niedriger KD von 190 ± 36 nM kommt aber bei einer Bindung zu einem modifizierten myc-tag-Peptid (EQKLISEFELN) zustande, dessen Sequenz den Substitutionsanalysen am myc-tag-Peptid entstammte (Hilpert et al., 2001). Das kürzeste vom 9E10-Antikörper noch gebundene Peptid ist ein 8-mer mit der Sequenz KLISEEDL und wird mit einem KD von 26 ± 19 µM gebunden (Hilpert et al., 2001). Eine Modifizierung des verkürzten Peptides (KLISEFEL) resultierte in einem Affinitätsgewinn (KD 7,3 ± 0,56 µM). Hilpert et al. beschreiben ebenfalls die vom 9E10-Antikörper selektiv erkannten Schlüsselpositionen LISE im Peptid, die in den Substitutionsanalysen am Peptid ermittelt wurden. Fujiwara et al. (2002) verbesserten mit dem Klon 3DX die Affinität des 9E10-scFv in einer Phagen-Display-Bibliothek. Die verbesserte Affinität resultiert hauptsächlich aus Mutationen im Linkerpeptid des scFv. In einem Screen einer 27-mer Peptidbibliothek gegen den 9E10-Antikörper mit Hilfe des mRNA-Display finden Baggio und Burgstaller et al. (2002) Peptide mit der Konsensussequenz XQ/EXLISEXXL/M, die an den 9E10-Antikörper binden, wieder.

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Wenig später wurde die Kristallstruktur des 9E10-Fab im Komplex mit dem myc-tag-Peptid (Abb. 3.6.A.) und als freies Fab bei 2.7 und 2.2 Å Auflösung bestimmt (Krauß et al., 2007). Die Komplexstruktur (Abb. 3.6.B.) zeigt den N-Terminus des Peptides (EP410-IP414), der ein dreisträngiges β-Faltblatt mit dem aus dem Protein hervorragenden CDR-H3-Loop bildet, und den C-Terminus (SP415-NP420), der eine kurze α-Helix ausbildet. Die Elektronendichte für die CDR-H3 und CDR-L1 in der freien Fab-Kristallstruktur ist nicht bestimmbar, was auf eine hohe Flexibilität dieser Regionen deutet (Krauß et al., 2007). Thermodynamische Daten aus der isothermischen Titrationskalorimetrie zeigen zudem einen großen ungünstigen Beitrag der Entropie zur freien Energie der Bindung an das myc-tag-Peptid (Krauß et al., 2007), was wahrscheinlich auf die Flexibilität der CDRs und des Peptides zurückzuführen ist. Die Bindung an das Peptid wird eher von der günstigen Enthalpie ermöglicht. Die mit der Isothermen Titrationskalorimetrie ermittelten Bindungskonstanten für das myc-tag-Peptid (KD = 8.7 x 10-7M) und das verkürzte Peptid KLISEEDL (KD = 1.7 x 10-5M) (Krauß et al., 2007) stimmen gut mit den von Hilpert et al. (2001) ermittelten Werten im ELISA überein.

Abb. 3.6. : Kristallstruktur zweier 9E10-Fab-Fragmente im Komplex mit dem myc-tag-Peptid (grün, A.) in einer asymmetrischen Einheit bei 2,7 Å Auflösung. (A.) Dargestellt ist das Peptidrückgrat der schweren (rot) und leichten (blau) Kette des bindenden (rechts) und des nicht bindenden (links) Fab-Fragmentes sowie die Wassermoleküle (Punkte). (B.) Hier ist das Peptidrückgrat des myc-tag-Peptides (gelb) bei der Bindung an die variablen Domänen VH (rot) und VL (blau) gezeigt (nach Krauß et al., 2007).

3.4 Die Affinitätsreifung von Antikörpern

Die molekulare Evolution zahlreicher Antikörper wurde bereits in der Literatur beschrieben. Viele der Arbeiten betreffen Antikörper, die kleine und starre Moleküle, wie Haptene, binden (z.B. Yang et al., 1999, 2003, Jimenez et al., 2004, Furukawa et al., 2001, Yin et al., 2001, Sagawa et al., 2003, Wedemayer et al., 1997, 2003, Yin et al., 2003, Pauyo et al., 2006). Weniger wurde über die Affinitätsreifung von anti-Protein- (Li et al., 2003, Adams et al., 2003, Rathanaswami et al., 2005), anti-Peptid- (Manivel et al., 2000, Zahnd et al., 2004), anti-Kohlenhydrat-Antikörpern (z.B. Nguyen et al., 2003) und Schwereketten-Antikörpern berichtet (z.B. De Genst et al., 2004, 2005, Dooley und Flajnik, 2005).

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Im Folgenden soll an einigen ausgewählten Beispielen die Antikörperaffinitätsreifung kurz umrissen werden.

Anti-Hapten-Antikörper wie der 4-4-20 erreichen ihre hohe Affinität und Spezifität durch eine stärkere Verankerung des Antigens und eine dichtere Packung des Komplexes (Jimenez et al., 2004). Direkte Messungen der Proteindynamik von Jimenez et al. mittels der Photonenspektroskopie an diesem anti-Fluorescein-Antikörper zeigen, dass somatische Mutationen in der VL-Domäne die Flexibilität der Bindungstasche verringern und somit zu einer höheren Affinität des gereiften Antikörpers beitragen. Experimente zur Bindungskinetik mit der auf die Keimbahngensequenz rückmutierten VL-Domäne assoziiert mit der gereiften VH-Domäne (LKeimbahn/H4-4-20) führten zur einer 12-fachen Abnahme der Affinität wobei die Dissoziationsgeschwindigkeit der Komplexe um das 7-fache zunahm. Die Punktmutationen HL34R (CDR-L1) und LL36V (FR-L2) sind die einzigen Austausche während der Affinitätsreifung in der VL-Domäne. Sie nehmen großen Einfluss auf die Versteifung des Komplexes wie aus den Daten zur Proteindynamikcharakterisierung und den Kinetik- und Thermodynamikmessungen ersichtlich wird. Der Rest RL34 ist, laut Kristallstrukturanalyse, an einer Wasserstoffbrücke mit dem Antigen beteiligt. Der Rest VL36 vermittelt eine dichtere Packung durch Interaktionen mit RL34.

Die thermodynamischen Daten einer Gruppe von anti-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl-Antikörpern belegen, dass die Affinitätszunahme in diesem Fall auf einer Zunahme der Entropie ohne signifikante Änderungen der Enthalpie basiert (Sagawa et al., 2002). Auch hier gehen die Autoren von einem Schifft von einem induced fit- zu einem lock and key-Bindungsmechanismus während der Antikörperreifung aus.

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Der 28B4 mit einem kcat/KM von 1,9 x 105 M-1 s-1 ist ein redox aktiver katalytischer Antikörper (Yin et al., 2001). Der Affinitätsanstieg des gereiften 28B4 (von KD = 25 µM auf KD = 37 nM) wird durch eine schnellere Assoziation der Komplexe und zunehmende elektrostatische und hydrophobe Interaktionen mit dem Hapten verursacht. Das Hapten wird vom Affinitäts-gereiften 28B4 mehr nach einem Schloss-Schlüssel-Prinzip gebunden. Dagegen kommt es zu großen Konformationsänderungen in der CDR-H3 und CDR-L1 des Keimbahn-kodierten 28B4 bei der Bindung an das Hapten.

Bei der Bindung kleiner Antigene scheint mit der Affinitätsreifung des Antikörpers die konformative Flexibilität der Bindungsregion eingeschränkt zu werden. Demnach folgen Keimbahn-kodierte Antikörper einem ind u ced fit-Bindungsmechanismus, der sich mit Versteifung der Bindungsregion durch somatische Mutationen zum lock and key-Bindungsmechanismus mit hoher Bindungsspezifität wandelt.

Die zunehmende Affinität während des Reifungsprozesses kann das Resultat spezifischer Interaktionen zwischen dem Antigen und dem Antikörper (enthalpischer Effekt) oder einer Versteifung der Antikörperbindungstasche (entropischer Effekt) oder von beiden sein. Pauyo et al. (2006) haben an Antikörpern aus verschiedenen Stadien der Immunantwort gegen ein Diketonhapten gezeigt, dass die Affinitätszunahme durch die Kombination beider Faktoren (Enthalpie und Entropie der freien Bindungsenergie) erreicht wird. Unterschiede in der Bindungsstärke dieser Antikörper waren auf Längen- und Sequenzunterschiede in der CDR-H3 zurückzuführen. Ihre Ergebnisse zeigen den Antikörper mit der höchsten Affinität als den mit der längsten CDR-H3 (19 AS-Reste) und der höchsten Anzahl positiv geladener Reste. Der Antikörper mit der kürzesten CDR-H3 (9 AS-Reste) zeigt die schwächste Affinität. Den Autoren zufolge ist der verbesserte Enthalpiefaktor mitverantwortlich für die Affinitätszunahme.

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Für weitere anti-Hapten-Antikörper wurden Änderungen in der Konformation der Antikörperbindungsstelle (Wedemayer et al., 1997) und somatische Mutationen, die die optimale Bindungskonformation fixieren und mit der Bindung von Nicht-Antigenmolekülen in Konflikt stehen (Yin et al., 2003), berichtet. Keimbahn-kodierte Antikörper könnten in der Lage sein, mehr als eine Bindungskonformation anzunehmen, was ihr Bindungspotential im Vergleich zu gereiften Antikörpern erhöhen würde. Die Flexibilität der Paratope ungereifter Antikörper, die allerdings zu einem ungünstigen Beitrag der Entropie zur freien Bindungsenergie führt, ist mit mehreren Arbeiten diskutiert worden. Obwohl auch bei gereiften Antikörpern Polyspezifität beobachtet wird, geht man bei ungereiften Antikörpern von einer stärkeren aus, die auf eine höhere Flexibilität in der Konformation der Bindungsregion zurückgeführt wird (Manivel et al., 2000). Demirel und Lesk (2005) fanden heraus, dass zwar die Flexibilität der Bindungstasche mit der Bindung von 48G7 an p-Nitrophenylphosphonat als Ergebnis der wechselwirkenden Kräfte sowohl bei dem Keimbahn-kodierten als auch beim gereiften Antikörper abnimmt. Die Flexibilität der Bindungstasche des freien ungereiften Antikörpers ist jedoch nicht stärker als die im freien gereiften Antikörper. Die Autoren nehmen weiterhin an, dass mit der Bindung des ungereiften Antikörpers an das Hapten Konformationsänderungen durchlaufen werden. Während sich die Bindung des gereiften Antikörpers an das Hapten mehr nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip verhält.Die Bindungsregion des ungebundenen, gereiften 48G7-Antikörpers weist bereits eine Konformationskomplementarität zum Hapten auf. Der ungereifte 48G7 hingegen nimmt die Bindungskonformation erst während der Bindung an das Hapten an, und es gibt deshalb auch keine Konformationskomplementarität in Abwesenheit des Haptens. Solche Konformationsänderungen können über die Umordnung des Peptidrückgrates und der Aminosäureseitenreste, insbesondere der CDRs, als auch über die Orientierung der beiden variablen Domänen zueinander ablaufen. Zudem zeigen Wedemayer et al. am anti-Hapten-Antikörper 48G7 einen Affinitätsanstieg um das 30000-fache während der Affinitätsreifung. Hierbei konnte unter den neun somatisch mutierten Aminosäuren ein hoher kooperativer Effekt beobachtet werden (Yang et al., 1999).

Eine erst kürzlich erschienene Arbeit (Sethi et al., 2006), die sich mit der Polyspezifität und der konformativen Flexibilität von Keimbahngen-kodierten Antikörpern auseinandersetzt, zeigt die Bindung von drei strukturell verschiedenen Peptidepitopen an nur eine gemeinsame Paratopkonformation des Keimbahn-kodierten 36-65-Fab. Die Bindung der Peptide an diese eine Paratopkonformation erfolgt jedoch in verschiedenen Modi an unterschiedlichen Orten mit nur einer gemeinsamen Bindungsposition an zwei Tyrosinresten. Das heißt, dass trotz der beobachteten multiplen Konformationen der CDRs in den Kristallstrukturen des selben freien Fab-Fragmentes hier keine konformative Diversität der CDRs bei der Bindung an die unterschiedlichen Peptide nachzuweisen war. Die Autoren nehmen an, dass die Bindung der Peptide an die gemeinsamen Tyrosinreste die beobachtete Paratopkonformation ermöglicht, wobei es jedoch nicht essentiell ist, dass jedes Antigen in einer Bindung an diese Tyrosinreste involviert ist. Der gereifte 36-65-Antikörper wurde ursprünglich aus einer Immunisierung mit p-Azophenylarsonat gewonnen.

Manivel et al. haben am Beispiel von anti-Peptid-Antikörpern (anti-PS1CT3) der primären und sekundären Antwort zeigen können, dass die hohe Affinität und parallel dazu die Spezifität der gereiften Antikörper durch Regulation der Flexibilität des Paratops zustande kommt (Manivel et al., 2000). Die pM-Affinität des in vitro (Ribosomen-Display) selektierten scFv H6 gegen ein kurzes Peptid entstand mehr aus der Modulierung existierender Interaktionen in den FR-Regionen als durch neue Kontakte (Zahnd et al., 2004).

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Im Gegensatz dazu erhöhen Anti-Protein-Antikörper ihre Affinität vorrangig durch Verbesserung elektrostatischer und hydrophober Interaktionen wie am Beispiel des mAk928 mit einem KD von 0,6 pM gezeigt werden konnte (Rathanaswami et al., 2005).

Die Gruppe unter Mariuzza (Li et al., 2003) untersuchte mit Hilfe von Kristallstrukturanalysen vier murine Fabs gegen dasselbe diskontinuierliche Epitop auf dem Lysozym. Die Antikörper gebrauchten dieselben Keimbahngensegmente. Ferner war die VL-JL-Verknüpfungsstelle identisch und die CDR-H3 besaßen die gleiche Länge. Die Unterschiede innerhalb der schweren Ketten lagen bei 7, 7, 11 und 21 AS-Resten, mit zwei Mutationen, die allen vier Antikörpern gemeinsam waren. Die leichten Ketten unterschieden sich in drei AS-Positionen. Alle Substitutionen waren auf somatische Hypermutationen zurückzuführen, deren Anzahl mit der Affinität der Fabs korreliert (7 nM bis 0,2 nM). Vorhergehende Substitutionsexperimente mit Alanin in den CDRs belegten die Existenz wichtiger Schlüsselpositionen für die Antigenbindung. Drei dieser so genannten hot spot-Positionen befanden sich in den CDRs der schweren Kette und eine in der CDR-L1. Die Schlüsselpositionen waren konserviert und bereits durch die Keimbahngene kodiert. Sie konzentrierten sich im Zentrum der Interaktionsfläche, abgeschirmt von Wassermolekülen. Der Affinitätsanstieg beim H8-HEL Antikörper (KD = 0,2 nM) gelang durch Verbesserung der Oberflächenkomplementarität zum Antigen und zunehmender hydrophober Interaktionen. Dieser Effekt kam durch den Austausch von Seitenresten in der Peripherie der Antigen-Antikörper-Interaktionsfläche, begleitet von Konformationsanpassungen der CDR-H1 und -H2, zustande. Nach Meinung der Autoren können hot spot-Positionen für die Bindung bereits optimiert sein. Substitutionen oder Umordnungen dieser Reste könnten viel wahrscheinlicher zum Verlust der freien Bindungsenergie führen. Periphere Regionen würden dagegen eine höheres Potential für Optimierungen aufweisen, da sie flexibler und toleranter gegenüber Mutationen seien. Die Autoren berichten weiter, dass es zu größeren Konformationsänderungen der Antigenbindungstasche bei der Bindung des weniger affinen H26-HEL (KD = 7 nM) an das Antigen kommt, was bei der Bildung der höher affinen Komplexe weniger beobachtet wurde. Ihrer Meinung nach ist die Affinitätsreifung von Antikörpern mit einer Minimierung der Mobilität von Loop-Regionen während der Komplexausbildung und damit der Ausgleichung des nachteiligen Entropiebeitrages für die freie Bindungsenergie verbunden.

Mit Hilfe einer Simulation der molekularen Dynamik konnte man starre und flexible Bereiche in der Antigenbindungstasche des Hühnerei-Lysozym bindenden HH63-Antikörpers nachweisen und eine Kombination aus einem induced fit- und lock and key-Bindungsmechanismus vorschlagen (Sinha und Smith-Gill, 2005). Die flexiblen Regionen setzten sich aus geladenen und polaren Resten zusammen und formen Wechselwirkungen mit dem Hühnerei-Lysozym im Gegensatz zu den starren Bereichen. Die flexiblen Bereiche könnten laut Autoren an der molekularen Erkennung des Hühnerei-Lysozyms beteiligt sein.

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Nguyen et al. (2003) haben am Beispiel des Keimbahn-kodierten S25-2 Antikörpers gegen ein bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) eine gattungsspezifische (Chlamydia) Erkennung von mehreren Epitopen durch den Antikörper zeigen können. Der S25-2 bindet das Trisaccharidepitop mit einem niedrigen KD von 770 nM, wobei ein Monosaccharidrest in einer in den Keimbahngenen kodierten Bindungsstelle gebunden wird. Die weiteren Reste des Epitops, die sich unterscheiden können, werden von CDRs mit limitierter Flexibilität gebunden. So wird laut Nguyen et al. ein Schutz gegen verbreitete Pathogene und eine Flexibilität für die Erkennung neuer Krankheitserreger gewährleistet.

Viele der Arbeiten haben gezeigt, dass Keimbahn-kodierte Antikörper eine hohe Flexibilität ihrer Antigenbindungsstellen aufweisen können, was wiederum zu einer hohen Polyspezifität und Kreuzreaktivität führen kann. Die Selektion von Keimbahngensegmenten dieser Eigenschaft scheint eine Antwort des Immunsystems darauf zu sein, mit einem begrenzten Genrepertoire auf eine Vielzahl von Antigenen zu reagieren. Die Affinitätsreifung wird durch eine Vorordnung der bindenden Konformation im Keimbahngen-kodierten Antikörper erreicht.

Die Reifung eines Schwereketten-Antikörpers beschreibt De Genst et al. (2004) am cAB-Lys3 aus einem Dromedar. Dieser anti-Lysozym-Antikörper akkumulierte fünf Mutationen in der CDR-1 und -2, wovon drei hydrophobe Reste einen Teil eines hydrophoben Kerns in der CDR-1 ausbilden. Der Wert für die kinetische Konstante kd nimmt im Reifungsprozess stark ab und die Bindungsreaktion wird von der Enthalpie dominiert. Die Reifung wird mit der Zunahme günstiger Bindungsinteraktionen begleitet. Ausgeprägte Konformationsänderungen bei der Bindung des Keimbahngen-kodierten Antikörpers an das Antigen konnten nicht beobachtet werden. Dieser Antikörper reift scheinbar durch die Ausbildung zusätzlicher Kontakte und durch die Erhöhung der Oberflächenkomplementarität. Die Affinitätsreifung des cAb-Lys3 zeigt mehr Ähnlichkeiten mit der von Li et al. (2003) beschriebenen Affinitätsreifung des konventionellen Antikörpers anti-Lysozym HEL8 als mit den Reifungsmechanismen der konventionellen anti-Peptid- und anti-Hapten-Antikörper mit stärkeren Konformationsänderungen in der Antigenbindungstasche.

3.4.1  Die hypervariable CDR-H3

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Bei der Bindung eines Antigens sind größtenteils die CDRs involviert. In Abhängigkeit von der Beschaffenheit des Antigens können alle sechs CDRs oder nur einige an der direkten Bindung beteiligt sein. Eine besondere Bedeutung kommt hierbei der zentral in der Bindungstasche gelegenen CDR-H3 zu, die sich aus den drei Gensegmenten VH, D und JH und den zufällig inserierten N-Nukleotiden an den Verknüpfungsstellen zusammensetzt. Das D-Gensegment kodiert den größten Teil der CDR-H3. Damit ist die CDR-H3 die variabelste Region, was sowohl die Sequenz als auch die Länge und Struktur betrifft. Änderungen in der Konformation der CDR-H3 bei der Bindung an ein Antigen konnten beobachtet werden. Besonders lange CDR-H3 können bewirken, dass bis zu 100% des Kontaktes mit dem Antigen von dieser Region aus vermittelt wird, wie am Beispiel der Kristallstruktur eines Schwereketten-Antikörpers gezeigt werden konnte ( Decanniere et al., 1999). Dieses Beispiel verdeutlicht auch, dass die CDR-H3 für die spezifische Antigenerkennung in Schweren-Ketten-Antikörpern entscheidend seien kann.

Antikörper mit langen CDR-H3 wurden unter anderem in Menschen, Mäusen, Rindern, Kamelen und Haien gefunden. In Mäusen schwankt die CDR-H3-Länge von 2-19 AS-Resten und hat eine durchschnittliche Länge von ca. 10-12 AS-Resten, auch bei Menschen schwankt sie (Wu et al., 1993, Johnson et al., 1998). Nach Ramsland et al. (2001) beinhalten „primitive“ Antigenbindungsstellen öfter längere CDR-H3 als im Durchschnitt. Zum Beispiel haben humane polyreaktive IgMs aromatenreiche und lange CDR-H3 (bis zu 19 AS-Resten) (Ramsland et al., 1999). IgM-Moleküle finden sich in allen Vertebraten mit einem kombinatorischen Immunsystem. Sie weisen häufig eine Kreuz- und Polyreaktivität auf, beinhalten nur wenige somatische Mutationen, verglichen z.B. mit den IgGs, und werden bei einer Immunantwort als erste gebildet. Sie können geringe Affinitäten haben (KD = 10-4 - 10-6 M). Die IgM-Klasse repräsentiert näher das Keimbahnrepertoire der Antikörper und kann als ein Beispiel für „primitive“ Antikörper angesehen werden.

Lange CDR-H3 werden oft über interne (z.B. Schmidt et al., 1983) Disulfidbrücken oder über eine Querverbindung zur CDR-H1 oder -H2, wie in Schwereketten-Antikörpern (z.B. Desmyter et al., 1996), stabilisiert. Ramsland et al. (2001) bezweifeln jedoch, dass diese Disulfidbrücken zur Stabilisierung der CDR-H3 oder zur Versteifung der Antigenbindungsregion aufgekommen sind. Die Autoren beobachteten beim murinen NC10.14-Antikörper, dass die 16 AS-Reste lange CDR-H3 eine perfekte Nachahmung der letzten β-Schleife der C-Domäne der λ leichten Kette ist (Guddat et al., 2000). Ihrer Meinung nach waren die ursprünglichen V- und C-Domänen viel ähnlicher und lange CDR-H3 ein häufiges Merkmal von Antikörper. Lange CDR-H3 weisen ungewöhnliche Sequenzmotive mit mehrfach kodierten Prolin, Glycin, Cystein und aromatischen Resten auf. Glycin ermöglicht eine hohe lokale Flexibilität des Loops und könnte eine Antigenbindung nach einem induced fit-Mechanismus unterstützen. An der Basis der CDR befindliche Proline schränken dagegen die Konformationsfreiheit ein. Sie könnten der Versteifung besonders langer und herausragender CDR-H3 dienen. Proline an analogen Positionen wurden auch in der C-Domäne der humanen λ leichten Kette gefunden (Schiffer et al., 1973, Ely et al., 1989).

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Die Länge der CDR-H3 kann stark variieren. Saini et al. (1999) berichten von CDR-H3 mit bis zu 60 AS-Länge mit mehrfachen Cystein-Resten bei Rindern. Diese extrem langen Regionen treten bevorzugt in bovinen IgM-Antikörpern auf. Laut Saini und Kaushik (2001) kann nicht nur das Antigen sondern auch die limitierte Mobilität der Cµ2-Domäne in den Fabs der IgM-Moleküle die Selektion sehr langer CDR-H3 in der Antigenbindungsregion erfordern. Unterstützt wird diese Behauptung dadurch, dass in den bovinen IgGs, die eine flexiblere und lange hinge-Region aufweisen, keine außergewöhnlich langen CDR-H3 beobachtet wurden. Diese IgMs zeichnen sich zusätzlich durch eine eingeschränkte Verwendung des VH-Gensegmentes und eine eingeschränkte VH/VL-Paarung aus.

Rosner et al. (2001) beschreiben beim Menschen, dass Antikörper mit kurzen CDR-H3-Regionen für die Antigenbindung bevorzugt selektiert werden. In ihren Untersuchungen weisen die Affinitäts-gereiften Antikörper kürzere CDR-H3 auf als die nicht Affinitäts-gereiften. Die kürzeren CDRs waren auf die Verwendung kürzerer JH-Gensegmente und einer stärkeren Nukleotiddeletion an den Enden der VH-, D- und JH-Gensegmente als auch auf einen geringeren Einbau von P- (palindrom) und N-Nukleotiden an den Verknüpfungsstellen zurückzuführen. Laut Autoren können kurze CDR-H3 mehr Raum in der Antigenbindungstasche für Interaktion des Antigens mit den übrigen CDRs, die ebenfalls zur Bindungsenergie beitragen könnten, ermöglichen. Beim 9E10-Antikörper bindet das myc-tag Peptid nicht in der typischen Antigenbindungstasche zwischen den beiden variablen Domänen, sondern außerhalb (Abb. 3.7.). In dieser Bindungsvariante hat das Peptid keinen direkten Kontakt zur CDR-L1 und -L3. Für die außergewöhnliche Bindungsstelle des Peptides ist vermutlich die Wechselwirkung der CDR-H3 mit der CDR-L1 und L3 verantwortlich. Die konventionelle Antigenbindungstasche wird während der Bindung des Peptides von der langen CDR-H3 zum Teil okkupiert. Lange CDR-H3 können durch ihre Größe den Raum zwischen der VL- und VH-Domäne ausfüllen oder in das Lösungsmittel herausragen. Am Beispiel zweier humaner IgM-Antikörper gegen Peptide (Ramsland et al., 2000) und Makromoleküle (Fan et al., 1992) konnte eine Abhängigkeit der Konformation des Loops von der Länge herausgestellt und die verschiedene Bindungsfähigkeit der Antikörper damit teilweise erklärt werden (Ramsland et al., 2001). Beim Pot Antikörper füllt die 12-AS lange CDR-H3 den Raum zwischen den beiden variablen Domänen aus. Beim Mez Antikörper dagegen ragt die um lediglich 2-AS längere CDR-H3 aus dem Protein heraus.

Abb. 3.7. : Draufsicht auf die Antigenbindungsstelle des 9E10 geformt von den Domänen VH (rot) und VL (blau). Das Peptid (gelb) bindet außerhalb der konventionellen Bindungsstelle zwischen den beiden Domänen (Pfeil). Die CDR-H3 (rote Oberflächendarstellung) interagiert mit der CDR-L1 (blaue Oberflächendarstellung) und CDR-L3 (hellblaue Oberflächendarstellung) (nach den Kristallstrukturdaten von N. Krauß).

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Bei vielen Antikörpern konnte die Wechselwirkung der langen herausragenden CDR-H3 mit der VL-Domäne beschrieben werden. Hier soll nur ein Beispiel erwähnt werden. Die CDR-H3 des Mez Antikörpers interagiert direkt mit der CDR-L3 (Ramsland et al., 2000). Dieser Kontakt unterstützt die herausragende Konformation der langen CDR-H3, verhindert jedoch möglicherweise den Zugang des Antigens zu den Resten der CDR-L3. Beim Schwereketten-Antikörper cAb-Lys3 fehlt die leichte Kette als unterstützende Domäne für die lange CDR-H3, jedoch wird durch die Wechselwirkung sekundärer Strukturelemente in der CDR-H3 mit den β-Strängen der VHH-Domäne an der potentiellen Dimerisierungsfläche mit VL eine Bindungsplattform gemimt (Ramsland et al., 2001).

Nach Furukawa et al. (2001) hat die Flexibilität der CDR-H3, die, ihrer Meinung nach, von den P- und N-Nukleotid kodierten Aminosäuren bestimmt wird, einen großen Einfluss auf die Konformation der Antigenbindungsstelle. Die Autoren vermuten, dass die zentral gelegene CDR-H3 den Winkel zwischen der VH- und VL-Domäne kontrollieren kann und somit einen Einfluss auf die Flexibilität und Größe der Bindungsstelle hat. In ihrer Arbeit mit murinen anti-NP((4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl)-Antikörpern konnten sie zeigen, dass es eine enge Beziehung zwischen der Affinitätsreifung und der CDR-H3-Struktur gibt.

Die Gruppe unter S. Muyldermans (De Genst et al., 2005) zeigt am Beispiel der Kristallstrukturen von zwei spezifischen anti-Lysozym-Schwereketten-Antikörpern aus zwei verschiedenen Dromedaren, dass die von demselben D-Gensegment kodierten CDR-H3 trotz unterschiedlich verwendeter V- und J-Gensegmente und Aminosäuren an den Rekombinationsschnittstellen eine identische Struktur aufweisen. Beide Antikörper sind außerdem durch eine auffällig konvergente Affinitätsreifung in der CDR-H2 gekennzeichnet. Weitere Untersuchungen mit Antikörpern, zusammengesetzt aus verschiedenen D-Gensegmenten, haben eine limitierte strukturelle Vielfalt dieses Loops ergeben. Demnach wäre die Struktur der CDR-H3 in Schwereketten-Antikörpern weniger divers als durch die hohe Sequenzvariabilität vorhergesagt wird. Den Autoren zu Folge kann die Hypermutation die limitierte strukturelle Vielfalt der CDR-H3 kompensieren. Die begrenzte Strukturvariabilität der CDR-H3 der Schwereketten-Antikörper könnte diesbezüglich eine Ausnahme sein. Aufgrund der fehlenden VL-Domäne geht Diversität verloren. In konventionellen Antikörpern kann die Interaktion der VL-Domäne mit der CDR-H3 jedoch mehr Konformationen für diesen Loop ermöglichen.

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Mit Ausnahme der CDR-H3 lassen sich die übrigen CDRs aufgrund ihrer Sequenz in kanonische Strukturen klassifizieren (Al-Lazikani et al., 1997, Decanniere et al., 2000). Die hohe konformative Variabilität der CDR-H3 lässt jedoch eine solche Charakterisierung nur im geringeren Maße zu. Shirai et al. (1999) schlagen Regeln (H3-Regeln) für die Identifizierung der tertiären Struktur der CDR-H3 aus der Sequenz vor. Morea et al. (1998) unterteilen die CDR-H3 in eine Basis- und eine Kopf-Region, wobei die Basis eine geknickte oder eine gedehnte Struktur mit einer regulären Wasserstoffbrückenausbildung einer β-Faltblattschleife annehmen kann. Den Übergang zwischen den beiden Strukturen kann eine Salzbrücke zwischen dem Aspertat 101 und einem basischen Rest an benachbarten Positionen in der CDR-H3-Basis oder der VL-Domäne bestimmen. Morea et al. fanden weiter heraus, dass die Kopfregionen längerer CDR-H3 (bis zu 22 AS) mit einem β-bulge (Ausbauchung) in der Basis-Region eine Vielzahl von verschiedenen Konformationen aufweisen. In kurzen CDR-H3 oder in solchen mit gedehnten Basisstrukturen (ohne Knick) folgen die Kopf-Regionen den Strukturen von kurzen Schleifen. Laut Morea et al. ist die Konformation der CDR-H3 (konservierte Reste Cys 92-Gly 104, Nummerierung nach Kabat) stark von der Umgebung (CDR-H3, VH- und VL-Domäne, Antigen) abhängig. Die Basis-Region (ersten vier N-terminalen Reste und letzten sechs C-terminalen Reste) konnte dagegen in fast allen Fällen aus der Sequenz vorhergesagt werden. Die CDR-H3-Konformation des 9E10-Atikörpers im Komplex mit dem myc-tag-Peptid unterscheidet sich sehr von der freien Form in der Kristallstruktur der dimerisierten Fab-Fragmente. Die deutlichsten Unterschiede betreffen die Kopf-Region (Abb. 3.8.(1.)). Die Basis-Region der 9E10-CDR-H3 ändert ihre Konformation bei der Bindung nicht oder nur sehr geringfügig (Arg 95).

Lange CDR-H3 sind für die Bindung von linearen Epitopen geeignet, wie am Beispiel der Bindung des HIV V3-Loops an den 447-Antikörper gezeigt werden konnte. Der CDR-H3-Loop des 447 formt ein β-Faltblatt mit dem V3-Peptid. Die Wechselwirkungen mit der CDR-H3 werden hier von Wechselwirkungen des Peptidrückgrats beider Moleküle dominiert (Stanfield et al., 2004). Die Ausbildung eines β-Faltblattes zwischen der CDR-H3 und dem Antigen konnte bei der Interaktion des 9E10-Antikörpers mit dem myc-tag-Peptid ebenfalls beobachtet werden (Abb. 3.8.(2.)).

Abb.3.8. : Kristallstrukturen der 9E10-CDR-H3 (Reste 92-104, Nummerierung nach Kabat) in den Kopf-an-Kopf dimerisierten Fab-Fragmenten. In 1. ist die Cα-Atomüberlagerung der bindenden (rot) und der nicht bindenden Konformation (blau) und in 2. die Ausbildung eines dreisträngigen antiparallelen β-Faltblattes zwischen der CDR-H3 (rot) und dem N-Terminus des myc-tag-Peptides (gelb) zu sehen. (2.) Darstellung der bindenden Konformation mit den zahlreichen aromatischen Resten in der Kopf-Region (nach den Kristallstrukturdaten des 9E10-Fab von N. Krauß).

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Die 9E10-CDR-H3 ist reich an aromatischen Resten. Eine dichte Abfolge von einem Phenylalaninrest und sechs Tyrosinresten kennzeichnet diesen Loop und verleiht ihm einen hydrophoben Charakter (Abb. 3.8.(3.)). Vielfach auftretende aromatische Reste in CDR-H3 können die multifunktionelle Rolle dieser Region unterstützen. Berichte von Ofek und Cardoso zeigen an Modellbeispielen mit den Antikörpern 2F5 und 4E10, dass aromatenreiche CDR-H3 die Interaktionen mit Membran-gebundenen Epitopen durch die hydrophoben Wechselwirkungen der CDR mit den Membranlipiden ermöglichen (Ofek et al., 2004, Cardoso et al., 2005). Am CD4i-Antikörper konnte man sogar eine posttranslationale Modifikation der Tyrosinreste mit Sulfatgruppen, die der CDR einen negativ geladenen Charakter für die Wechselwirkung mit basischen Rezeptorbindungsstellen verliehen, beobachten (Choe et al., 2003). Dieses Beispiel zeigt auch zum ersten Mal eine chemische Modifikation eines Antikörpers, die mit seiner Spezifität einhergeht.

Diese Beispiele verdeutlichen die gängigen Strategien der Antikörperaffinitätsreifung (wenn auch größtenteils am Beispiel von anti-Hapten-Antikörpern aufgeklärt), die nach Yin et al. (2001) wie folgt zusammengefasst werden.

1.)

Die intrinsische Antigenpolyspezifität von Keimbahngen-kodierten Antikörpern erhöht das Bindungspotential des Antikörperkeimbahnrepertoires, wobei die CDR-H3 eine wichtige Rolle in der Bestimmung der Spezifität einnimmt.

2.)

Die Bindung von Haptenen an Keimbahngen-kodierte Antikörper induziert CDR-Konformationsänderungen, die zu einer erhöhten Komplementarität zwischen dem Antigen und dem Antikörper führen. Die Konformationsvariabilität von Keimbahngen-kodierten Antikörpern erhöht die Diversität des primären Antikörperrepertoires.

3.)

Mutationen im Keimbahngen-kodierten Antikörper, die entweder durch die VDJ-Verknüpfungsstellen oder durch die somatische Hypermutation entstehen, minimieren die Flexibilität der CDRs und gestalten auf diese Weise die Haptenbindungstasche um. Dem Gegenüber steht jedoch die Beobachtung am 48G7-Antikörper, wonach für die CDRs des ungereiften Antikörpers im Vergleich zu denen des gereiften keine erhöhte Flexibilität beobachtet werden konnte. Mutationen können auch signifikante Änderungen in der Bindungsgeometrie des Haptens für eine optimale Haptenkomplementarität verursachen. Viele schwache Bindungsmodi existieren in den Keimbahnantikörpern, die während der Affinitätsreifung verstärkt werden.

4.)

Somatische Mutationen können außerhalb der Haptenbindungsstelle auftreten und die Haptenbindung indirekt modulieren. Mutationen können aber auch in der Bindungstasche auftreten und direkt mit dem Hapten interagieren.

5.)

Der schrittweise Erwerb von funktionellen Mutationen in den Keimbahngenen ist mit einer schrittweisen Zunahme der Bindungsstärke verbunden und ist ein allgemein beobachtetes Motiv in der in vivo Antikörperevolution.

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Die Affinitätsreifung eines Antikörpers (Li et al., 2003) und eines Schwereketten-Antikörpers (De Genst et al., 2004) gegen das Hühnereiweiß-Lysozym (HEL) folgt dagegen mehr der Strategie der zunehmenden Oberflächenkomplementarität der Interaktionsflächen und dem Hinzufügen zusätzlicher günstiger Kontakte ohne größere Konformationsänderungen in der Antigenbindungstasche. Allerdings sollte an dieser Stelle bemerkt werden, dass die von Li et al. (2003) charakterisierten Antikörper gegen HEL bereits beträchtlich gereifte Antikörper präsentierten und keine Keimbahngen-kodierten Antikörper in der frühen Phasen der Affinitätsreifung darstellen.

3.5 Peptidspot-Analysen

Spot-Synthesen sind eine Technik zur Herstellung von Peptiden an definierten Positionen (Spots), die eine simultane, parallele, chemische Synthese von Peptiden auf Membranen erlaubt (Frank et al., 1991; Frank, 1992; Frank und Overwin, 1996; Kramer und Schneider-Mergener, 1998). Für gewöhnlich werden die Peptide über einen Linker (z. B. β-Alanin) vom C-Terminus beginnend synthetisiert. Die Peptide lassen sich aber auch zyklisieren (Kramer et al., 1994, Winkler et al., 1998) oder umgekehrt mit einem freien C-Terminus (Schultz et al., 1998; Hoffmüller et al., 1999) herstellen. Die Peptidspot-Synthesetechnik findet eine breite Anwendung zur Identifizierung linearer und diskontinuierlicher Antikörperepitope (z.B. Adler et al., 1994) und Rezeptor-Ligand-Interaktionsflächen (z.B. Reinecke et al., 1995). Große Peptidbibliotheken (8000 Peptide / 20 x 30cm Membran, Kramer et al., 1999) zur Identifizierung von Peptiden, die an Proteine (z.B. Adam-Klages et al., 1996), Metalle (z.B. Schneider-Mergener et al., 1996) und Nukleinsäuren (z.B. Reuter et al., 1999) binden, sind möglich. Aber auch Analysen zur Substratspezifität (z.B. Tegge et al., 1995), um nur einige Anwendungsmöglichkeiten zu nennen, sind gängig. Ein Vorteil von Peptidspots ist, dass Bindungsexperimente direkt auf der Membran gemacht werden können. Auf diese Weise lassen sich Bindungen an eine große Anzahl von Peptiden verschiedener Länge und Sequenz gleichzeitig analysieren. Die Kreuzreaktivität und Polyspezifität von Antikörpern läst sich hiermit untersuchen. Um in linearen Epitopen Schlüsselpositionen für eine Bindung identifizieren zu können, ist es möglich, Substitutionsanalysen an den Peptiden durchzuführen (Abb. 3.9.).

Abb.3.9. : Schematische Darstellung einer Substitutionsanalyse zur Identifizierung von Schlüsselpositionen. (A.) Die linke Reihe repräsentiert die Wildtypsequenz des Peptides. An diesem Beispiel wird die Bindung eines Fab-Fragmentes an ein Peptid (B.) über einen Enzym markierten sekundären Antikörper (C.) nachgewiesen (Zwei-Schritt-Detektion)

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Schlüsselpositionen repräsentieren Reste, die nur durch sich selbst oder durch physikochemisch ähnliche Reste austauschbar sind, ohne dass es zu einem Verlust der Bindung käme. In den Substitutionsanalysen an einem Peptid wird jede Position, jedoch nur einmal, durch alle zwanzig proteinogenen Aminosäuren ausgetauscht. Auf der Membran entsteht so eine Bibliothek aus punktsubstituierten Peptiden.

Die Abbildung 3.10. zeigt eine Substitutionsanalyse am myc-tag-Peptid und einer verkürzten Variante (KLISEEDL) des Peptides und den daraus von Hilpert et al. abgeleiteten Schlüsselpositionen LISE (Hilpert et al., 2001). Die schwarzen Spots entsprechen einer Bindung des 9E10-Antikörpers an das jeweilige Peptid. Mit Hilfe solcher Peptidspots wurde z.B. auch die polyspezifische Bindung des anti-p24(HIV-1)-Antikörpers (CB4-1) an weitere Peptide neben dem p-24-Peptid nachgewiesen (Kramer et al., 1997). Substitutionsanalysen an den jeweiligen Peptiden, unterstützt durch Kristallstrukturanalysen, belegten unterschiedliche Bindungsarten der Peptide durch den CB4-1-Antikörper.

Abb. 3.10. : Substitutionsanalysen an den Peptiden myc-tag (a.) und einem verkürzten myc (KLISEEDL, (b.)). Der gebundene 9E10-Antikörper wurde über einen HRP-markierten anti-Maus-IgG-Antikörper detektiert, und die Membranen wurden mit Diaminobenzidin (a.) bzw. einem Chemilumineszenzsubstrat (b.) entwickelt (Hilpert et al., 2001).


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30.03.2007