Ergebnisse

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6.1  Identifizierung der Keimbahngene zu 9E10

Zur Bestimmung der Nukleinsäuresequenz der variablen Regionen des 9E10-Antikörpers wurde RNA aus der 9E10-Antikörper produzierenden Myc1-Hybridomzelllinie präpariert und die 9E10-mRNA in cDNA umgeschrieben. Dazu kamen Maus-spezifische Primer zum Einsatz, die in der Sequenz kodierend für die Signalpeptide und die konstanten Domänen κ bzw. γ1 der Immunglobuline binden (Griebel, 2005). Die PCR-Produkte wurden abschließend in den Expressionsvektor pASK85, wie von U. Griebel beschrieben, kloniert. Die kompletten variablen Regionen des 9E10 wurden zur Kontrolle sequenziert und erfolgreich auf Funktionalität getestet. PCR-Fehler konnten durch unabhängige Amplifikationen und Sequenzierfehler durch die Sequenzierung beider DNA-Stränge ausgeschlossen werden. Die so erhaltenen 9E10-DNA-Sequenzen unterscheiden sich nur minimal von den von Schiweck et al (1997) publizierten Sequenzen am 3' und 5'-Ende (Griebel, 2005). Die Abweichungen betreffen die Aminosäuren HH3 anstelle von D, AH107 und SH108 anstelle von T sowie GL100 anstelle von A. Sie sind auf die von Schiweck et al. verwendeten PCR-Primer zurückzuführen, die in den variablen Regionen des 9E10 binden. Am Beispiel des Restes HH3 konnte mit Hilfe der Elektronendichte aus der 9E10-Kristallstrukturanalyse bei 2,7 Å (N. Krauß) ein H anstelle von D bestätigt werden. Um Rückschlüsse aus der Affinitäts- und Spezifitätsänderung auf einzelne Rückmutationen im 9E10 ziehen zu können, war die Charakterisierung der vollständigen Sequenz der variablen Regionen für diese Arbeit von entscheidender Bedeutung. Im weiteren Verlauf wurde mit den durch Unterstützung von U. Griebel ermittelten Sequenzen gearbeitet.

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Zur Identifizierung der während der Affinitätsreifug des 9E10-Antikörpers ausgetauschten Nukleotide in den Genen der VH- und VL-Domäne wurden in der Keimbahn der BALB/c Maus V-, (D-) und J-Gensegmente mit höchster sequentieller Übereinstimmung mit dem 9E10 ermittelt.

Abb.6.1. : Sequenzvergleich der 9E10-V-Regionen mit hochhomologen murinen Ig-Keimbahngensegmenten. (A) Vergleich des VH-Gens mit den Keimbahngensegmenten VH3:3.39, DFL16.1 und JH4 sowie (B.) des VL-Gens mit 21-2* und J1. Die in den 9E10-Genen (oben) und in den Keimbahngenen (unten) kodierten Aminosäuren sind dargestellt. Die Definition der CDRs erfolgte nach Kabat (1991).

Eine Recherche mit IgBlast aus der NCBI-Datenbank ergab für das 9E10-VH-Gen die Keimbahngensegmente VH3:3.39 für das V-Gensegment (14 Nukleotidaustausche), DFL16.1 für das D-Gensegment (2 Nukleotidaustausche) und JH4 für das J-Gensegment (2 Nukleotidaustausche) sowie für das VL-Gen das V-Gensegment 21-2* (10 Nukleotidaustausche) und das J-Gensegment J1 (0 Nukleotidaustausche) (Abb.: 6.1.). Die selben Gensegmente wurden mit Hilfe der IMGT-Datenbank gefunden. Darüber hinaus zeigte ein Homologievergleich mit dem V-Gensegment des 9E10-VH-Gens und dem Genom der C57BL/6J Maus (Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002) die höchste Übereinstimmung mit dem Lokus NT_039553 auf dem Chromosom 12, das zudem eine 100%-ige Identität zu dem V-Gensegment VH7183.7b aufweist. Nach Langdon et al. (2000) ist das Gensegment VH7183.7b identisch mit VH3:3.39 aus der BALB/c Maus. Die höchste Übereinstimmung mit dem V- und J-Gensegment für das 9E10-VL-Gen zeigte der Lokus NT_039350 auf dem Chromosom 6, wobei die gefundenen Sequenzabschnitte identisch mit 21-2* und J1 sind. Hiernach gibt es keine weiteren V-Gensegmente der VH-Domäne sowie V-Gensegmente der VL-Domäne im Mausgenom, die eine höhere Homologie zum 9E10 aufweisen, als die bereits beschriebenen. Schiweck et al. (1997) haben für das 9E10-VH-Gen ebenfalls postuliert, dass es aus den Gensegmenten DFL16.1, JH4 und einem V-Gensegment aus der 7183 Unterfamilie stammt.

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Der Keimbahngen-kodierte 9E10 setzt sich also höchstwahrscheinlich aus den Gensegmenten VH3:3.39, DFL16.1 und JH4 für das VH-Gen sowie 21-2* und J1 für das VL-Gen zusammen. Eine eindeutige Aussage zu Hypermutationen im VH-Gen am Rekombinationsort zwischen den Segmenten V und D kann aufgrund einer Exonukleaseaktivität und des zufälligen Einbaus von N-Nukleotiden durch die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) nicht getroffen werden. Solche Regionen können sehr unterschiedlich sein, so dass sie eindeutige Marker für einen B-Zell-Klon darstellen. Die Base Thymin an der Verknüpfungsstelle zwischen den D- und J-Gensegmenten könnte dagegen ein potentielles P-Nukleotid sein, das bereits mit großer Wahrscheinlichkeit im nicht hypermutierten VH-Gen von 9E10 auftritt. In dieser Arbeit werden die V-Domänen des 9E10 auf die Sequenz der Keimbahngensegmente, aus denen er höchstwahrscheinlich hervorgegangen ist, zurückmutiert und im Weiteren als HKei m bahn/LKeimbahn bezeichnet. Die P- und N-Nukleotide am V-D-Rekombinationsort werden aufgrund der fehlenden Sequenzinformation nicht verändert, womit das Konstrukt HKei m bahn/LKeimbahn ein potentieller Vorläufer des 9E10 sein könnte. Die Abb. 6.1. zeigt die Verteilung der somatischen Mutationen in den CDRs und FRs in den Genen von VH und VL. Die Lokalisierung der Mutationen im Protein wird im folgenden Kapitel und in der Abb. 6.3. beschrieben.

Im kodierenden Strang werden die Purine mit insgesamt 6 bzw. 4 Mutationen für Adenin und 8 bzw. 5 Mutationen für Guanin in der VH- und VL-Region häufiger mutiert (Tabelle 6.2.). Das häufige Auftreten von Purinmutationen in der somatischen Hypermutation wird für murine und humane variable Regionen (Mistein und Neuberger, 1996) als auch für VHH-Regionen aus Kamelen (De Genst et al., 2004) beschrieben. Die Tansition, d.h. der Ersatz eines Purins oder Pyrimidins durch ein anderes Purin oder Pyrimidin, ist die häufigste Form des Basenaustausches in den 9E10-V-Regionen (17 von insgesamt 27). Mit Ausnahme der FR-Mutationen AH74D, AH77T und der CDR-L2-Mutation AL51I resultieren alle somatischen, zu einem Aminosäureaustausch geführten Mutationen im 9E10 aus hot spot-Sequenzen mit den Motiven RGYW, TW und WA (Rogozin et al., 2001).

Tabelle 6.2.: Mutationshäufigkeit der Purine und Pyrimidine in den V-Regionen des 9E10.

VH

VL

 

A

C

G

T

A

C

G

T

A

/

2

4

0

/

1

2

1

C

2

/

0

0

0

/

0

1

G

5

3

/

0

4

1

/

0

T

0

1

0

/

0

0

0

/

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Ein Sequenzvergleich der 9E10 variablen Regionen mit bekannten Antikörpersequenzen in der R.U.Bi.C.-Datenbank zeigt folgende ungewöhnliche Sequenzmerkmale. So befindet sich an Position 83 in der FR-L3 ein Prolin. Prolin, das ein Threonin substituiert, kommt an der Position 83 mit einer Häufigkeit von 0,096 % in den bekannten murinen Antikörpersequenzen vor. Selten ist ebenfalls der Lysinrest 106a (0,542 %) in der FR-L4-Region. Der durch die somatische Mutation von Serin entstandene Histidinrest 31 (0,652 %) in der CDR-H1 und der Methioninrest 100j (0,150 %) in der CDR-H3 sind ebenfalls ungewöhnlich selten an diesen Positionen.

6.2 Verteilung der somatischen Mutationen im 9E10 und Auswahl der Einzelrückmutanten

Die somatischen Mutationen im 9E10 verteilen sich über die variablen Domänen (Abb. 6.1. und 6.3.), konzentrieren sich jedoch in den CDRs, speziell in der CDR-H2 und CDR-H3 mit jeweils vier Mutationen (Abb. 6.1.). Auch in den von der Antigenbindungsstelle entfernt liegenden Regionen treten Mutationen auf. Nur drei (HH31, RH53 und TH100d) der zwanzig mutierten Reste sind im direkten Kontakt zum myc-tag-Peptid (Abstand < 4Å).

Abb. 6.3. : Lösungsmittel zugängliche Oberfläche der 9E10 variablen Domänen (grau) mit den somatischen Mutationen (rot). Das myc-tag-Peptid ist in Gelb gezeigt. Bei den beschrifteten Resten handelt es sich um die für die Einzelrückmutationen ausgewählten Positionen. (A.) Vorderansicht, (B.) Rückansicht und (C.) Draufsicht auf den 9E10-myc-Peptid-Komplex.

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Für die in der Aufgabenstellung definierte Frage nach dem Einfluss der Rückmutanten auf die Affinität und Spezifität des Antikörpers sollten Einzelrückmutationen untersucht werden. Im Hinblick auf die hohe Anzahl der somatischen Mutationen (20) wurden nur einige Mutationen hierfür ausgewählt. Neben den in der Zielstellung benannten Einzelrückmutationen HH31S, GH52S, RH53G und HH58Y wurden zusätzliche Einzelrückmutationen mit Hilfe der Daten aus der Kristallstrukturanalyse nach der folgenden Frage ausgewählt. Welchen Einfluss auf die Bindungseigenschaften des 9E10 haben die lange CDR-H3 und die sie an der Schleife bzw. an der Basis kontaktierenden CDR-L1 und CDR-L3? In der CDR-L1 und CDR-L3 tritt jeweils eine somatische Mutation auf, nämlich IL30F und SL91T. Die Einzelrückmutation FL30I soll die Rolle dieser längeren CDR-L1 klären. Die Einzelrückmutationen TL91S in direkter Nachbarschaft zu SH100hY nahe der Basis der CDR-H3 sind für die Analyse der CDR-H3-Basisregion gewählt worden. In der Abbildung 6.3. sind die zu analysierenden Positionen dargestellt.

6.3 Epitopverlängerung und Modellierung der Bindung an 9E10

Um geringe Änderungen in der Affinität und Spezifität der Keimbahnrückmutanten zu analysieren, wurden Bindungsexperimente mit myc-Peptiden unterschiedlicher Affinitäten durchgeführt. Wie in der Zielstellung formuliert, wurde das kürzeste vom 9E10 gebundene Peptid KLISEEDL und das als myc-tag bezeichnete Peptid EQKLISEEDLN ausgewählt (Hilpert et al. 2001, Munro und Pelham, 1986), um die Bindung zu den Rückmutanten zu testen. Das Fab der Keimbahnrückmutante LKeimbahn/HKeimbahn zeigt jedoch keine nachweisbare Bindung an diese Peptide, weder im ELISA noch in Peptidspot-Analysen. Eine Lösung des Problems boten hierfür die Daten aus der Kristallstrukturanalyse des 9E10-Fab im Komplex mit dem myc-tag-Peptid. Die Kristallstruktur, bei einer Auflösung von 2,7 Å, zeigt den N-Terminus des myc-tag-Peptides in einer dreisträngigen antiparallelen ß-Faltblattstruktur mit der langen CDR-H3 der VH-Domäne. Der C-Terminus bildet eine kurze α-Helix in der Nähe der CDR-H3 (Krauß et al., 2007). Die Konformation des myc-tag-Peptides bei der Bindung an das 9E10-Fab in der Kristallstruktur wurde mit der Konformation der Cα-Atome der Aminosäuren 410-420 des humanen c-Myc-Proteins aus einer Kristall- und einer 1H-NMR-Struktur (Komplex mit Max-Protein Nair et al., 2003, Lavigne et al., 1998) verglichen. Im c-Myc-Protein bilden diese Aminosäuren eine α-Helix. Die Überlagerung dieser Cα-Atome brachte eine exakte Übereinstimmung der Konformation des Peptidrückgrates im Bereich 415-419 (mit einer leichten Abweichungen in der Position 420 des myc-tag-Peptides) aller drei Moleküle (Abb. 6.4.A).

Abb. 6.4. : Modell der Bindung eines C-terminal verlängerten myc-Peptides. (A) Die Cα-Atom-Überlagerung des myc-tag-Peptides (410-420), entnommen der Komplexstruktur mit 9E10-Fab (rot), mit der Myc-α-Helix (408-427), aus einer Kristallstruktur (grün, 1NKP) und einer 1H-NMR-Struktur (blau, 1A93), zeigt für alle Moleküle eine gleiche α-helikale Konformation der Reste 415-420. (B) Modell einer möglichen Bindungskonformation eines C-terminal verlängerten myc-Peptides (410-427) (blau) in der Bindungstasche des 9E10 (Oberflächendarstellung). Die Konformation der Reste 410-419 (rot) entspricht der des myc-tag Peptides in der Komplexkristallstruktur.

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Da Evan et al. (1985) die Maus, aus der der 9E10-Antikörper gewonnen werden konnte, mit einem 32 Aminosäure langem c-myc-Peptid (408-439) immunisierten, wurden am C-Terminus der kurzen α-Helix des myc-tag-Peptides zusätzlich sieben Aminosäuren als α-Helix in die Kristallstruktur modelliert (Abb. 6.4. B). Laut diesem Modell befindet sich der verlängerte α-helikale C-Terminus des Peptides in direkter Nachbarschaft zur CDR-H3. Wechselwirkungen der CDR-H3 mit den ihr zugewandten Seitenresten des Peptides wären nicht auszuschließen. Unter der Annahme weiterer Kontakte des myc-Peptides zum 9E10 wurde das in der Literatur beschriebene Epitop E410QKLISEEDL419 nicht nur am C- sondern auch am N-Terminus verlängert und das neue Peptid A408EEQKLISEEDLLRKRREQL427 in Bindungsexperimenten getestet.

Das 9E10-Fab und die Fabs der Keimbahnrückmutanten wurden somit in ihrer Bindung zu einem 8-, 11- und einem 20-mer myc-Peptid untersucht.

6.4 Mutagenesestudien an 9E10 und bakterielle Fab-Expression in E. coli

Mutagenesestudien

Die Rückmutation der 9E10-V-Regionen auf die Sequenz der Gensegmente VH3.3:39, DFL16.1, JH4 sowie VL21-2* und J1 wurde mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese mittels PCR durchgeführt.

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Die Arbeiten von Schiweck (Schiweck et al., 1997) haben gezeigt, dass eine funktionelle periplasmatische Expression von 9E10-Fab in E. coli mit Hilfe des Expressionsvektors pASK85 möglich ist. In dieser Arbeit sollten die 9E10-Rückmutanten als Fab in E. coli synthetisiert werden. Auch hier diente pASK85 als Expressionsvektor, kodierend unter anderem für die konstanten murinen Immunglobulinregionen CL und CH1 der Klasse κ und γ1, die Signalpeptidsequenzen OmpA und PhoA und den C-terminalen His(6)-tag an der CH1-Domäne. Die Immunglobulinklasse der konstanten Domänen im 9E10-Fab bleibt somit für die Expression in E. coli unverändert (siehe dazu Evan et al., 1985). Die Expression von Fab hat zudem den Vorteil, dass der Winkel zwischen der VH- und VL-Domäne des 9E10 nicht geändert wird, im Gegensatz zum scFv, das hier eine höhere Flexibilität aufweisen kann. Die Fusion des His-tag mit der schweren Kette hat zudem den Vorteil, dass bei einer Reinigung des Fab über den His-tag Leichteketten-Homodimere nicht angereichert werden können. Im Gegensatz zu Leichteketten-Homodimeren sind Schwereketten-Homodimere sehr selten, so dass ihre Ausbildung hier weniger zu erwarten wäre. Es wird ebenfalls als wenig wahrscheinlich angesehen, dass sich einzelne, lösliche schwere Ketten (VH-CH1) bilden. Als Ausgangskonstrukt für die Rückmutationen in den 9E10 variablen Regionen wurde der pASK85-9E10 mit den 9E10 variablen Regionen aus der Hybridomzelllinie Myc1 (Griebel, 2005) verwendet.

Die Einführung sowohl von Einzel- als auch Mehrfachmutationen in den Genen des 9E10 erfolgte mit Hilfe von Primern. Genabschnitte, ganze Gene oder der gesamte pASK85-9E10-Vektor wurden mit mutierten Primern amplifiziert, wobei die Amplifikation kurzer Genabschnitte bevorzugt angewendet wurde, um PCR bedingte Mutationen im Vektor zu vermeiden. Mit dem Einsatz von Primern konnten eine oder mehrere Mutationen gleichzeitig in ein amplifiziertes PCR-Produkt eingeführt werden. Eine Markierung der Primer mit Restriktionsschnittorten machte eine anschließende schnelle Identifizierung der mutierten Gene möglich. In Abhängigkeit von der Lage der zu mutierenden Positionen im Gen und der Entfernung zu potentiellen Klonierungsschnittstellen wurden verschiedene Strategien angewandt. So wurden die Einzelmutationen HH31S, GH52S und auch die Mehrfachmutationen über die Amplifikation einzelner Genabschnitte aus dem pASK85-9E10 mit anschließender Assemblierung der PCR-Produkte für die Klonierung über Restriktionsschnittorte in den Vektor (Abb. 6.5.) und Ligation in den Vektor hergestellt. Die Synthese der Einzelmutanten 9E10 RH53G und HH58Y erfolgte mit den von U. Griebel zur Verfügung gestellten Primern in mehreren aufeinander folgenden PCR-Reaktionen, die der Einzelmutanten 9E10 SH100hY, FL30I und TL91S dagegen in einer einzigen PCR-Reaktion.

Abb. 6.5. : Gentechnische Herstellung einer Rückmutante am Beispiel von 9E10 HH31S. Dargestellt sind Ethidiumbromid-angefärbte Agarosegele (2%) der (A.) gereinigten, aus dem pASK85-9E10 amplifizierten DNA-Fragmente 207 bp (1-3) und 315 bp (4-6) und (B.) des Assemblierungsproduktes (479 bp) aus der Synthese des Konstruktes pASK85-9E10(HH31S). Die abgeschätzte DNA-Menge pro Bande beträgt ca. je 5; 15 und 50 ng. M entspricht dem Marker Smart DNA Ladder.

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Die so entstandenen, Keimbahn-rückmutierten 9E10-Gene im pASK85 wurden in die stabile E. coli-XL-1-Zelllinie, die geringe genetische Veränderungen aufweist, transformiert und anschließend selektiert. Die mutierten 9E10-Varianten im pASK85-Vektor konnten über einen für jede Mutation spezifischen Restriktionsverdau identifiziert werden. Die Zellen, die die mutierten pASK85-9E10(x) Konstrukte enthielten, wurden im analytischen Maßstab kultiviert und auf periplasmatische Expression von Fab untersucht. Nach dem Periplasmaaufschluss der Zellen wurden sowohl die lösliche als auch die unlösliche Fraktion mittels SDS-Gelelektrophorese und Western-Blot untersucht. Vektoren erfolgreich exprimierender Zellklone wurden zur Kontrollsequenzierung der mutierten variablen Regionen verwendet.

Fab-Expression

Das lösliche periplasmatische Fab-Expressionsmuster ist für alle 9E10-Rückmutanten, bis auf 9E10 HH31S, gleich (Abb. 6.6.A.). Die Abbildung 6.6.A. zeigt das Expressionsmuster von 9E10-Fab und von der Rückmutante 9E10 HH31S, die bei 37°C kultivierten Zellkulturen entstammen. Dargestellt wird das Expressionsmuster von jeweils zwei unabhängigen, Fab exprimierenden Klonen der E. coli-JM83-Zelllinie. Zu erwarten wären im Western-Blot nach einer Proteinauftrennung in einer nicht reduzierenden SDS-PAGE, eine im Idealfall einzelne Proteinbande mit einer Molekularmasse von ca. 50 kD, die das Fab repräsentiert und in der sowohl die VH-CH1-His-tag- als auch die VL-CL-Kette mit den jeweiligen spezifischen Nachweisantikörpern nachweisbar sind. Nicht assemblierte einzelne Ketten sollten mit einer Molekularmasse von 26 kD für VH-CH1-His-tag bzw. 24 kD für VL-CL auftreten. In den Western-Blots sind dagegen neben den Fab-Fragmenten einzelne Ketten und möglicherweise auch Leichteketten-Homodimere detektierbar. Die Abbildung zeigt, dass in der Negativkontrolle mit den Zellen (JM83), die nicht mit dem Expressionsvektor transformiert wurden, keine Bindungsreaktion der Nachweisantikörper anti-kappa und anti-His(6) mit zelleigenen Proteinen zustande kommt. Bei den löslichen periplasmatischen Proben, die aus den 9E10-Fab exprimierenden Klonen stammen, werden mit dem anti-His-Antikörper eine Proteinbande mit einer Molekularmasse von ca. 46 kD (Fab) und eine mit ca. 30 kD (VH-CH1-His-tag) beobachtet. Mit dem anti-kappa-Antikörper werden eine Doppelbande mit einer Molekularmasse von ca. 46 kD und eine Bande bei ca. 21,5 kD (VL-CL) nachgewiesen. Bei der Bande mit der höheren Molekularmasse (obere Bande) in der 46 kD-Doppelbande handelt es sich um ein mit dem His-tag fusioniertes Fab.

Die Rückmutation HH31S im 9E10 bewirkt eine höhere Fab-Ausbeute, was sich im Verhältnis der beiden Doppelbanden untereinander wiederspiegelt (Abb. 6.6.A). Im Western-Blot erscheint die Proteinbande mit der höheren Molekularmasse (Fab) intensiver als die mit der geringeren (untere Bande). Bei der Bande mit der geringeren Molekularmasse (untere Bande) in der 46-kD-Doppelbande könnte es sich um Leichteketten-Homodimere mit einer errechneten Molekularmasse von ca. 48 kD handeln, da hier ausschließlich leichte Ketten nachgewiesen werden konnten.

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Abb. 6.6. : Western-Blots der bakteriellen Produktion von Fab. Die Proben wurden zuvor in 12% nicht reduzierender SDS-PAGE aufgetrennt. (A.) Fab-Expressionsmuster zweier Klone von 9E10 (2, 3, 7 und 8) und der Rückmutante HH31S (4, 5, 9 und 10) in JM83-Zellen (8 µl von 100 µl PP). Die Bahnen 1 und 6 entsprechen der löslichen periplasmatischen Fraktion von nicht mit dem Expressionsvektor transformierter Zellen (8 µl von 1:100 Konzentrierung der ZK). In den Bahnen 1-5 erfolgte der Nachweis der schweren Kette und in den Bahnen 6-10 der der leichten Kette, wie unter (B.) beschrieben wird. (B.) Nachweis der murinen leichten Kette (1-3) mit anti-kappa-Ig-HRP und der schweren Kette über den His-tag (4-6) mit (anti-His(6)-Ig-HRP) in der unlöslichen (je 1 µl von 1:100 Konzentrierung der ZK (1, 3, 4 und 6)) periplasmatischen Fraktion inklusive der Sphäroplasten der zur 9E10-Expression nicht induzierten (1 und 4) und induzierten (3 und 6) XL-1-Zellen. Zum Vergleich dient das lösliche Periplasma induzierter Zellen (je 18 µl von 1:100 Konzentrierung der ZK (2 und 5)). M entspricht dem Molekulargewichtsmarker.

Die Western-Blot-Analysen in der Abb.6.6.B zeigen zum Vergleich den Anteil der schweren (VH-CH1-His-tag) und leichten Kette (VL-CL) des 9E10 in der löslichen und unlöslichen Fraktion des Periplasmaaufschlusses. Untersucht wurde dies in der E. coli-XL-1-Zelllinie. Zur Kontrolle wurden mit dem pASK85-9E10 transformierte XL-1-Zellen verwendet, jedoch wurde die Expression der Gene der Fab-Fragmente nicht induziert. In der unlöslichen Fraktion des Periplasmaufschlusses der nicht induzierten E. coli-Zellen war kein Protein mit dem anti-His- und dem anti-kappa-Antikörper nachzuweisen. Zur Aggregation neigende, periplasmatisch exprimierten Proteine sind in der unlöslichen Fraktion des Periplasmaufschlusses des exprimierenden Klons nachgewiesen worden, sie bilden Einschlusskörper. Der überwiegende Teil der mit dem anti-His-Antikörper detektierten schweren Kette VH-CH1-His-tag ist in der unlöslichen Fraktion des Aufschlusses in Höhe der 30 kD-Markerbande detektierbar. Die leichte Kette VL-CL, die vom anti-kappa-Antikörper erkannt wird, akkumuliert hingegen vorrangig in der löslichen Fraktion. Die zum Fab assemblierten Ketten werden lediglich als schwache Bande im Western-Blot in der löslichen Fraktion bei 46 kD sichtbar. Diese Bande wird von beiden Antikörpern, dem anti-His und anti-kappa gebunden. Das Expressionsmuster der Fab-Fragmente ist unabhängig von den getesteten Zellstämmen XL-1, dem schnell wachsenden JM83 (Abb. 6.6.A) und dem Protease (OmpT, Lon)-defizienten BL21-Stamm (Daten nicht gezeigt).

Fab-Expression im präparativen Maßstab

Die Synthese der Fab-Fragmente in den E. coli-XL-1-Zellen erfolgte für den präparativen Maßstab in vier Litern Flüssigkultur aus den zuvor bei einer niedrigeren Temperatur (22°C) angezogenen Zellen. Die Induktion der periplasmatischen Epression unter der Kontrolle des tet-Promotors/Operators erfolgte mit Anhydrotetracyclin und dauerte 2,5 Stunden wie von Schiweck beschrieben (1997). Die löslichen Bestandteile des Periplasmas wurden nach einem Aufschluss nach Skerra (1994) freigesetzt und anschließend dialysiert und gereinigt.

In vitro Fab-Rückfaltung

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Da ein großer Teil der schweren Kette in der unlöslichen Fraktion des periplasmatischen Aufschlusses (Abb. 6.6.B.) vorgefunden wurde, lag die Vermutung nahe, dass die schweren Ketten bevorzugt als inclusion bodies (Einschlusskörper) in den Zellen abgelegt werden. Aufgrund des höheren Proteinbedarfs für die Charakterisierung der schwächer affinen Konstrukte L9E10/HKeimbahn und LKeimbahn/HKeimbahn wurden jene mittels Rückfaltung gewonnen. Zum Vergleich der Bindungsspezifität zwischen den periplasmatisch und den in vitro gefalteten Fabs wurde LKeimbahn/H9E10 ebenfalls rückgefaltet und die Bindungsspezifität der beiden Konstrukte verglichen. Hierfür wurden die Zellen nach der Expression komplett aufgeschlossen. Der lösliche Bestandteil (leichte Kette) dieses Aufschlusses als auch die gereinigten inclusion bodies (schwere Kette) wurden in Guanidinhydrochlorid unter reduzierenden Bedingungen denaturiert, anschließend langsam bei 10°C gegen das Redoxpaar GSH/GSSG in einer Dialyse renaturiert und wie im Kapitel 6.5. beschrieben gereinigt.

6.5 Reinigung der Fab-Fragmente

Die mit einem His(6)-Tag fusionierten Fab-Fragmente konnten in einer Affinitätschromatographie mit immobilisierten Co2+-Ionen in einem Schritt gereinigt werden, verbunden mit anschließender Einengung der Proben durch Filtration (30 kD MWCO). Die Abbildungen 6.7. und 6.8. zeigen das Elutionsprofil der Reinigung sowie einen Western-Blot und ein SDS-PAG der gereinigten Fab-Fragmente.

Abb. 6.7. : Elutionsprofil der chromatographischen Reinigung von periplasmatisch löslichem Fab 9E10 HH31S über den His-tag, detektiert über Absorption bei 280 nm (Bereich: 0,2 AU). (1.) Auftragen des dialysierten löslichen Periplasmas auf die Säule, (2.) Waschen der Säule und (3.) Eution.

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Das Elutionsprofil der Reinigung mit Co2+-Sepharose verdeutlicht die Anreicherung von His-tag fusionierten rekombinanten Proteinen (Abb. 6.7.). Der Erfolg dieser Reinigung konnte in der SDS-PAGE und im Western-Blot belegt werden. Im Western-Blot, dargestellt in der Abb. 6.8., lässt sich die Trennung der oberen Bande der Doppelbande bei 46 kD während der Reinigung verfolgen. Diese Bande wird angereichert und in weiteren Experimenten dieser Arbeit als funktionelles Fab charakterisiert. Jede Fab-Rückmutante wurde in separaten Chromatographiesäulen gereinigt, um Kontaminationen mit besser exprimierenden Konstrukten, wie dem 9E10 HH31S, zu vermeiden.

Abb. 6.8. : Western-Blot und SDS-PAGE der 9E10-Fab-Reinigung. (A.) Western-Blot der 9E10-Fab-Reinigung aus XL-1-Zellen. Die Proben wurden in 12% nicht reduzierender SDS-PAGE aufgetrennt. Dargestellt sind die lösliche periplasmatische Fraktion (8 µl von ca. 60 ml (1)), der Durchlauf der Säule (8 µl von ca. 60 ml (2)), das Waschen der Säule (8 µl von 30 ml (3)), das Eluat (8 µl von 5 ml (4)) und das eingeengte Eluat (0,1 µg (5)). Die Bahn 6. repräsentiert das lösliche Periplasma von nicht transformierten Zellen. Die Bahn 7. enthält die Positivkontrolle aus einem nicht gereinigten 9E10 HH31S-Fab. Der Nachweis erfolgte mit einem spezifischen Antikörper gegen das murine IgG. (B.) 15% nicht reduzierende SDS-PAGE der gereinigten Fab-Fragmente 9E10 HH31S (2) und HH58Y (3) sowie zum Vergleich von 9E10-Fab (1), gewonnen aus einer proteolytischen Abspaltung des Ig (Ch. Scholz), mit je 1 µg Protein. M entspricht dem Molekulargewichtsmarker.

Die Abbildung 6.9. zeigt einen Western-Blot eines rückgefalteten und gereinigten LKeimbahn/HKeimbahn Fab-Konstruktes. Unter reduzierenden Bedingungen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wird im Western-Blot die 46 kD-Bande mit dem anti-His(6)-Antikörper nicht mehr nachweisbar, stattdessen erscheint eine neue Bande bei 30 kD (Abb. 6.9.). Diese Analyse zeigt, dass das angereicherte Protein das VH-CH1-Fragment der schweren Kette enthält, ein Molekulargewicht um 46 kD hat (was dem von Fab-Fragmenten, ca. 50 kD, entspricht) und unter reduzierenden Bedingungen zerfällt. Die Bande im reduzierenden Lauf der SDS-PAGE in Höhe von 30 kD entspricht in etwa dem Molekulargewicht einer einzelnen schweren Kette (ca. 25 kD). Im nicht reduzierenden Lauf der SDS-PAGE sind auch einzelne lösliche schwere Ketten nachweisbar.

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Abb. 6.9. : Western-Blot von rückgefalteten und gereinigten LKeimbahn/HKeimbahn Fab (1,5 µg). Die Proben wurden in 12% SDS-PAGE aufgetrennt. Bahn 1 zeigt die schwere Kette im Fab (ca. 46 kD) und als einzelne Kette (ca. 30 kD), nachgewiesen über den His-tag im nicht reduzierenden Lauf, Bahn 3 – die einzelne schwere Kette im reduzierenden Lauf. Gleiches gilt für die Fab-Kontrolle in Bahn 2 und 4. M entspricht dem Molekulargewichtsmarker.

Bei dem hier angereicherten Protein handelt es sich um Fab-Fragmente mit nachgewiesener leichter und schwerer Kette. Allerdings wird die mit dem His-tag versehene einzelne schwere Kette in der Affinitätschromatographie nicht von den Fab-Fragmenten getrennt, was in den Abbildungen 6.8.B. und 6.9. zu erkennen ist.

Die Proteinausbeute nach der Reinigung des löslichen periplasmatisch gefalteten 9E10-Fab mit der Rückmutation HH31S über Affinitätschromatographie betrug ca. 60 µg pro 1,4 l Zellkultur. Die Ausbeute der übrigen Fab-Konstrukte, die an den selbsthergestellten Säulen gereinigt wurden, lag im Mittel bei 20-100 µg pro 4 l Zellkultur, wenn nur das lösliche periplasmatische Material verwendet wurde. Mit in vitro Rückfaltungen aus Einschlusskörpern konnten die Ausbeuten auf 0,6 bis 1,4 mg pro 1 l Zellkultur für die Konstrukte HKeimbahn/L9E10, HKeimbahn/LKeimbahn und H9E10/LKeimbahn gesteigert werden.

6.6 Biochemische Charakterisierung von 9E10-Fab und Keimbahnrückmutanten

↓65

Die Auswirkungen der somatischen Hypermutationen in den variablen Domänen des 9E10-Fab-Fragmentes auf die Affinität und Spezifität zu seinem Antigen konnten anhand von sieben Einzel-, zwei Kombinationsrückmutanten und einer Komplettrückmutante untersucht werden. Mit den kombinierten Rückmutanten LKeimbahn/H9E10 und L9E10/HKeimbahn wurde der Beitrag der einzelnen Domänen zur Reifung des Antikörpers studiert.

Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD und die Kinetik der Bindung der Keimbahnrückmutanten an die Peptide 11-mer myc-tag und 20-mer c-myc(408-427) wurde mit Hilfe eines kompetitiven ELISA nach Friguet (1985) und der Methode der Oberflächenplasmonresonanz an der Biacore bestimmt.

Die Untersuchungen zur Bindungsspezifität des Antikörpers erfolgten durch Bindungsanalysen mit myc-Peptiden, hergestellt durch Spotsynthese. Hierfür wurden Substitutionsanalysen an dem humanen 8-mer c-myc(412-420)-, 11-mer myc-tag- 18-mer c-myc(410-427), 20-mer c-myc(408-427)- und an einem substituierten 20-mer c-myc(408(E409F)-427)-Peptid durchgeführt. Ergänzende Informationen dazu lieferten Längenanalysen am humanen c-myc-Peptid und Kreuzreaktivitätsanalysen mit homologen myc-Peptiden.

6.6.1  Charakterisierung der Bindungskonstanten an c-myc-Peptide

6.6.1.1  Bestimmung von KD im ELISA

↓66

Der Nachweis der Bindung des 9E10-Fab und seiner Keimbahnrückmutanten an das myc-tag (EQKLISEEDLN) und c-myc(408-427)-Peptid (AEEQKLISEEDLLRKRREQL) und die Charakterisierung des Gleichgewichts der Wechselwirkung durch die Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD erfolgte mit Hilfe des enzymgekoppelten Verdrängungs-Immunoadsorptionstests nach Friguet et al. (1985). Dieser Test basiert auf Verdrängung der Bindung der Fab an die an der festen Phase immobilisierten myc-Peptide durch unterschiedliche Konzentrationen an frei löslichen Peptiden. Die Detektion der Bindung der Fabs an die immobilisierten myc-Peptide erfolgt über die Aktivität einer Peroxidase, die an einen Nachweisantikörper gegen konstante murine Fab-Domänen gekoppelt ist. Der KD ergibt sich aus der Konzentration an frei löslichem Peptid, bei der das Bindungssignal um die Hälfte abnimmt.

Aus der Gleichgewichtskonstanten KD wurde die freie Standardenergie ΔG° für jede Reaktion nach ΔG° = RT ln KD (Gaskonstante R = 8,3145 x 10-3 kJ K-1 mol-1, T ELISA = 298,15 K (25°C)) abgeleitet. Die Änderungen im ΔG° für die Bindung der Keimbahnrückmutanten an das myc-tag-Peptid wurden nach:

Δ(ΔG°)9E10-Rückmutante – 9E10 = RT (ln KD 9E10-Rückmutante – ln KD 9E10) berechnet und beziehen sich auf das 9E10-Fab, das aus der proteolytischen Abspaltung des IgG stammt.

KD-Bestimmung zum myc-tag-Peptid (EQKLISEEDLN)

↓67

Der in dieser Arbeit ermittelte KD des 9E10-Fab zum myc-tag-Peptid im ELISA mit 620 ± 350 nM unterscheidet sich nicht signifikant von dem in E. coli rekombinant hergestellten 9E10-Fab mit einem KD = 500 ± 200 nM (Tabelle 6.10.).

Tabelle 6.10. : Vergleich der Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD und der freien Standardenergie ΔG° von Fab 9E10 und Rückmutanten bei der Bindung an das myc-tag-Peptid im ELISA. Die ΔΔG°-Werte zeigen hier die energetischen Änderungen bei jeder Rückmutation relativ zu 9E10(1). Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten.

Fab

myc-tag-Peptid EQKLISEEDLN (ELISA)

 

KD (M)

ΔG°
(kJ/mol)

ΔΔG°
(kJ/mol)

Abnahme der Affinität, relativ zu 9E10(1)

9E10(1)

6,2 ± 3,5 x 10-7

-35,4

  

9E10

5 ± 2 x 10-7

-36

 

keine Änderung

9E10 HH58Y

8,4 ± 1,1 x 10-7

-34,7

0,7

keine Änderung

9E10 HH31S

1,15 ± 0,04 x 10-6

-33,9

1,5

~ 2-fach

9E10 TL91S

1,8 ± 0,2 x 10-6

-32,8

2,6

~ 3-fach

9E10 RH53G

4,7 ± 2,6 x 10-6

-30,4

5,0

~ 8-fach

9E10 GH52S

nicht auswertbar

9E10 FL30I

nicht auswertbar

9E10 SH100hY

nicht auswertbar

LKeimbahn/H9E10

nicht auswertbar

L9E10/HKeimbahn

nicht detektierbar

LKeimbahn/HKeimbahn

nicht detektierbar

Das Bindungsverhalten der Keimbahnrückmutanten kann daher im Vergleich zum 9E10-Fab, entstanden aus der partiellen Proteolyse des IgG, charakterisiert werden. ΔG° der Bindungsreaktion für den 9E10-Fab ist mit -35,4 kJ/mol stark exergonisch und befindet sich im Bereich biologisch relevanter Reaktionen (-20 bis -80 kJ/mol).

↓68

Den größten Verlust in der freien Standardenergie mit 5 kJ/mol bei der Bindung an das myc-tag-Peptid liefert die VH-Rückmutation RH53 zu G (KD = 4,7 ± 2,6 µM) im mutierten Fab. Die Rückmutationen TL91 zu S in VL (KD = 1,8 ± 0,2 µM) und HH31 zu S in VH (KD = 1,15 ± 0,04 µM) beeinflussen ΔG° mit Verlusten von 2,6 und 1,5 kJ/mol nur leicht und führen nur zur einer geringen Abnahme in der Affinität. Die Rückmutation HH58 zu Y (KD = 840 ± 110 nM) hat keinen Einfluss auf die Affinität. Die Prüfung der weiteren Keimbahnrückmutanten auf Bindung im Verdrängungs-ELISA ergab, dass die gemischte Keimbahnrückmutante LKeimbahn/H9E10 eine sehr schwache Bindung an das myc-tag-Peptid zeigte. Bei L9E10/HKeimbahn und LKeimbahn/HKeimbahn war hingegen keine Bindung an das myc-tag-Peptid detektierbar. Die Einzelrückmutanten 9E10 FL30I, GH52S und SH100hY haben mit einem sehr schwachen Signal an das myc-tag-Peptid gebunden, das keine genaue Bestimmung des KD-Wertes zuließ.

KD-Bestimmung zum c-myc(408-427)-Peptid (AEEQKLISEEDLLRKRREQL)

Mit Verlängerung des Epitops fällt auch der KD des 9E10-Fab von 620 ± 350 nM auf 6,8 ± 1,6 nM (Abb. 6.11. und Tabelle 6.12.) um das 90-fache, dabei sinkt die freie Standardenergie von -35,4 kJ/mol auf -46,6 kJ/mol. Die Affinität zum verlängerten myc-Peptid (20-mer) nimmt also zu. Die relative Affinität der myc-Peptide zum 9E10-Fab wird durch den Unterschied im ΔG° der Bindung nach: Δ(ΔG°)myc (408-427) - myc-tag = RT (ln KD myc(408-427) - ln KD myc-tag ) wiedergegeben. So ergibt sich in den ELISA-Experimenten ein Δ(ΔG°)myc (408-427) - myc-tag = -11,2 kJ/mol. Das verlängerte myc-Peptid bringt also einen Gewinn von 11,2 kJ/mol für die freie Standardenergie der Bindung. Damit werden Affinitätsmessungen für die Rückmutanten 9E10 GH52S, SH100hY, FL30I, LKeimbahn/H9E10, L9E10/HKeimbahn und LKeimbahn/HKeimbahn möglich, die mit dem kürzeren myc-tag-Peptid nicht möglich oder nicht auswertbar waren.

Der Austausch von FL30 durch das im Keimbahngen VL21-2* kodierte I erhöht den KD um das 6-fache auf 38 ± 4 nM, was einen Verlust von 4,2 kJ/mol für die freie Standardenergie bedeutet. Während im 9E10-Fab die Rückmutationen GH52S (KD = 6,3 ± 0,7 nM) den KD nicht signifikant beeinflusst, verursacht SH100hY mit einem Anstieg im KD auf 59 ± 6 nM die größte Affinitätseinbusse (5,3 kJ/mol) von allen in dieser Arbeit beschriebenen Einzelrückmutanten.

↓69

Abb.6.11. : Vergleich der Bindung des 9E10-Fab an das lösliche (A.) 20-mer c-myc(408-427)-Peptid, das mit einer höheren Affinität gebunden wird, und (B.) an das 11-mer myc-tag-Peptid in einem kompetitiven ELISA.

Tabelle 6.12. : Vergleich der Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD und der freien Standardenergie ΔG° von Fab 9E10 und von den Rückmutanten bei der Bindung an das c-myc(408-427)-Peptid im ELISA. Die ΔΔG°-Werte zeigen hier die energetischen Änderungen bei jeder Rückmutation relativ zu 9E10(1). Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten.

Fab

c-myc(408-427)-Peptid AEEQKLISEEDLLRKRREQL (ELISA)

 

KD (M)

ΔG°
(kJ/mol)

ΔΔG°
(kJ/mol)

Abnahme der Affinität, relativ zu 9E10(1)

9E10(1)

6,8 ± 1,6 x 10-9

-46,6

 

9E10 RH53G

12 ± 6 x 10-9

-45,2

keine Änderung

9E10 GH52S

6,3 ± 0,7 x 10 -9

-46,8

keine Änderung

9E10 FL30I

3,8 ± 0,4 x 10-8

-42,4

4,2

~ 6-fach

9E10 SH100hY

5,9 ± 0,6 x 10-8

-41,3

5,3

~ 9-fach

LKeimbahn/H9E10

7,6 ± 2,4 x 10-7

-34,9

11,7

~ 100-fach

L9E10/HKeimbahn

5,3 ± 3,3 x 10-6

-30,1

16,5

~ 800-fach

LKeimbahn/HKeimbahn

~ 2 x 10-3

~ -15

~ 31

~ 300000-fach

Daten aus der Kristallstrukturanalyse zeigen die schwere variable Domäne mit dem größten Anteil an der Bindung zum myc-tag-Peptid (Krauß et al., 2007). Mit vierzehn Hypermutationen in der Affinitätsreifung ist sie die Domäne mit den meisten Austauschen. Im ELISA-Experiment verliert das 9E10-Fab durch die vierzehn Rückmutationen in der VH-Domäne ca. 800-mal an Affinität (KD = 5,3 ± 3,3 µM). Die VL-Domäne mit sechs Rückmutationen bringt einen ca. 100-fachen Affinitätsverlust (KD = 760 ± 240 nM). Die Rückmutation der schweren variablen Domäne in L9E10/HKeimbahn hat mit 16,5 kJ/mol einen stärkeren Verlust für die freie Standardenergie zur Folge als die Rückmutation der leichten variablen Domäne in LKeimbahn/H9E10 mit 11,7 kJ/mol.

↓70

Die Bindung des Fab LKeimbahn/HKeimbahn an das immobilisierte 20-mer c-myc(408-427)-Peptid konnte im ELISA zwar noch nachgewiesen werden, ließ sich aber mit sogar 8 mM freiem Peptid nicht vollständig verdrängen. Der im Verdrängungs-ELISA errechnete KD liegt bei ca. 2 mM, was einen sehr hohen Verlust (ca. 31 kJ/mol) für die freie Standardenergie der Bindung bedeutet. Die Analyse der Spezifität der Bindung an das freie myc(408-427)-Peptid im ELISA erfolgte mit einem statistisch in den Positionen veränderten Peptid, basierend auf der Aminosäurenzusammensetzung des c-myc(408-427)-Peptides (Abb. 6.13.).

Abb. 6.13. : Kompetition der Bindung von (a.) 9E10-Fab und (b., c.) von Fab der kom pletten 9E10-Keimbahnrückmutante an das immobilisierte c-myc(408-427) Peptid mit (a., b.) löslichem c-myc(408-427) bzw. (c.) einem randomisierten Peptid (LDIKLQERESRKLRQEEAEL) im ELISA.

Im Verdrängungs-ELISA nimmt das Bindungssignal erst bei einer Konzentration von 6,6 mM an freiem randomisierten Peptid ab. Diese Daten zeigen im ELISA eine sehr schwache Affinität des Fab-Fragmentes des 9E10-Vorläufers zum verlängerten löslichen myc-Peptid, was aber dennoch gebunden wird. Trotz der schlechten Bindung könnte das Fab LKeimbahn/HKeimbahn kodiert durch die Keimbahngene VH 3:3.39, DFL16,1 und JH4 für VH und VL21-2* und J1 für VL der Vorläufer vom 9E10 sein. Spätere Bindungsexperimente bestätigen dies.

↓71

Die Keimbahnrückmutante 9E10 RH53G (KD = 12 ± 6 nM) weist, verglichen mit dem 9E10-Fab (KD = 6,8 ± 1,6 nM), nur geringere Affinitätsänderungen zum 20-mer c-myc(408-427)-Peptid auf. Kalkuliert man den hier aufgetretenen Fehler mit ein, unterscheidet sich das Bindungsverhalten dieser Mutante in der Affinität nicht vom 9E10-Fab. Aus diesem Grunde wurden diese Rückmutanten sowie die Rückmutanten 9E10 TL91S und HH31S, die bereits geringe Unterschiede in der Affinität zum myc-tag-Peptid aufweisen, in ihrer Bindung ausschließlich zum myc-tag-Peptid charakterisiert.

Durch die Charakterisierung der Bindung der Keimbahnrückmutanten zu beiden myc-Varianten konnten geringe und größere Unterschiede in der Affinitätsänderung besser herausgestellt werden.

6.6.1.2 Bestimmung von KD und der kinetischen Konstanten kon und koff mit SPR

Der Einfluss der Rückmutationen im 9E10-Fab auf die Kinetik der Ausbildung der Fab-myc-Peptid-Komplexe erfolgte mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz an der Biacore. Gemessen wurden für diese Reaktionen die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante kon (1/Ms) und die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante koff (1/s). Die Berechnung dieser Konstanten erfolgte mit Hilfe der Biaevaluation Software unter der Annahme eines einfachen Modells einer reversiblen einstufigen Bindung im Verhältnis 1 zu 1: Fab + Peptid ⇄ Fab-Peptid. Mit diesem Model ließen sich die experimentellen Daten gut beschreiben.

↓72

Das Cys-myc-tag-Peptid und das Cys-myc(408-427)-Peptid wurden jeweils über den N-Terminus an der Oberfläche des CM5-Biacorechips immobilisiert, und das Fab von 9E10 und den Keimbahnrückmutanten wurde über die Chipoberfläche geleitet. Die Bindungsstärke wurde aus den gemessenen kon- und koff-Daten errechnet und als Gleichgewichts-dissoziationskonstante KD (M) wiedergegeben (KD = koff/kon). Aus der Gleichgewichts-konstante KD wurden die freie Standardenergie ΔG° und deren Änderungen abgeleitet. Zusätzlich zu diesen Messungen wurde auch ein KD der Bindung des 9E10-Fab an das myc-tag-Peptid aus Gleichgewichtstitrationen ermittelt.

Bindung des 9E10-Fab an das myc-tag- (EQKLISEEDLN) und c-myc(408-427)-Peptid (AEEQKLISEEDLLRKRREQL)

Ein Vergleich der Geschwindigkeitskonstanten kon und koff bei der Bindung des 9E10-Fab an das myc-tag- und c-myc(408-427)-Peptid zeigt eine Veränderung in beiden Konstanten zugunsten einer höheren Affinität des 9E10-Fab zum verlängerten myc-Peptid (Tabelle 6.14.).

Tabelle 6.14. : Vergleich der Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten kon und koff bei der Bindung der Keimbahnrückmutanten und des gereiften 9E10-Fab an die myc-Peptide. Die Konstanten wurden mit der Methode der Oberflächenplasmonresonanz ermittelt. Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten. Die Änderungen in den Konstanten sind relativ zu 9E10-Fab(1).

Fab

myc-tag-Peptid EQKLISEEDLN (SPR)

 

kon (103 M-1s-1)

Abnahme kon

koff (10-3 s-1)

Zunahme koff

9E10(1)

2,54 ± 0,04

 

2,30 ± 0,04

 

9E10

2,1 ± 0,2

keine Änderung

1,78 ± 0,05

keine Änderung

9E10 HH58Y

1,86 ± 0,04

keine Änderung

2,1 ± 0,1

keine Änderung

9E10 HH31S

1,99 ± 0,01

keine Änderung

4,79 ± 0,02

~ 2

9E10 TL91S

1,32 ± 0,02

~ 2

9,13 ± 0,04

~ 4

9E10 RH53G

0,15 ± 0,01

~ 20

3,24 ± 0,02

>1

Fab

myc(408-427)-Peptid AEEQKLISEEDLLRKRREQL (SPR)

 

kon (103 M-1s-1)

Abnahme kon

koff (10-3 s-1)

Zunahme koff

9E10(1)

99 ± 4

 

0,12 ± 0,03

 

9E10 FL30I

70 ± 1

>1

0,86 ± 0,03

~ 7

9E10 GH52S

2,28 ± 0,04

~ 40

0,11 ± 0,05

keine Änderung

9E10 SH100hY

2,34 ± 0,03

~ 40

0,19 ± 0,04

keine Änderung

LKeimbahn/H9E10

8,49 ± 0,02

~ 10

3,67 ± 0,02

~ 30

L9E10/HKeimbahn

1,7 ± 0,1

~ 60

0,8 ± 0,1

~ 7

LKeimbahn/HKeimbahn

1,14 ± 0,02

~ 90

4,46 ± 0,05

~ 40

↓73

Die Verlängerung des Peptides verändert die Assoziationskinetik des 9E10-Fabs von einer langsamen (kon = 2,54 x 103 M-1 s-1)zu einer mittelschnellen (kon = 9,9 x 104 M-1 s-1) um das ca. 40-fache. Die Dissoziation der Komplexe ändert sich von mittelschnell dissoziierend (koff = 2,3 x 10-3 s-1) zu langsam dissoziierend (koff = 1,2 x 10-4 s-1) um das ca. 20-fache. Die höhere Affinität zum myc(408-427)-Peptid kommt also durch eine stärkere Änderung von kon als von koff zustande. KD der Bindung von 9E10-Fab zum myc(408-427)-Peptid sinkt hier um das ca. 750-fache von 902 ± 1 nM auf 1,2 ± 0,3 nM. Der Δ(ΔG°)myc (408-427) - myc-tag beträgt -16,3 ± 1,3 kJ/mol.

Die Assoziationsgeschwindigkeit an das myc-tag-Peptid, die für das in E. coli rekombinant hergestellte 9E10-Fab mit 2,1 ± 0,2 x 103 M-1 s-1ermittelt wurde, weicht unwesentlich vom kon des 9E10-Fab (kon = 2,54 ± 0,04 x 103 M-1 s-1) ab, das proteolytisch vom IgG abgespalten wurde. Gleiches trifft auch für den koff zu, der 1,78 ± 0,05 x 10-3 s-1 für das rekombinante und 2,30 ± 0,04 x 10-3 s-1 für das nicht rekombinante 9E10-Fab bei der Bindung an das 20-mer-Peptid beträgt. Änderungen in den Konstanten, bedingt durch Rückmutationen im 9E10, wurden dann als gegeben angesehen, wenn es zu signifikanten Abweichungen zu den Konstanten von 9E10-Fab aus der partiellen Proteolyse des IgG und vom rekombinant hergestellten Fab kam. KD der Bindung vom rekombinanten 9E10-Fab an das myc-tag-Peptid beträgt 800 ± 100 nM (siehe auch Tabelle 6.18.).

Mit der SPR-Methode an der Biacore konnte bei einer Laufgeschwindigkeit von 10 µl/min für 2 min keine Sättigung der myc-tag-Peptidbindungsfläche an der Chipoberfläche mit 9E10-Fab (gewonnen aus der Proteolyse des 9E10-IgG) erreicht werden (Abb. 6.15.A). Die Abbildung 6.15.B. zeigt die Bindung des 9E10-Fab an das verlängerte 20-mer c-myc-Peptid(408-427) bei einer Laufgeschwindigkeit von 10 µl/min für 2 min, auch hier wird keine Sättigung der Peptidbindungsfläche erreicht. Eine Sättigung trat erst bei einer Geschwindigkeit von 1 µl/min für 15 min ein (Abb. 6.16.). Der KD von 830 nM ergab sich aus der Konzentration an 9E10-Fab bei halber Signalsättigung. Ein KD von 814 ± 141 nM errechnete sich aus dem Quotienten der ermittelten kinetischen Konstanten koff und kon (koff/kon) der selben Messung.

↓74

Abb. 6.15. : Bestimmung der kinetischen Konstanten kon und koff bei der Bindung unterschiedlicher Konzentrationen des 9E10-Fab an das (A.) myc-tag- und (B.) c-myc(408-427)-Peptid mit der SPR-Methode. Die Laufgeschwindigkeit des Puffers beträgt 10 µl/min. Die unteren Graphen zeigen die Übereinstimmung der experimentellen Daten mit dem Modell der Ein-Schritt-Bindung. Δ gibt die Abweichung zwischen den experimentell ermittelten Werten und dem mathematischen Modell an.

Abb.6.16. : Bestimmung des KD der Bindung des 9E10-Fab an das myc-tag-Peptid mit der SPR-Methode. SPR-Sensorgramm der Bindung unterschiedlicher Konzentrationen von 9E10-Fab an die myc-tag-Peptid beschichtete Chipoberfläche bei einer Pufferlaufgeschwindigkeit von 1 µl/min.

Einfluss der Rückmutationen im 9E10-Fab auf die Bindung

Die Messung der kinetischen Konstanten kon und koff bei der Bindung der Fab-Fragmente der Keimbahnrückmutanten an die myc-Peptide zeigt eine Veränderung dieser Konstanten ausgelöst durch die Rückmutationen im 9E10. Deutlich wird dies beim Vergleich der 9E10-Rückmutante mit dem gereiften 9E10-Fab. Die höhere Affinität des 9E10-Fab zum c-myc(408-427)-Peptid resultiert aus einer Beschleunigung der Assoziation von kon = 1,14 ± 0,02 x 103 M-1s-1auf kon = 0,99 ± 0,04 x 105 M-1s-1um das ca. 90-fache und aus einer Verlangsamung der Dissoziation der Komplexe um das ca. 40-fache von koff = 4,46 ± 0,05 x 10-3 s-1 auf koff = 1,2 ± 0,3 x 10-4 s-1 (Tabelle 6.14.). Hier zeigt sich auch ein unterschiedlicher Beitrag der beiden variablen Domänen zu den Kinetiken der Bindungsreaktion.

↓75

Die folgende Abbildung 6.17. beschreibt die Bindung des Fab-Fragmentes der kompletten 9E10-Rückmutante an das c-myc-(408-427)-Peptid an der Biacore, gemessen nach der Methode der SPR.

Abb. 6.17. : SPR-Sensorgramm der Bindung unterschiedlicher Konzentrationen der kompletten Fab-Keimbahnrückmutante HKeimbahn/LKeimbahn an das c-myc(408-427)-Peptid und die Übereinstimmung der Daten mit dem Modell der Ein-Schritt-Bindung.Δ gibt die Abweichung zwischen den experimentell ermittelten Werten und dem mathematischen Modell an.

Einfluss der VH-Rückmutationen im 9E10-Fab auf die Bindung

Die größte Abnahme für die Assoziationsgeschwindigkeit (um das 60-fache) liefert die komplett rückmutierte VH-Domäne im 9E10-Fab (Tabelle 6.14.). Die Assoziationsgeschwindigkeit verlangsamt sich auf 1,7 ± 0,1 x 103 M-1s-1, wenn man VH im 9E10-Fab auf die Sequenz der Keimbahngene VH 3:3.39, DFL16.1 und JH4 rückmutiert. Die Dissoziationsgeschwindigkeit unterliegt leichteren Änderungen, sie nimmt um einen Faktor von ca. 7 auf 0,8 ± 0,1 x 10-3 s-1 zu, was bedeutet, dass die Komplexe an stabilisierender Energie verloren haben. Von den in dieser Arbeit getesteten Einzelrückmutationen zeigen ausschließlich die Substitutionen in der VH-Domäne, nämlich GH52 zu S (kon = 2,28 ± 0,04 x 103 M-1s-1 ), RH53 zu G (kon = 0,15 ± 0,01 x 103 M-1s-1 )und SH100h zu Y (kon = 2,34 ± 0,03 x 103 M-1s-1), den größten Einfluss auf die Änderung von kon bei der Bindung an die myc-Peptide unter den hier gewählten Bedingungen. Die Bindung von 9E10-Fab mit der Rückmutation RH53G an das myc-tag-Peptid führt zu einer ca. 20-fachen Abnahme der Assoziationsgeschwindigkeit (kon = 0,15 ± 0,01 x 103 M-1s-1). Bei den Rückmutationen GH52S und SH100hY sind jeweils ca. 40-fache Abnahmen in der Assoziationsgeschwindigkeit bei der Bindung des Fabs an das c-myc(408-427)-Peptid zu verzeichnen. Die Unterschiede in der Dissoziationsgeschwindigkeit der Fab-Fragmente von 9E10 GH52S (koff = 0,11 ± 0,05x10 -3s-1 ) und 9E10 SH100hY (koff = 0,19 ± 0,04 x 10 -3 s-1 ) im Vergleich zum 9E10-Fab liegen im Bereich der Standardabweichungen. Die Rückmutation RH53G im 9E10-Fab beschleunigt leicht die Dissoziation der Komplexe auf einen koff von 3,24 ± 0,02 x 10 -3 s-1. Eine Ausnahme stellen die Rückmutationen HH31 zu S und HH58 zu Y dar, wobei das Fab des 9E10 HH58Y bei der Bindung an das myc-tag-Peptid keinen Einfluss auf den koff nimmt (koff = 2,1 ± 0,1 x 10-3 s-1) und auch keinen auf den kon (kon = 1,86 ± 0,04 x 103 M-1s-1), wenn man die Schwankung im kon für den 9E10-Fab mit einbezieht. Der Austausch von HH31 zu S beschleunigt dagegen die Dissoziationsge-schwindigkeit des Fabs vom myc-tag-Peptid um das ca. 2-fache (koff = 4,79 ± 0,02 x 10-3 s-1 ) und trägt auf diese Weise zur einer leichten Komplexdestabilisierung bei. Im Gegensatz zu den Rückmutanten 9E10 GH52S, RH53G und SH100hY hat HH31S keinen Einfluss auf kon (kon = 1,99 ± 0,01 x 103 M-1s-1). Es fällt auf, dass die Rückmutationen GH52S, RH53G und SH100hY, also die mit den größten Betragsänderungen für kon innerhalb der hier untersuchten Einzelrückmutanten, den koff nicht oder, wie im Falle von RH53G, nur schwach beeinflussen.

Einfluss der VL-Rückmutationen im 9E10-Fab auf die Bindung

↓76

Bei der Reifung des Keimbahn-kodierten 9E10-Vorläufers zum 9E10 wird die Dissoziationsgeschwindigkeit der Komplexe durch Mutationen in der VL-Domäne stärker beeinflusst als durch die in der VH-Domäne (Tabelle 6.14.). Mutiert man VL im 9E10-Fab zurück auf das Keimbahngen 21-2*, verlangsamt sich die Assoziation um das 10-fache auf kon = 8,49 ± 0,02 x 103 M-1s-1. Die Dissoziation wird dagegen um das 30-fache beschleunigt, was sich in einem koff = 3,67 ± 0,02 x 10-3 s-1widerspiegelt. Die Einzelrückmutationen FL30 zu I und TL91 zu S im 9E10-Fab haben eine schwache Wirkung auf die Assoziationsgeschwindigkeit, jedoch die größte auf die Dissoziationsgeschwindigkeit von den getesteten Einzelrückmutanten. Das 9E10-Fab mit der Rückmutation FL30I assoziiert mit kon = 0,7 ± 0,01 x 105 M-1 s-1 an das myc(408-427)-Peptid. Dagegen beeinflusst diese Rückmutation den koff um das ca. 7-fache. Die Dissoziation der Komplexe beschleunigt sich mit dieser Rückmutation im 9E10-Fab auf koff = 0,86 ± 0,03 x 10-3 s-1. Die TL91 zu S Rückmutation im 9E10-Fab senkt die Assoziationsgeschwindigkeit der Komplexe ca. 2-mal auf kon = 1,32 ± 0,02 x 103 M-1s-1, beschleunigt jedoch die Dissoziationsgeschwindigkeit ca. 4-mal auf koff = 9,13 ± 0,04 x 10-3 s-1.

Der aus den kinetischen Konstanten errechnete KD der Bindung der Fabs zum immobilisierten myc-tag-Peptid steigt in der Reihenfolge der 9E10-Rückmutationen HH31S (KD = 2,41 ± 0,0002 µM) um das ca. 3-fache, TL91S (KD = 6,9 ± 0,1 µM) um das ca. 8-fache und bei RH53G (KD = 22 ± 1 µM) um das ca. 20-fache an (Tabelle 6.18.).

Tabelle 6.18. : Darstellung des KD der Bindung des 9E10-Fab und seiner Rückmutanten an das myc-tag bzw. myc(408-427)-Peptid, errechnet aus kon und koff, die nach der SPR-Methode gemessen wurden. Die ΔΔG°-Werte zeigen hier die energetischen Änderungen bei jeder Rückmutation relativ zu 9E10(1). Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten.

Fab

myc-tag-Peptid EQKLISEEDLN (SPR)

 

KD (M)

ΔG°
(kJ/mol)

ΔΔG°
(kJ/mol)

Abnahme der Affinität, relativ zu 9E10(1)

9E10(1)

9,02±0,01 x 10-7

-34,3

 

9E10

8 ± 1 x 10-7

-34,6

keine Änderung

9E10 HH58Y

1,1±0,1 x 10-6

-33,8

keine Änderung

9E10 HH31S

2,41±0,0002 x10-6

-31,9

2,4

~ 3-fach

9E10 TL91S

6,9±0,1 x 10-6

-29,3

5

~ 8-fach

9E10 RH53G

2,2±0,1 x 10-5

-26,4

7,8

~ 20-fach

9E10 FL30I

nicht detektierbar

9E10 GH52S

nicht detektierbar

9E10 SH100hY

nicht detektierbar

LKeimbahn/H9E10

nicht detektierbar

L9E10/HKeimbahn

nicht gemessen

LKeimbahn/HKeimbahn

nicht gemessen

Fab

c-myc(408-427)-Peptid AEEQKLISEEDLLRKRREQL (SPR)

 

KD (M)

ΔG°
(kJ/mol)

ΔΔG°
(kJ/mol)

Abnahme der Affinität, relativ zu 9E10(1)

9E10(1)

1,2 ± 0,3 x 10-9

-50,7

 

9E10 FL30I

1,23 ± 0,03 x 10-8

-44,8

5,8

~ 10-fach

9E10 GH52S

5 ± 2 x 10-8

-41,6

9,1

~ 40-fach

9E10 SH100hY

8 ± 2 x 10-8

-40,2

10,5

~ 70-fach

LKeimbahn/H9E10

4,32 ± 0,02 x 10-7

-36,1

14,6

~ 360-fach

L9E10/HKeimbahn

4,8 ± 0,2 x 10-7

-35,9

14,8

~ 400-fach

LKeimbahn/HKeimbahn

3,93 ± 0,04 x 10-6

-30,6

20

~ 3300-fach

↓77

Der ΔG° der Bindung erhöht sich dabei von -34,4 kJ/mol um 2,4; 5,0 und 7,8 kJ/mol. Die Rückmutation HH58Y im Fab 9E10 (KD = 1,1 ± 0,1 µM) ändert die Affinität zum myc-tag-Peptid nicht. Bei der Bindung an das immobilisierte c-myc(408-427)-Peptid erhöht sich der KD des 9E10-Fab mit der Rückmutation FL30I (KD = 12,3 ± 0,3 nM) um das ca. 10-fache, mit GH53S (KD = 50 ± 20 nM) um das ca. 40-fache, mit SH100hY (KD = 80 ± 20 nM) um das ca. 70-fache, mit LKeimbahn (KD = 432 ± 2 nM) um das ca. 360-fache sowiemitHKeimbahn (KD = 480 ± 20 nM) um das ca. 400-fache und schließlich mit der kompletten Rückmutation um das ca. 3300-fache auf 3,93 ± 0,04 µM. Der ΔG° der Bindung steigt dabei von -50,7 kJ/mol um 5,8; 9,1; 10,5; 14,6; 14,8 und 20 kJ/mol auf -30,6 kJ/mol.

6.6.2 Charakterisierung der Bindungsspezifität

6.6.2.1  Substitutionsanalysen an c-myc-Peptiden

In den Substitutionsanalysen am myc-Peptid wird jede Position des zu untersuchenden Peptides durch die zwanzig Gen-kodierten Aminosäuren ausgetauscht. Pro Peptidspot erfolgt ein Austausch. In der äußeren linken Spalte der Matrix (zusehen in den Abbildungen der Substitutionsanalysen) wurden Peptide mit der Wildtypsequenz synthetisiert, während in den übrigen Spalten Peptide mit jeweils einem Austausch synthetisiert wurden. Da durch alle zwanzig Gen-kodierten Aminosäuren ausgetauscht wird, entstehen so pro Reihe zwei Peptidspots mit der Wildtypsequenz. Auf diese Weise kann die Spezifität des Antikörpers zu einzelnen Punktmutanten des Peptides geklärt und Schlüsselpositionen im Peptid ermittelt werden. Der Nachweis der Bindung der Fab-Fragmente an die Peptide war durch eine Chemilumineszenzreaktion mit einem gegen murine Immunglobulindomänen gerichteten HRP-markierten Antikörper möglich. Die Intensität der Lumineszenz korreliert mit der Bindungsstärke der Fab-Fragmente an die Peptide. Die folgenden Abbildungen sind eine Negativdarstellung der detektierten Lumineszenz. Je dunkler der Spot auf der Matrix desto stärker die Bindung.

Eine Substitutionsanalyse am 11-mer myc-tag-Peptid konnte mit allen in dieser Arbeit getesteten Rückmutanten durchgeführt werden, bis auf die komplette 9E10-Rückmutante LKeimbahn/HKeimbahn, die keine nachweisbare Bindung an das myc-tag-Peptid aufwies. Mit dem Fab LKeimbahn/HKeimbahn waren jedoch Substitutionsanalysen an den höher affinen c-myc-Peptiden 408-427; 410-427 und an einem modifizierten c-myc(408(E409F)-427)-Peptid möglich. Zuzüglich wurden die Fabs LKeimbahn/H9E10 und L9E10/HKeimbahn in ihrer Spezifität zum substituierten c-myc(408-427) Peptid charakterisiert. Außerdem wurde die Bindungsspezifität zu den c-myc-Peptiden mit der Länge 408-427; 408(E409F)-427 und 410-427 auch für das 9E10-Fab charakterisiert. Substitutionsanalysen mit dem kurzen und schwachaffinen 8-mer c-myc(412-419)-Peptid waren stark von der Bindungsstärke und der Verfügbarkeit an Fab aus der Expression in E. coli abhängig und nur mit den Fabs 9E10, 9E10 HH58Y, HH31S, GH52S und LKeimbahn/H9E10 möglich. Beim Vergleich zwischen dem aus der partiellen Proteolyse des 9E10-IgG stammenden Fab und dem rekombinant exprimierten Fab in den Substitutionsanalysen an dem 8-mer c-myc(412-419)-, dem 11-mer myc-tag- und dem 20-mer c-myc(408-427)-Peptid konnte kein Unterschied in dem Substitutionsmuster festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Die folgende Tabelle 6.19. stellt eine Übersicht über die getesteten Substitutionsanalysen an den myc-Peptiden mit dem 9E10-Fab und den 9E10-Rückmutanten dar.

↓78

Hilpert et al. (2001) machten in den Substitutionsanalysen am 11-mer und dem schwächer affinen 8-mer Peptid die Beobachtung, dass mit abnehmender Affinität des 9E10-Antikörpers zum 8-mer Peptid die Schlüsselpositionen scheinbar selektiver erkannt werden, da nur wenige Substitutionen toleriert wurden. Auch in dieser hier vorliegenden Arbeit wird die gleiche Feststellung gemacht. Hilpert et al. führen dies auf einen verminderten Sättigungseffekt bei der Messung der Signale zurück, wodurch die Unterschiede zwischen den Signalen deutlicher hervortreten. In der vorliegenden Arbeit konnte die selbe Beobachtung für die Bindung der schwächer affinen 9E10-Rückmutanten gemacht werden. Zudem werden an weiteren Peptidpositionen einige Substituenten signifikant schlechter und andere besser toleriert. Diese beobachteten Effekte korrelieren mit abnehmender Gesamtaffinität des 9E10 bzw. der Rückmutanten zu den Peptiden. Zudem ist es auffällig, dass immer die selben Substitutionen besser bzw. schlechter toleriert werden. Demzufolge wurden in der vorliegenden Arbeit die Signale, die nicht in dieses Schema passen als ein Indiz für eine Spezifitätsänderung angesehen. In den folgenden graphischen Darstellungen sind die in Prozent angegebenen Intensitäten für die Bindung der Fab-Fragmente an die substituierten Peptide relativ zu den gemittelten Intensitäten für die Bindung an das Wildtyppeptid auf der jeweiligen Membran (100%) angegeben. In vergleichenden Analysen werden die Fab-Fragmente zum besseren Verständnis nach abnehmender Affinität zum Wildtyppeptid, bestimmt nach der ELISA- und SPR-Methode, von links nach rechts sortiert.

Tabelle 6.19. : Übersicht über die Substitutionsanalysen an den myc-Peptiden mit dem Fab von 9E10 bzw. der Rückmutanten. Die intensiven Bindungssignale an das Wildtyppeptid sind mit „+“, die schwachen mit „(+)“ und die nicht detektierbaren mit „-“ gekennzeichnet. Mit (1) gekennzeichnetes Fab wurde aus dem IgG durch partielle Proteolyse erhalten. Die Abkürzung n. g. steht für nicht gemessen.

 

Bindungssignal an Wildtyppeptid in den Substitutionsanalysen am:

Fab

8-mer
(412-419)

11-mer myc-tag

20-mer
(408-427)

18-mer
(410-427)

20-mer
(408(E409F)-427)

9E10(1)

+

+

+

+

+

9E10

+

+

+

n. g.

n. g.

9E10 HH31S

+

+




n. g.





n. g.





n. g.

9E10 GH52S

(+)

+

9E10 RH53G

-

+

9E10 HH58Y

+

+

9E10 SH100hY

-

+

9E10 FL30I

-

+

9E10 TL91S

-

+

LKeimbahn/H9E10

(+)

+

+

L9E10/HKeimbahn

-

+

+

LKeimbahn/HKeimbahn

-

-

(+)

+

+

Kontrolle des
Nachweisantikörpers

-

-

-

-

n. g.

Substitutionsanalysen am 20-mer c-myc(408-427)-Peptid (AEEQKLISEEDLLRKRREQL)

Mit den Substitutionsanalysen am 20-mer-Peptid wird die Spezifitätsänderung des vollständig Keimbahn-rückmutierten 9E10 und der 9E10-Fabs mit der einzelrückmutierten VL bzw. VH-Domäne an dem 20-mer Peptid c-myc(408-427) analysiert. Darüber hinaus wird das 9E10-Fab erstmals in seiner Bindungsspezifität zu diesem längeren Peptid beschrieben. Da die murinen Fab-Fragmente von einem anti-Maus-Antikörper-HRP detektiert wurden, war eine zusätzliche Kontrolle einer möglichen Bindung des Nachweisantikörpers an das myc-Peptid notwendig. Die Kontrolle zeigt eine polyspezifische Bindung des Detektionsantikörpers anti-Maus-Ig an einige Substituenten des myc-Peptides (Position 418: F, I, L, T, V und Y, Abb. 6.20.). Sie wurden aus der Auswertung ausgeschlossen.

↓79

Das 9E10-Fab zeigt auch im 20-mer eine sehr selektive Erkennung der Schlüsselpositionen LISE (Abb. 6.20.), wie bereits von Hilpert et al. (2001) für das 11-mer myc-tag- und 8-mer c-myc(412-419)-Peptid beschrieben (siehe auch Abb. 3.10). Ebenfalls sehr selektiv im c-myc(408-427)-Peptid wird der Rest LP419 erkannt. Basierend auf diesen Daten wurde die Schlüsselregion um die Position LP419 auf LISEXXL erweitert. Die aus der Verlängerung des N-Terminus stammenden zwei Aminosäuren (408-409) als auch die letzten vier Aminosäuren (424-427) aus der Verlängerung des C-Terminus werden vom 9E10-Fab nicht selektiv erkannt. Die Positionen Q411KLISEEDLLRKR423 im 20-mer Peptid können dagegen zum selektiv erkannten Bereich des 9E10 gezählt werden, da diese Region mit einer höheren Selektivität vom 9E10-Fab erkannt wird (Abb. 6.20.). Auch bei der Bindung der schwächer affinen Rückmutante LKeimbahn/H9E10 an das 20-mer Peptid wird es deutlicher, dass dieser Bereich mit einer höheren Selektivität erkannt wird. Die Bindung des 9E10-Fab an das 18-mer Peptid (Abb. 6.27.) zeigt ebenfalls die höhere Selektivität von 9E10 zu diesem Bereich. Die Längenanalysen am myc-Peptid im Kapitel 6.6.2.2. (Abb. 6.31.) belegen zudem, dass die Verlängerung des Peptides (EQKLISEEDL) um die C-terminalen Reste LRKR zu einem Affinitätsgewinn bei der Bindung an das 9E10-Fab führt. Dieses zeigt, dass das Epitop des 9E10 um die vier Aminosäuren LRKR am C-Terminus länger sein kann, als das in der Literatur beschriebene. Auch die nicht nachweisbare Bindung (ELISA- (Tabelle 6.10.), SPR- (Tabelle 6.18.) und Peptidspot-Analysen (Tabelle 6.19.)) der kompletten 9E10-Rückmutante an das 11-mer myc-tag-Peptid, das die in der Literatur beschriebene Epitopsequenz EQKLISEEDL beinhaltet, deutet auf ein längeres Epitop hin. Auffällig ist die Aminosäure P, die nur an den Termini (408-411 und 422-427) des 20-mer Peptides vom 9E10-Fab toleriert wird.

Abb. 6.20. : Substitutionsanalysen am c-myc(408-427)-Peptid mit 9E10-Fab sowie den Keimbahnrückmutanten LKeimbahn/H9E10 , L9E10/HKeimbahn, und LKeimbahn/HKeimbahn . Die Substitutionsmatrizes sind von links nach rechts nach den abnehmenden Affinitäten der Fabs zum Wildtyppeptid (bestimmt mit der ELISA-Methode) sortiert. Die Kontrolle erfolgte mit dem Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten). Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und die Pfeile deuten auf Änderungen in der Selektivität. Die rote Markierung zeigt den mit einer höheren Selektivität erkannten Bereich des 9E10-Fab-Fragmentes.

Zudem erkennt die Rückmutante LKeimbahn/HKeimbahn P in den 20-mer Peptiden ausschließlich an der N-terminalen Position 409. Allerdings ist die Bindung der kompletten 9E10-Rückmutante an das auf der Membran synthetisierte 20-mer Peptid auch sehr schwach.

Einfluss der rückmutierten VL-Domäne auf die Bindungsspezifität

Mit der komplett rückmutierten VL-Domäne im Fab LKeimbahn/H9E10 kommt es kaum zu Spezifitätsänderungen des Antikörpers zum 20-mer Peptid. Eine einzige Ausnahme betrifft eine Toleranz gegenüber S an der Schlüsselposition LP419. Dies deutet auf eine leicht abnehmende selektive Erkennung des Restes LP419. Die übrigen Schlüsselpositionen werden sehr selektiv von LKeimbahn/H9E10 erkannt.

Einfluss der rückmutierten VH-Domäne auf die Bindungsspezifität

↓80

Die komplette Rückmutation der VH-Domäne bewirkt ebenfalls nur schwache Änderungen in der selektiven Erkennung der Schlüsselpositionen LISEXXL im 20-mer Peptid. Die rückmutierte VH-Domäne im 9E10-Fab bewirkt jedoch eine schwache Bindung des Antikörpers an substituierte Peptide mit einem Q an der Schlüsselposition IP414. Der Rest QP414 wird von dieser Rückmutante nur in 20-mer Peptid und nicht im 11-mer myc-tag-Peptid (Abb. 6.22.) nachweislich toleriert. Peptide mit dem Substituenten A an der Schlüsselposition EP416 werden schwach gebunden. Stärkere Änderungen in der Spezifität des Fabs L9E10/HKeimbahn betreffen jedoch die Erkennung der Nicht-Schlüsselposition EP417. Am Rest 417 werden I, K und L stärker toleriert (Abb. 6.21.). Hier kommt es trotz abnehmender Gesamtaffinität von L9E10/HKeimbahn nicht zu einer scheinbar höheren selektiven Erkennung dieser Position EP417, wie es z. T. für LKeimbahn/H9E10 zu erkennen ist. Somit führen Rückmutationen in der VH-Domäne zu einer geringfügig abnehmenden Spezifität des Antikörpers zum 20-mer Peptid. Die Abb. 6.21. zeigt die stärkere Bindung von Fab L9E10/HKeimbahn an die gegen I, K und L substituierten Peptide an der Position 417 im Vergleich zu 9E10-Fab und LKeimbahn/H9E10-Fab.

Abb. 6.21. : Graphische Darstellung der abnehmenden selektiven Erkennung der Position EP417 bedingt durch Rückmutationen in dem Fab-Fragment L9E10/HKeimbahn (blau). Das 9E10-Fab (schwarz) und LKeimbahn/H9E10-Fab (rot) dienen dem Vergleich. Gezeigt wird die Bindung an ausgewählte an der Position 417 gegen I, K und L substituierte 20-mer c-myc(408-427)-Peptide in den Substitutionsanalysen. Die Bindung an das Wildtyppeptid in der selben Substitutionsreihe dient dem Vergleich.

Einfluss der 9E10-Keimbahngenrückmutante auf die Bindungsspezifität

Die Bindung der kompletten 9E10-Keimbahnrückmutante an das Wildtyppeptid in den Substitutionsanalysen ist sehr schwach. Mit dieser Analyse konnte dennoch gezeigt werden, das LKeimbahn/HKeimbahn mit derselektiven Erkennung der Schlüsselreste LISEXXL funktionell und ein potentieller Vorläufer des 9E10 ist. Die selektive Erkennung der Schlüsselreste, die in den Substitutionsanalysen am Peptid durch keine weiteren Reste bzw. nur durch physikochemisch ähnliche Reste austauschbar sind, ist ein typisches Merkmal des 9E10-Antikörpers. Das grundlegende Bindungsverhalten an das Antigen ist beim 9E10 und seinen hier gezeigten Keimbahnrückmutanten gleich. Auch die Fab-Rückmutanten LKeimbahn/H9E10 und L9E10/HKeimbahn erkennen die Schlüsselpositionen LISEXXL, bis auf wenige geringfügige Ausnahmen, sehr selektiv (Abb. 6.20.).

↓81

Im Vergleich zum 9E10-Fab unterscheiden sich die 9E10-Fabs mit den einzelrückmutierten V-Domänen L9E10/HKeimbahn und LKeimbahn/H9E10 in der Bindungsspezifität zum 20-mer Peptid nur an wenigen Stellen. Die Rückmutationen der einzelnen V-Domänen führen zu einer schwach abnehmenden Spezifität des Antikörpers. Rückmutationen in der VH-Domäne haben jedoch einen stärkeren Einfluss auf die Spezifität.

Substitutionsanalysen am 11-mer myc-tag- Peptid (EQKLISEEDLN)

Mit den Substitutionsanalysen am myc-tag-Peptid werden, bis auf LKeimbahn/HKeimbahn, alle in dieser Arbeit beschriebenen Rückmutanten – 9E10 FL30I, TL91S, HH31S, GH52S, RH53G, HH58Y, SH100hY, L9E10/HKeimbahn und LKeimbahn/H9E10 – in der Bindungsspezifität zu einem Peptid analysiert (Abb. 6.22.).

Abb.6.22. : Substitutionsanalysen am myc-tag-Peptid mit den Keimbahnrückmutanten 9E10 HH58Y, HH31S, GH52S, RH53G, SH100hY, FL30I, TL91S, L9E10/HKeimbahn, LKeimbahn/H9E10 und mit 9E10-Fab zum Vergleich. Die Substitutionsanalysen sind von links nach rechts nach den abnehmenden Affinitäten (bestimmt mit der SPR-Methode) der Fab-Fragmente zum Wildtyppeptid sortiert. Die Kontrolle erfolgte mit dem Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten). Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und die Pfeile deuten auf Änderungen in der Selektivität.

↓82

Hier war es gelungen feine Unterschiede in der Bindungsspezifität der 9E10-Rückmutanten zu erkennen. Aufgrund der Bindung des Nachweisantikörpers an Peptide mit Cystein als Substituenten werden diese in die Auswertung nicht miteinbezogen, obwohl in den Substitutionsanalysen am myc-tag-Peptid mit den Fab-Fragmenten auch den Cysteinresten eine funktionelle Bedeutung zukommt.

Einfluss der Rückmutationen in der VL-Domäne auf die Bindungsspezifität

Sowohl 9E10-Fab mit den Einzelrückmutationen FL30I und TL91S in der VL-Domäne als auch das 9E10-Fab mit der komplett rückmutierten VL-Domäne ergeben ein ähnliches Substitutionsmuster bei der Bindung an substituierte myc-tag-Peptide, das sich lediglich in den Intensitäten der Bindung zu einigen Peptidsubstituenten unterscheidet und mit der abnehmenden Gesamtaffinität der Fabs korreliert (Abb. 6.22.). Dies ist auf den bereits oben beschriebenen verminderten Sättigungseffekt zurückzuführen. Diese Rückmutationen haben keinen Einfluss auf die Bindungsspezifität.

Einfluss der Rückmutationen in der VH-Domäne auf die Bindungsspezifität

Das 9E10-Fab L9E10/HKeimbahn weist eine veränderte Selektivität zu der Peptidregion 417-419 bei der Bindung an das myc-tag-Peptid auf (Abb. 6.22.). Hier nehmen die Intensitäten der Bindung zu einigen Peptidsubstituenten nicht ab, wie mit abnehmender Affinität zum Wildtyppeptid zu erwarten wäre und bei den VL-Rückmutanten (FL30I, TL91S und LKeimbahn/H9E10) auch beobachtet wurde. Die Peptide mit den Substituenten D, G, L, M, S, T und V an der Position 417 werden von L9E10/HKeimbahn im Gegensatz zu LKeimbahn/H9E10 stärker gebunden (Abb. 6.23.A.). Zum Rest DP418 im myc-tag-Peptid weist das Fab L9E10/HKeimbahn im Vergleich zu LKeimbahn/H9E10 ebenfalls eine veränderte Selektivität auf. Insbesondere myc-tag-Peptide mit den Resten H, K, L und N an der Position 418werden von L9E10/HKeimbahn intensiver gebunden (Abb. 6.23.C.).

↓83

In der Erkennung der Schlüsselposition LP419 unterscheiden sich beide V-Domänen darin, dass ein Peptid mit H an dieser Position von L9E10/HKeimbahn im Gegensatz zu LKeimbahn/H9E10 gebunden wird. Es zeigt sich, dass die Änderungen in der selektiven Erkennung der Position EP417 im myc-tag-Peptid von der Einzelrückmutation RH53G bewirkt werden. Die Einzelrückmutation RH53G im 9E10-Fab bewirkt eine zunehmende Affinität zu Peptiden mit den Austauschen L, M, S, T und V an der Position 417 (Abb. 6.23.B.).

Die Abbildung 6.23.B. zeigt die scheinbar zunehmende Selektivität der VL-Rückmutanten LKeimbahn/H9E10 und 9E10 TL91S in der Erkennung der Position EP417, die mit der abnehmenden Gesamtaffinität dieserRückmutanten korreliert. Die Rückmutante 9E10 TL91S wurde hier zum Vergleich herangezogen, da sie eine höhere Gesamtaffinität zum 11-mer Peptid aufweist als 9E10 RH53G. Die VH-Rückmutanten L9E10/HKeimbahn und 9E10 RH53G zeigen hingegen eine abnehmende Selektivität in der Erkennung der Position EP417 im myc-tag-Peptid.

Abb. 6.23. : Graphische Darstellung der abnehmenden selektiven Erkennung des myc-tag-Peptidrestes EP417 bedingt durch Rückmutationen in den Fabs L9E10/HKeimbahn und 9E10 RH53G (A. und B.) und des Restes DP418 bedingt durch Rückmutationen in dem Fab L9E10/HKeimbahn (C.). (A., C.) Gezeigt werden die Intensitäten der Bindung des 9E10 (schwarz) und LKeimbahn/H9E10 (rot) im Vergleich zu L9E10/HKeimbahn (blau) an ausgewählte an der Position 417 (A.) und 418 (C.) substituierte Peptide in den Substitutionsanalysen. In (B.) wird die Bindung der Einzelrückmutante 9E10 RH53G (rot) an die an der Position 417 substituierten Peptide mit der der Fabs 9E10, 9E10 TL91S (grau), LKeimbahn/H9E10 (gestrichelt) und L9E10/HKeimbahn (weiß) verglichen. Die Bindung an das Wildtyppeptid in der selben Substitutionsreihe dient dem Vergleich.

↓84

Die Rückmutanten 9E10 GH52S und SH100hY weisen ein zu den Rückmutanten der VL-Domäne ähnliches Substitutionsmuster auf. Diese Rückmutanten haben keinen Einfluss auf die Bindungsspezifität. Auch die Einzelrückmutation HH58Y führt zu keiner nachweisbaren Spezifitätsänderung des 9E10-Fab unter den hier gewählten Bedingungen. Für die Rückmutante 9E10 HH31S konnte zum 11-mer Peptid ebenfalls keine signifikante Spezifitätsänderung beobachtet werden.

Rückmutationen in der VH-Domäne verursachen hier eine deutlich abnehmende Spezifität des Antikörpers zum myc-tag-Peptid. Mit der geringfügigen Ausnahme der Schlüsselposition LP419 werden die Schlüsselpositionen LISEXXL von allen Rückmutanten sehr selektiv erkannt. Zu Änderungen in der Selektivität kommt es bei der Erkennung der peripheren Reste, insbesondere der Reste EP417 und DP418. Verantwortliche für die Selektivitätsabnahme zu der Position EP417 im myc-tag-Peptid ist die Rückmutation des im direkten Kontakt zum Peptid stehenden 9E10-Restes RH53, derzu G mutiert wurde.

Substitutionsanalysen am 8-mer c-myc(412-419)-Peptid (KLISEEDL)

Mit diesem Experiment sollen noch feinere Bindungsunterschiede der Rückmutanten an das Antigen, als es mit der Bindung an das myc-tag-Peptid möglich war, beschrieben werden.

↓85

Soweit es die Ausbeute an funktionellem Fab aus der rekombinanten Expression in E. coli und die Affinität der rückmutierten Fabs an das verkürzte und schwächer affine c-myc(412-419)-Peptid (KD = 26 µM für 9E10-IgG, ELISA, Hilpert et al., 2001) erlaubten, konnten für einige 9E10-Rückmutanten Substitutionsanalysen an diesem Peptid durchgeführt werden (Abb. 6.24.).

In den Substitutionsanalysen am verkürzten Peptid wurde das Bindungsverhalten der 9E10-Rückmutanten HH31S, HH58Y, GH52S und LKeimbahn/H9E10 analysiert (Abb. 6.24.), wobei die Substitutionsanalyse mit dem gereiften 9E10-Fab einem Vergleich diente. Betrachtet werden nun vor allem Änderungen in der Bindungsspezifität zu diesem Peptid, die spezifisch für eine der getesteten Rückmutationen sind. Das Fab 9E10-HH58Y bindet das Peptid KLISEEDL mit der gleichen Spezifität wie das 9E10-Fab. In den Substitutionsanalysen am c-myc(412-419)-Peptid wird jedoch eine verminderte Selektivität des Fab zum Rest EP417 beobachtet, deren Ursache die Rückmutation HH31S ist (Abb. 6.24.).

Abb. 6.24: Substitutionsanalysen am c-myc(412-419)-Peptid mit den Fab-Keimbahnrückmutanten HH58Y, HH31S, GH52S, LKeimbahn/H9E10 und 9E10. Die Substitutionsanalysen sind von links nach rechts nach den abnehmenden Affinitäten der Fab-Fragmente zum Wildtypen des 11-mer myc-tag-Peptides (bestimmt mit der ELISA-Methode) sortiert. Die Kontrolle erfolgte mit dem Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten). Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und der Pfeil deuten auf Änderungen in der Selektivität.

↓86

Abb. 6.25. : Graphische Darstellung der abnehmenden selektiven Erkennung der Position EP417 im 8-mer c-myc(412-419)-Peptid bedingt durch die Fab-Einzelrückmutation HH31S im 9E10 (rot). Gezeigt wird die Bindung an ausgewählte an der Position 417 gegen G, L, M und Y substituierte 8-mer Peptide in den Substitutionsanalysen. Zum Vergleich ist die Intensität der Bindung an die jeweiligen Peptide der Fabs 9E10 (schwarz), HH58Y (grau), GH52S (gestrichelt) und LKeimbahn/H9E10 (weiß) gezeigt. Die Bindung an das Wildtyppeptid in der selben Substitutionsreihe dient dem Vergleich.

Die Rückmutation des im direkten Kontakt zum Peptid stehenden Restes HH31 zuS bewirkt eine stärkere Bindung des Antikörpers an Peptide mit den Austauschen G, L und M an der Position 417 im Vergleich zu der der Fabs 9E10, 9E10 HH58Y, 9E10 GH52S und LKeimbahn/H9E10 (Abb. 6.25.). Die Affinität zu Peptiden mit Y an der Position 417 nimmt dagegen ab (Abb. 6.25.).

Aufgrund der sehr schwachen Gesamtaffinität von Fab 9E10 GH52S zum 8-mer Peptid kann keine Aussage über weitere feinere Unterschiede im Vergleich zum gereiften 9E10 in der Bindungsspezifität dieser Rückmutante gemacht werden. Das gleiche trifft für das Fab LKei m bahn/H9E10 zu, aber auch für die übrigen schwachaffinen 9E10-Rückmutanten, die aus den genannten Gründen in ihrer Bindungsspezifität zum verkürzten Peptid schwer zu charakterisieren wären. Die Schlüsselpositionen LISEXXL werden von den hier untersuchten Rückmutanten mit einer hohen Selektivität erkannt. Eine geringfügige Ausnahme zeigt das Fab 9E10 GH52S, das ein F an der Schlüsselposition EP416 im myc-tag-Peptid stärker toleriert als das 9E10-Fab.

Substitutionsanalysen am 20-mer c-myc(408(E409F)-427)-Peptid (AFEQKLISEEDLLRKRREQL)

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Diese Analyse dient dazu, die Gesamtaffinität der kompletten 9E10-Rückmutante zum Peptid durch Aminosäureaustausche außerhalb des Epitopbereiches zu erhöhen, um höhere Bindungssignale in den Substitutionsanalysen zu erreichen. Zur Auswahl der Positionen, die für einen Austausch geeignet sind, wurden die Daten aus der Substitutionsanalyse am 20-mer Peptid herangezogen (Abb. 6.20.). Als geeignet schien der Austausch von EP409 zu F am N-Terminus des 20-mer Peptides

Die Substitutionsanalyse an diesem modifizierten 20-mer(E409F)-Peptid belegt, dass das in den Substitutionsanalysen am 20-mer Peptid mit einer signifikant höheren Affinität gebundene gegen F substituierte Peptid (Abb. 6.20.) keine unspezifische Wechselwirkung der kompletten 9E10-Keimbahngenrückmutante mit dieser Peptidvariante darstellt. An diesem Beispiel konnte gezeigt werden, dass auch hier die Schlüsselpositionen LISEXXL von der kompletten Keimbahngenrückmutante sehr selektiv erkannt werden. Hiermit konnte die Funktionalität und die Zugehörigkeit der gewählten Keimbahngensegmente zum 9E10-Antikörper eindeutig bestätigt werden.

Auch das gereifte 9E10-Fab bindet das substituierte 20-mer-Pepid mit einer höheren Affinität, jedoch nur geringfügig (Abb. 6.26.). Trotz der hohen Signalsättigung, die auf eine hohe Gesamtaffinität des gereiften 9E10-Fab zu diesem Peptid zurückzuführen ist, werden die Schlüsselpositionen LISEXXL selektiv erkannt, wobei hier eine Hierarchie in der Selektivität zu den Schlüsselpositionen zu erkennen ist. Der Rest LP413 wird mit der höchsten Selektivität und der Rest LP419 mit der niedrigsten Selektivität unter den Schlüsselpositionen erkannt.

↓88

Die Substitutionsanalyse am modifizierten 20-mer c-myc(408(E409F)-427)-Peptid zeigt jedoch ein vom Originalpeptid abweichendes Substitutionsmuster. Der N-Terminus (409-411) des veränderten 20-mer myc-Peptides wird mit einer veränderten Selektivität erkannt (Abb. 6.26., siehe auch Abb. 6.27. und 6.20.). So werden an der Position QP411 kaum Aromaten und aliphatische Reste wie I, L und V, stattdessen aber das polare N, im Peptid toleriert. Bei der Bindung der kompletten 9E10-Rückmutante an das c-myc(408-427)-Peptid ist es genau umgekehrt. Zudem wird die Position EP417 viel selektiver erkannt, vor allem werden an dieser Position nur noch A, G und Q toleriert. Hier konnte gezeigt werden, dass ein modifizierter N-Terminus im Peptid nicht nur die Affinität zur 9E10-Keimbahngenrückmutante erhöht, sondern auch die Erkennung einiger Positionen im Peptid durch die Rückmutante verändert.

Abb. 6.26. : Substitutionsanalysen am c-myc(408(E409F)-427)-Peptid mit 9E10-Fab sowie der Fab-Keimbahnrückmutante LKeimbahn/HKeimbahn. Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und die Pfeile deuten auf Änderungen in der Selektivität.

Substitutionsanalysen am 18-mer c-myc(410-427)-Peptid (EQKLISEEDLLRKRREQL)

Die Kürzung des 20-mer Peptides um die zwei N-terminalen Aminosäuren AP408 und EP409 auf ein 18-mer Peptid (410-427) ermöglichte nun die genaue Charakterisierung der Erkennung der Schlüsselpositionen LISEXXL durch die 9E10-Keimbahngenrückmutante an einem Peptid mit einer unveränderten Sequenz.

↓89

In der Substitutionsanalyse am 18-mer Peptid waren aufgrund einer höheren Gesamtaffinität der 9E10-Keimbahngenrückmutante zum Peptid (Abb. 6.27.) mehr Bindungssignale an die substituierten Peptide nachweisbar als in den Analysen am N-terminal längeren 20-mer c-myc(408-427)-Peptid.

Abb.6.27.: Substitutionsanalysen am c-myc(410-427)-Peptid mit 9E10-Fab sowie mit der Fab-Keimbahnrückmutante LKeimbahn/HKeimbahn. Die Kontrolle erfolgte mit dem Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutante). Die Schlüsselpositionen sind eingerahmt und die Pfeile deuten auf Änderungen in der Selektivität.

Hier ist deutlich zu erkennen, dass die Schlüsselpositionen LISXXXL im Peptid von LKeimbahn/HKeimbahn mit hoher Selektivitäterkannt werden. Die selektive Erkennung der Schlüsselposition EP416 geht jedoch teilweise verloren. Neben dem Originalpeptid werden auch Peptide mit den Austauschen R, F, W, Y sowie den aliphatischen Resten I und L gebunden. Es sollte aber nicht unerwähnt bleiben, dass auch der Nachweisantikörper an ein Peptid mit einem R an der Position 416 bindet, wenn auch weitaus schwächer. Mit Reifung des Antikörpers werden an dieser Position dagegen nur Q, A, N oder M toleriert (Abb. 6.28.). Es konnten somit Selektivitätsänderungen zu der Schlüsselposition EP416 während der Reifung des Antikörpers deutlicher nachgewiesen werden.

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In der Kontrolle bindet der Nachweisantikörper myc-Peptide mit Austauschen an den Positionen 410 (Y), 416 (R) und 418 (F, I, L, T, V, W und Y), daher wurden diese aus der Auswertung ausgeschlossen.

Abb. 6.28. : Graphische Darstellung der Unterschiede in der selektiven Erkennung der Schlüsselposition EP416 im 18-mer c-myc(410-427)-Peptid zwischen dem 9E10-Fab (schwarz) und der Rückmutante LKeimbahn/HKeimbahn (rot). Gezeigt wird die Bindung an ausgewählte an der Position 417 gegen A, F, I, L, M, N, Q, W und Y substituierte Peptide. Die Bindung an das Wildtyppeptid in der selben Substitutionsreihe dient dem Vergleich.

Trotz der schwächeren Wechselwirkungen zwischen der 9E10-Keimbahngenrückmutante und dem 18-mer Peptid im Vergleich zum 9E10 werden die Reste G, I, L, S und V an der Position EP417 im Peptid stärker toleriert. Die erhöhte Toleranz zu diesen Resten ist auf die rückmutierte VH-Domäne zurückzuführen und wurde in den Substitutionsanalysen am 8-mer, 11-mer myc-tag- und dem 20-mer Peptid gezeigt.

Reproduzierbarkeit der Signale in den Substitutionsanalysen

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Die Reproduzierbarkeit der Signale in den Substitutionsanalysen wurde am Beispiel des Fab LKeimbahn/H9E10 untersucht, wozu das periplasmatisch lösliche und das in vitro gefaltete Fab in der Bindung an das myc-tag-Peptid in den Substitutionsanalysen unter Einbezug unterschiedlicher Detektionszeiten der Bindungssignale verglichen wurde. Der Vergleich der Bindungsspezifität zwischen dem in vivo und in vitro gefalteten Fab sollte Auskunft über den Einfluss der Rückfaltung geben. Diese Charakterisierung wurde vorgenommen, da die analysierten Fab-Fragmente der Konstrukte HKeimbahn/L9E10 und HKeimbahn/LKeimbahn ausschließlich aus in vitro Faltungsexperimenten gewonnen wurden. Zur Einschätzung der Qualität der Peptidspotsynthese wurden Membranen aus zwei verschiedenen Synthesen verglichen. Von den in vitro gefalteten Konstrukten wurden jeweils 130 µg Protein in den Substitutionsanalysen eingesetzt. Die getestete Proteinmenge an periplasmatisch löslichen LKeimbahn/H9E10 betrug 20 µg. Die Detektionszeiten für das Bindungssignal variierten von 5 sec über 2 min bis zu 10 min (Abb. 6.29.).

Abb. 6.29.: Reproduzierbarkeit der Bindung von LKeimbahn/H9E10 an das myc-tag-Peptid in den Substitutionsanalysen. (1) Membran aus einer myc-Peptidspotsynthese getestet mit dem (a.) in vitro rückgefalteten Fab (130 µg) und dem (b.) periplasmatisch löslichen Fab (20 µg). Das Bindungssignal wurde 2 min (a.) und 5 sec (b.) lang detektiert. (2.) Bindung des in vitro rückgefalteten Fab (130 µg) an eine Membran aus einer anderen myc-Peptidspotsynthesecharge. Das Bindungssignal wurde 10 min lang detektiert.

Die Ergebnisse an diesem Beispiel zeigen, dass weder die Rückfaltung der Fab-Fragmente noch die Charge, aus der die synthetisierten Peptidspots auf der Membran stammen, einen Einfluss auf die Bindungssignale in den Substitutionsanalysen nehmen. Es zeigt sich lediglich, dass das rückgefaltete Fab unspezifisch an Peptide mit Cysteinsubstituenten bindet (Abb. 6.29.). Auch die Analysen zu unterschiedlichen Signaldetektionszeiten und Proteinmengen verdeutlichen, dass jene keinen signifikanten Einfluss auf das Substitutionsmuster haben. Die Intensität der einzelnen Bindungssignale in den Substitutionsanalysen konnte mit dem Programm ImageJ ermittelt werden und verdeutlicht in einer graphischen Darstellung die gute Reproduzierbarkeit der gemessenen Signale (Abb. 6.30). Hieraus lies sich für die dreifache Bestimmung der Signalintensität an jedem Peptidspot eine mittlere Standardabweichung von 15 % errechnen. Die folgende Abbildung 6.30. zeigt die in Prozent ausgedrückten Bindungssignale der Fabs an die substituierten Peptide in Relation zum gemittelten Bindungssignal an das Wildtyppeptid (100%) auf der jeweiligen Membran.

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Abb. 6.30. : Graphische Darstellung der Reproduzierbarkeit der Intensitäten der Bindung von periplasmatisch löslichen und in vitro rückgefalteten Fab LKeimbahn/H9E10 an das myc-tag-Peptid in den Substitutionsanalysen. Gezeigt wird die Bindung vom in vitro rückgefalteten Fab (grau) und periplasmatisch löslichen Fab (weiß) an myc-tag-Peptide auf einer Membran aus der selben Synthese und vom in vitro rückgefalteten Fab (schwarz ) an myc-tag-Peptide aus einer unabhängigen Synthese.

Die Schwankungen in den Intensitäten der Bindung in diesen drei Vergleichsexperimenten mit dem Fab LKeimbahn/H9E10 sind geringfügig und in der Gesamtheit zeigt sich das selbe Substitutionsmuster. Die Bindung an das Peptid mit dem Austausch W an der Position 412 ist im Gegensatz zu den beiden übrigen Membranen (1a. und 1b. Abb. 6.29. ) auf der Membran 2. (Abb. 6.29.) nicht nachzuweisen und ist einzige deutliche Unterschied.

6.6.2.2 Längenanalysen am c-myc-Peptid

Mit Hilfe von Peptidspotmembranen wurde der Einfluss der Peptidlänge auf die Affinität des Antikörpers untersucht. Hierfür wurde das myc-Peptid schrittweise am C- und N-Terminus, ausgehend von dem 11-mer E410QKLISEEDLL420, um eine Aminosäure auf das 20-mer A408EEQKLISEEDLLRKRREQL427 verlängert.

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Die Verlängerung des 11-mer Peptides um sieben Aminosäuren am C-Terminus erhöht die Affinität zum 9E10-Fab und zu den Fab-Keimbahnrückmutanten LKeimbahn/H9E10, L9E10/HKeimbahn und LKeimbahn/HKeimbahn (Abb. 6.31.). Die Affinität der Fabs 9E10, LKeimbahn/H9E10 und L9E10/HKeimbahn zum Peptid nimmt mit einer Verlängerung des Peptides um die vier Aminosäuren LRKR zu. Längere Peptide werden dagegen nicht mehr mit einer signifikant höheren Affinität gebunden. Bei der Bindung von LKeimbahn/HKeimbahn an das substituierte Peptid (EP409F) wird dagegen erst nach einer Verlängerung um die fünf Aminosäuren LRKRR kein deutlicher Affinitätsgewinn mehr verzeichnet. Die N-terminale Verlängerung um zwei Aminosäuren bringt dagegen keine Affinitätserhöhung. Im Falle der Bindung von LKeimbahn/HKeimbahn an dasPeptid konnte sogar ein starker Verlust der Affinität nachgewiesen werden. Hier war auch ein längerer C-Terminus vom Vorteil für die Affinität der Bindung. Bei der Verlängerung des C-Terminus um die Aminosäuren LRKRREQ konnte noch eine Affinitätszunahme beobachtet werden. Wird am N-Terminus des Peptides ein E gegen F an der Position 409 ausgetauscht (siehe auch Abb. 6.20.) erhöht sich die Affinität des Antikörpers zum Peptid. Insbesondere bei der Bindung an das LKeimbahn/HKeimbahn-Fab wird der durch diesen Austausch bedingte Affinitätsgewinn deutlich. Wahrscheinlich ist mit dem Austausch EP409F im Peptid ein zusätzlicher Kontakt des Peptides zum Antikörper generiert worden. Diese Daten zeigen, dass nur eine C-terminale Verlängerung des Peptids die Affinität zum Antikörper erhöht und essentiell für die detektierbare Bindung des 9E10-Keimbahnvorläufers an das myc-Peptid ist.

Abb. 6.31.: Längenanalysen am c-myc-Peptid. Gezeigt wird auf den Peptidspotmembranen der Einfluss der Peptidlänge auf die Affinität des 9E10-Fab und der Fab-Keimbahnrückmutanten LKeimbahn/H9E10, L9E10/HKeimbahn und LKeimbahn/HKeimbahn. Die Spots zeigen Peptide, die jeweils um eine Aminosäure, ausgehend von der Sequenz EQKLISEEDLL, auf AE(F409)EQKLISEEDLLRKRREQL und EQKLISEEDLLRKRREQL verlängert wurden. Die relativen Intensitäten der Bindung der Peptide sind im prozentualen Verhältnis zum 18-mer Peptid (=100%) dargestellt. Das Kontrollexperiment zeigt den Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten). Detektiert wurde bis zur Sättigung des intensivsten Signals.

6.6.2.3 Kreuzreaktivitätsanalysen mit homologen myc-Peptiden

In der Literatur wird von der Kreuzreaktivität des 9E10 zum murinen c-Myc-Protein berichtet (Siegel et al., 1998). Mit Hilfe der Peptidspotmembranen soll hier die Änderungen in der Spezifität des 9E10-Antikörpers während des Reifungsprozesses an drei synthetischen Peptiden, die eine sequenzielle Homologie (Tabelle 6.32.) zum humanen c-myc-Peptid aufweisen, gezeigt werden. Die Peptide wurden in Anlehnung an die Sequenz der Region 408-427 der c-Myc-Proteine aus der Maus und dem Huhn sowie des viralen v-Myc-Proteins, das im proviralen Genom des Vogelviruses MC29 kodiert wird, ausgewählt (Evan et al. 1985). Die Bindung des 9E10-IgG an diese Myc-Proteine wurde bereits von Evan et al. beschrieben, wobei keine Bindung des 9E10 an diese Proteine nachgewiesen werden konnte. Die Sequenz des murinen c-myc(K417E)-Peptides entstammte, bis auf den Rest 417 der Sequenz des c-Myc-Proteins, aus der Maus. Dieses Peptid weist eine hohe verwandtschaftliche Beziehung zum humanen c-myc-Peptid auf und unterscheidet sich von jenem nur am N-Terminus.

↓94

Tabelle 6.32.: Sequenzen der untersuchten myc-Peptide. Die Schlüsselpositionen im humanen c-myc-Peptid sind unterstrichen.

c-myc-Peptid (408-427), Mensch

AEEQKLISEEDLLRKRREQL

c-myc-Peptid (K417E), Maus
(c-myc-Peptid, Maus)

ADEHKLTSEEDLLRKRREQL
(ADEHKLTSEKDLLRKRREQL)

v-myc-Peptid

SDEHKLIAEKEQLRRRREQL

c-myc-Peptid, Huhn

SDEHRLIAEKEQLRRRREQL

Das 9E10-Fab und seine V-Domänen-Keimbahnrückmutanten zeigen unterschiedliche Kreuzreaktivitäten zu den hier getesteten myc-Peptiden (Abb. 6.33.). Das gereifte 9E10-Fab kreuzreagiert mit einer schwachen Affinität mit dem murinen 20-mer c-myc(K417E)-Peptid. Die Kreuzreaktivität bleibt auch bestehen, wenn die Gesamtaffinität zum Peptid durch die N-terminale Substitution EP409F im murinen c-myc(K417E)-Peptid erhöht wird. Es konnte keine Bindung des 9E10-Fab an die avianen und viralen 20-mer sowie 20-mer(E409F) c- bzw. v-myc-Peptide detektiert werden. Eine Bindung des Keimbahn-kodierten 9E10-Vorläufers an das murine 20-mer c-myc(K417E)-Peptid ist nicht detektierbar (Abb. 6.33.).

Abb. 6.33.: Bindung von 9E10-Fab und seiner Rückmutanten LKeimbahn/H9E10 (LKB/H9E10), L9E10/HKeimbahn (L9E10/HKB) sowie LKeimbahn/HKeimbahn (LKB/HKB) an homologe 20-mer myc-Peptide mit sequentiellen Ursprung in den murinen, avianen und viralen Myc-Proteinen. In der Bindungsanalyse mit dem substituierten 20-mer(E409F) Peptid haben alle Peptide den zusätzlichen N-terminalen Austausch EP409F. Die Kontrollexperimente zeigen den Detektionsantikörper ohne 9E10-Fab (bzw. Rückmutanten).

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Selbst zu dem höher affinen EP409F substituierten murinen 20-mer Peptid ist keine Bindung detektierbar. Die Intensitäten der Bindung des 9E10-Vorläufers an das humane 20-mer c-myc-Peptid und aviane c-myc-Peptid gleicher Länge unterscheiden sich dagegen nur geringfügig (Abb. 6.33.). Die Bindung an das jeweilige v-myc-Peptid ist nicht detektierbar. Erhöht man hingegen die Affinität der Peptide zum 9E10-Keimbahnvorläufer durch den Austausch EP409F in den Peptiden, ändert sich die Kreuzreaktivität. Mit dem Austausch E409F im Peptid wird die Kreuzreaktivität mit dem avianen c-myc(E409F)-Peptid kaum nachweisbar, was auf den veränderten Bindungsmodus des modifizierten 20-mer Peptides zurückzuführen wäre. Die gemischten Keimbahnrückmutanten H9E10/LKeimbahn und HKeimbahn/L9E10 zeigen mit dieser Methode nur eine sehr schwache Kreuzreaktion mit den getesteten Peptiden, wobei eine sehr schwache Bindung von H9E10/LKeimbahn zum murinen c-myc(K417E)-Peptid besteht. Dieses Fab bindet nicht an das aviane c-myc- und virale v-myc-Peptid. HKeimbahn/L9E10-Fab erkennt hingegen das murine c-myc(K417E)-Peptid und das virale v-myc-Peptid nicht. Eine Bindung an das aviane c-myc-Peptid ist schwach nachweisbar (Bild 6.33.)

Mit der Reifung des 9E10-Antikörpers in der Maus geht die Bindung an das aviane c-myc-Peptid verloren. Die hohe Gesamtaffinität des gereiften 9E10-Antikörpers führt dagegen zu einer nachweisbaren Bindung mit dem hochhomologen murinen c-myc(K417E)-Peptid.


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30.03.2007