Zielstellung

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Das Ziel dieser Arbeit war, einen Einblick in die Affinitätsreifung des anti-Peptid-Antikörpers 9E10 mit seiner außergewöhnlich langen CDR-H3, vom Keimbahn-kodierten Vorläufer zum gereiften hochaffinen Antikörper, zu gewinnen. Dies sollte durch Rückmutationen des Antikörpers auf die Sequenzen der murinen Immunglobulinkeimbahngene und durch Charakterisierung der Bindung zu c-myc-Peptiden unterschiedlicher Affinität erreicht werden.

Dazu sollten eine komplette 9E10-Rückmutante, jeweils eine komplette Rückmutante der VH- bzw. VL-Domäne sowie ausgewählte Einzelrückmutanten an den Positionen HH31, GH52, RH53 und HH58 in der VH-Domäne, die in räumlicher Nachbarschaft zum veränderten C-Terminus der Peptide MyCUT (EQKLISEENLYFQG) und der verkürzten modifizierten myc-tag-Variante (KLISEFEL) stehen oder Bestandteil einer zum C-Terminus der Peptide benachbarten CDR sind, gentechnisch hergestellt werden. Mit solchen Rückmutationen sollte der Einfluss einzelner Reste bzw. Domänen auf die Affinität und Spezifität des 9E10-Antikörpers studiert werden.

Die Arbeit baut sich aus den folgenden Punkten mit Schwerpunkt auf der Charakterisierung der 9E10-Rückmutanten hinsichtlich Affinität und Spezifität zum myc-tag-Peptid (EQKLISEEDLN) und einer schwächer affinen verkürzten Variante (KLISEEDL) auf:

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Identifizierung der Keimbahngensegmente mit höchster Homologie zu 9E10

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Konstruktion der 9E10-Rückmutanten

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Bakterielle Fab-Expression und Reinigung der 9E10-Rückmutanten

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Charakterisierung der Bindungskonstanten der 9E10-Rückmutanten zu den myc-Peptiden

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Charakterisierung der Spezifität der 9E10-Rückmutanten in Substitutionsanalysen an den myc-Peptiden

Dieses Wissen soll dazu dienen den Bau molekularer, auf 9E10 basierender Bibliotheken zu ermöglichen aus denen höher affine Binder zum MyCUT-tag und dem verkürzten modifizierten myc-tag (KLISEFEL) selektiert werden sollen.


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30.03.2007