Diskussion

↓95

7.1  Identifizierung der Keimbahngene zu 9E10

Schiweck et al. (1997) haben die Keimbahngensegmente zur 9E10 VH-Region als DFL16.1 für das D-Gensegment und JH4 für das J-Gensegment identifiziert. Das V-Gensegment der schweren Kette ordneten sie der VH 7183-Genfamilie zu. In der vorliegenden Arbeit wird das V-Gensegment in der VH-Region zu VH 3:3.39 als Bestandteil der Genfamilie VH 7183 zugeordnet, das D- und J-Gensegment – zu DFL16.1 und JH4. Für die VL-Region werden die Keimbahngensegmente VL21.2* und J1 identifiziert. Die Nukleotidsequenz an der V-D-Verknüpfungsstelle in der VH-Region im nicht mutierten Antikörper konnte aufgrund von zufälligen Nukleotiddeletionen und -austauschen während des Rekombinationsvorgangs nicht bestimmt werden. Dies betrifft 7 Nukleotidpaare in der CDR-H3. Somatische Mutationen in dieser kurzen Sequenz können nicht ausgeschlossen werden. Das hier beschriebene LKeimbahn/HKeimbahn-Fab kann trotzdem mit hoher Wahrscheinlichkeit den kompletten 9E10-Keimbahnvorläufer repräsentieren. Die 9E10-Keimbahnrückmutanten erwiesen sich alle als funktionelle myc-Peptidbinder in den ELISA-, SPR- und Peptidspotanalysen. Die für 9E10 typische Erkennung der Peptidschlüsselreste LISE, die bereits von Hilpert et al. (2001) für 9E10 beschrieben worden ist, konnte auch für die Keimbahnrückmutanten des Antikörpers bestätigt werden. Damit konnte belegt werden, dass 9E10 aus den hier ermittelten Keimbahnensegmenten hervorgegangen ist.

↓96

Der affinitätsgereifte 9E10-Antikörper zeigt mit 20 somatischen Mutationen eine relative hohe Anzahl von Austauschen. Dieses ist jedoch für gereifte hochaffine Antikörper nicht ungewöhnlich, so z. B. reichern sich im hochaffinen anti-Lysozym-Antikörper H8 (KD = 200 pM) insgesamt 24 somatische Mutationen an (Yili et al., 2003).

7.2 Bakterielle Expression von 9E10-Fab und Rückmutanten

Die erfolgreiche, wenn auch nur mit geringen Ausbeuten, periplasmatische Expression des 9E10-Fab und seiner Keimbahnrückmutante erfolgte aus dem mit einem tet-Promoter-Operator regulierten pASK85-Expressiosvektor in dem E. coli-XL-1-Zellstamm. Für das lösliche E. coli-Periplasma sind in einer nicht reduzierenden SDS-PAGE in der Doppelbande bei 46 kD die murine κ-Immunglobulindomäne und der His-tag nachweisbar, wobei allerdings nur die obere Bande als Fab (ca. 50 kD) identifiziert werden konnte. Dieses Expressionsmuster des 9E10-Fab ist mit dem der Rückmutanten, mit Ausnahme der Rückmutante HH31S, identisch. Warum die Einzelrückmutation HH31S im 9E10-Fab zu einem anderen Expressionsmuster führt, wurde nicht untersucht. Hier soll nur angedeutet werden, dass die von U. Griebel (2005) konstruierte 9E10-Variante im pASK85 (Klon 4) ebenfalls ein anderes Expressionsmuster zu dem 9E10-Fab in E. coli aufweist. Der 9E10-Klon 4 zeigt sechs Primer bedingte Substitutionen an den Termini der variablen Regionen: HH3K, VH5Q, AH107T, SH108T, VL3E und IL106L. Im Falle von 9E10-Fab Klon 4 und von 9E10-Fab mit der Rückmutation HH31S dominiert die obere Bande (Fab) der Doppelbande bei 46 kD in der nicht reduzierenden SDS-PAGE, was ebenfalls ein Hinweis auf eine bessere Fab-Produktion in E. coli ist. Ob die Einzelmutation HH31S und die Substitutionen im 9E10-Klon 4 einen Einfluss auf den kotranslationalen Transport der Ketten über den Sec-Weg durch die innere Membran der Zelle haben oder ob sie die Löslichkeit der schweren Kette beeinflussen, bleibt vorerst ungeklärt. Zum Beispiel konnten Demarest et al. (2006) durch Austausche in der Aminosäuresequenz (primär im Fv) eines anti-Tetanus-Fab-Fragmentes die Expressionsausbeute des Fabs in E. coli steigern. Den Autoren zufolge können bestimmte Austausche in der Aminosäuresequenz die intrinsische Stabilität der Fab-Fragmente erhöhen, die wiederum eine korrekte Faltung des Proteins begünstigt. Auch Tuckey und Noren (2002) haben mit Einzelaminosäureaustauschen in der VL-Domäne im Fab die Expression von Fab steigern können.

Neben der Aminosäuresequenz hat auch die Temperatur einen Einfluss auf die lösliche periplasmatische Expression der 9E10-Fab-Fragmente in E. coli. Die Assemblierung der leichten und schweren Kette ist von der Inkubationstemperatur der Zellen während der Kultivierung vor der Induktion der Expression des Fab abhängig. So erhöht die Kultivierung der Zellen bei einer geringen Temperatur (22°C) die Ausbeute an funktionellem Fab, während sie bei 37°C abnimmt. Eine Erklärung hierfür könnten die Experimente von Vanhofe et al. liefern. In Säugerzellen assoziieren neu synthetisierte schwere und leichte Ketten sofort mit dem BIP-Chaperon (BIP = binding protein) (Knittler und Haas, 1992; Vanhove et al., 2001). Bei der schweren Kette bindet BIP an hydrophobe Bereiche der CH1-Domäne, verhindert somit die Aggregation und unterstützt die Assemblierung mit der leichten Kette. In Abwesenheit der leichten Ketten bleiben die schweren Ketten mit den BIPs assoziiert. Diese Bindung an BIP ist wichtig, sie stellt sicher, dass die schweren Ketten die Zelle nicht ohne die leichte Kette verlassen oder aggregieren können. Die Autoren haben gezeigt, dass bei einer Freisetzung der schweren Kette aus dem Komplex mit BIP bei 22°C der größte Teil faltet, während bei 37°C der größte Teil aggregiert. BIP konnte außerdem in Hefen und Pflanzen gefunden werden, jedoch nicht in Bakterien, was auch erklären könnte, weshalb in E. coli bei 37°C kaum 9E10-Fabs entstehen und der größte Teil der schweren Kette als inclusion bodies vorliegt. Die Temperatur des Mediums im Schüttelkolben der zuvor bei 37°C kultivierten Zellen war zu Anfang der Expression wahrscheinlich höher als die Temperatur von 22°C im Inkubatorschrank während der Expression.

↓97

Schiweck et al. (1999) beschreiben in ihrer Arbeit die löslich exprimierte individuelle 9E10 VH-Domäne in E.coli. Dies ist ungewöhnlich, denn normalerweise lassen sich einzelne Antikörper VH-Domänen aufgrund ihrer geringen Löslichkeit nur schwer produzieren. Die Autoren erklären die Löslichkeit der 9E10-VH-Domäne mit einem Vergleich mit VHH-Domänen der Schwereketten-Antikörper. Eine hydrophobe Oberflächenregion der VH-Domäne, nämlich die, die die Interaktionsfläche mit der VL-Domäne darstellt, führt normalerweise zu Aggregation, wenn die VL-Domäne fehlt. In den VHH-Domänen der Schweren-Ketten-Antikörper sind einige hydrophobe Resten dieser Region durch hydrophile ersetzt worden. Zudem können sehr lange CDR-H3 restliche hydrophobe Bereiche dieser Interaktionsfläche durch Bindung vom Wasser abschirmen und somit die Löslichkeit der VHH-Domäne erhöhen. Schiweck et al. vermuten, dass die gute Löslichkeit der 9E10-VH-Domäne durch Bindung der sehr langen und hydrophoben CDR-H3 an die hydrophobe Interaktionsfläche der 9E10-VH-Domäne zustande kommt. In der hier vorgestellten Arbeit wird gezeigt, dass die in E. coli periplasmatisch produzierte schwere Kette VH-CH1 (inklusive His-Tag) als lösliche monomere Kette, assoziiert mit der leichten Kette (Fab) und in unlöslicher Form als inclusion bodies (Einschlusskörper) vorliegt, wobei die Aggregation zu inclusion bodies dominiert. Es kommt also auch zur Synthese löslicher monomerer schwerer Ketten in E. coli, möglicherweise trägt die lange und hydrophobe CDR-H3 auch hier mit zur Löslichkeit der VH-CH1-Kette bei. Wie von Schiweck et al. (1997) vorgeschlagen, können Kristallstrukturanalysen einer einzelnen VH-Domäne Information über die Konformation der CDR-H3 (Maskierung der Interaktionsfläche mit der VL-Domäne) liefern.

Die leichte Kette liegt im Periplasma vorrangig in löslicher Form vor. In einer nicht reduzierenden SDS-PAGE ist in der unteren der 46 kD-Doppelbande die leichte Kette detektierbar, die schwere Kette jedoch nicht (kein Nachweis des fusionierten His-tags). Diese Bande hat ein kleineres Molekulargewicht als die identifizierte Fab-Bande (> 46 kD, obere Bande). Es könnten Dimere der leichten Kette sein, vergleichbar mit Bence-Jones ähnlichen Dimeren (Stevens et al., 1991).

Die in den folgenden Kapiteln geführte Diskussion zu den Bindungseigenschaften des 9E10-Fab und seiner Rückmutanten erfolgt unter Einbeziehung der kristallographischen Daten der dimerisierten 9E10-Fab-Fragmente, von denen ein Fab das myc-tag-Peptid bindet (Krauß et al., 2007).

7.3 Charakterisierung der Bindungseigenschaften von 9E10-Fab

↓98

9E10 wurde bereits von Hilpert et al., Schiweck et al. und Krauß et al. ausführlich in seiner Bindungsstärke zu dem 11-mer myc-tag-Peptid (EQKLISEEDLN) charakterisiert. Das 9E10-IgG bindet an den myc-tag in Fusion mit einem scFv-Fragment im kompetitiven ELISA mit KD von 560 ± 190 nM (Hilpert et al., 2001). In Fluoreszenz-Titrationsexperimenten wird ein KD für einen Komplex aus einem N-terminal mit einem Fluorophor markierten myc-tag-Peptid und einem in E. coli produzierten 9E10-Fab mit 80 ± 5 nM bestimmt (Schiweck et al., 1997). Auch von Krauß et al. (2007) wurde mit der isothermen Titrationskalorimetrie eine Bindungskonstante für das 9E10-IgG an das myc-tag-Peptid (KD = 8.7 x 10-7M) ermittelt, die gut mit dem Wert im ELISA von Hilpert et al. (2001) übereinstimmt. Die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Werte für den KD der Bindung des myc-tag-Peptides an das vom IgG proteolytisch abgespaltene 9E10-Fab, die in einem kompetitiven ELISA und mit der SPR-Methode (620 ± 350 nM, ELISA und 902 ± 1 nM, SPR) erhalten wurden, unterscheiden sich nicht signifikant von dem von Hilpert et al. (2001) und Krauß et al. (2007) publizierten Werten. Der in der vorliegenden Arbeit zusätzlich über Signalsättigungsexperimente mit der SPR-Methode gefundene KD-Wert von 830 nM bestätigt dieses Ergebnis noch einmal. Im selben Signalsättigungsexperiment ergab der Quotient der kinetischen Konstanten kon und koff (koff/kon) ebenfalls einen von den Literaturdaten nicht signifikant abweichenden Wert von 814 ± 141 nM. Die größeren Differenzen (bis Faktor 1,6) zwischen den Werten aus den ELISA und SPR-Messungen sind mit den unterschiedlichen Meßmethoden zu erklären. Bei der Bindung an Peptide können strukturelle Anpassungen für einen besseren Fit des Peptides an den Antikörper kritisch sein, somit sollte im Falle eines Ein-Schritt-Bindungsmechanismus die Gleichgewichtskonstante KD gleich koff/kon sein. Größere Abweichungen von KD zu koff/kon würden einen komplexeren Bindungsmechanismus wiedergeben, der die Folge von größeren Konformationsänderungen während der Komplexausbildung sein könnte. Die Bindung des 9E10-Fab an das 11-mer myc-tag-Peptid wird deshalb nach dem Ein-Schritt-Mechanismus beschreiben, da hier keine wesentlichen Unterschiede zwischen dem Verhältnis koff/kon und KD auftreten.

Für das rekombinant hergestellte 9E10-Fab haben sich keine signifikanten Unterschiede (bis Faktor 1,6) im KD der Komplexbildung mit dem myc-tag-Peptid aus den ELISA- (500 ± 200 nM) und den SPR-Messungen (800 ± 100 nM) ergeben.

Da der KD des vom 9E10-IgG proteolytisch abgespaltenen Fab und des rekombinanten 9E10-Fab-Fragmentes keine großen Unterschiede zeigen (bis Faktor 1,2), kann geschlussfolgert werden, dass die im Weiteren beschriebenen größeren Abweichungen im KD der rekombinant produzierten 9E10-Rückmutanten durch die jeweilige(n) Rückmutation(en) zustande gekommen sein sollten. Zudem zeigen diese Ergebnisse, dass es sich bei dem rekombinant exprimierten 9E10 Fab um ein funktionelles Fragment handelt.

↓99

Der niedrigere KD von 80 nM bei der Bindung des myc-tag-Peptides an das rekombinante 9E10-Fab, der von Schiweck et al. mit Hilfe der Fluoreszenztitration ermittelt wurde und eine Abweichung um den Faktor 7,8 (ELISA) und 11,3 (SPR) zu den hier gemessenen Werten aufweist, könnte durch zusätzliche Interaktionen des N-terminalen Fluorophors (Abz, 2-Aminobenzoesäure) am Peptid mit aromatischen Seitenresten der CDR-H3 bei der Bindung an den 9E10 erklärt werden. Kristallstrukturdaten des 9E10 im Komplex mit dem myc-tag-Peptid belegen eine direkte räumliche Nachbarschaft des N-Terminus des Peptides zu den Tyrosinresten 99, 100 und 100a der CDR-H3 (siehe auch Abb. 7.1.).

Hilpert et al. untersuchten weiterhin die Bindungsstärke des 9E10 zu verkürzten und mutierten myc-Peptiden. Das kürzeste vom 9E10 gebundene myc-Peptid war ein 8-mer (KLISEEDL) mit KD von 26 ± 19 µM. In der vorliegenden Arbeit wird 9E10 zum ersten Mal in seinem Bindungsverhalten zu einem längeren c-myc-Peptid untersucht. Ausgehend von einer Modellvorstellung, die auf der Kristallstrukturanalyse des 9E10 im Komplex mit dem myc-tag-Peptid basiert, wird das Peptid am C-Terminus um sieben Aminosäuren und am N-Terminus um zwei Aminosäuren auf das 20-mer A408EEQKLISEEDLLRKRREQL427 verlängert. Mit zwei Meßmethoden konnte gezeigt werden, dass zum 20-mer myc-Peptid eine höhere Affinität als zum 11-mer myc-tag-Peptid besteht. Ein KD von 6,8 ± 1,6 nM (kompetitiver ELISA) und ein KD von 1,2 ± 0,3 nM (SPR) wurden für die Bindung des 9E10-Fab an das 20-mer-Peptid bestimmt. In der Literatur findet man anti-Peptid-Antikörper, wie den 164-2-Antikörper, der mit der höchsten Affinität (KD = 7,5 nM) das kürzeste analysierte Peptid (11-mer) bindet, das zur Region (273-283) der E. coli-Tryptophan-Synthase gehört (Larvor et al., 1991). Dafür untersuchten Larvor et al. Peptide in einer Länge von 11 bis 29 Aminosäuren, um das Epitop des 164-2 Antikörpers präziser darzustellen. 9E10 dagegen erreicht eine höhere Affinität zu einem längeren myc-Peptid als zu dem in der Literatur beschriebenen myc-tag-Peptid. In den meisten Fällen jedoch, wie z. B. bei dem anti-Peptid-Antikörper CB4-1 (Kramer et al., 1997), bringen Verlängerungen am Peptid weder Verbesserung noch Verschlechterung in der Affinität.

Substitutionsanalysen am 20-mer Peptid zeigen einen Bereich, bestehend aus den Aminosäuren Q411KLISEEDLLRKR423, der mit einer höheren Selektivität erkannt wird. Die in der Literatur beschriebenen Schlüsselpositionen im Peptid LISE (Hilpert et al., 2001) werden in der vorliegenden Arbeit um den Rest LP419 auf die Schlüsselpositionen L413ISEXXL419 erweitert. Insbesondere in den Substitutionsanalysen am verlängerten 20-mer(408-427)-Peptid wird die sehr hohe Selektivität des 9E10 für den Seitenrest LP419 im Peptid klarer.

↓100

Längenanalysen mit Peptid-Spots haben gezeigt, dass die Verlängerung des C-Terminus um sieben Aminosäuren, ausgehend vom 11-mer-Peptid EQKLISEEDLL, zu einer Affinitätszunahme führt. Die Verlängerung des N-Terminus um AP408 und EP409 hingegen bringt einen Affinitätsverlust mit sich, Dieses wird besonders bei Bindungsexperimenten mit den Rückmutanten LKeimbahn/H9E10 sowie L9E10/HKeimbahn deutlich und verstärkt sich in Bindungsexperimenten mit der kompletten 9E10-Rückmutante. Der Verlust der Affinität durch eine N-terminale Peptidverlängerungen kann durch Substitutionen am verlängerten N-Terminus verhindert werden, wie mit dem Austausch von EP409 gegen F in Längenanalysen und Substitutionsanalysen mit dem 20-mer Peptid gezeigt werden konnte. Bei der Bindung der kompletten 9E10-Rückmutante an dieses Peptid in den Peptidspot-Experimenten führt diese Mutation zu einem deutlichen Affinitätsgewinn im Vergleich zur Bindungsstärke an das 20-mer und 18-mer Peptid. Ein aromatischer Rest an Position 409 könnte mit den Tyrosinen 99, 100 oder 100a in der CDR-H3-Schleife interagieren (Abb. 7.1.), ähnlich wie bereits zuvor im Zusammenhang mit dem niedrigen KD (80 nM, Schiweck et al., 1997) des N-terminal mit einem Fluorophor markierten myc-tag-Peptides des Komplexes mit dem 9E10-Fab diskutiert wurde.

Abb. 7.1. : Der N-Terminus des myc-tag-Peptides (grün) ist von den Tyrosinresten 99, 100 und 100a in der CDR-H3-Schleife umgeben.

Der mit der C-terminalen Verlängerung einhergehende Affinitätsgewinn könnte auf die Ausbildung oder Fortsetzung einer Sekundärstruktur (z.B. einer α-Helix) im Peptid hindeuten. Am deutlichsten erkennt man den Einfluss der Peptidverlängerung bei der Bindung an die komplette 9E10-Rückmutante. Der um lediglich zwei Reste verlängerte N-Terminus führt zu einem Affinitätsverlust, während eine Verlängerung um sieben Reste am C-Terminus die Affinität erhöht. Der Affinitätsverlust, der bei der N-terminalen Verlängerung auftritt, könnte darauf hindeuten, dass es zu keinen spezifischen Interaktionen (außer z.B. bei der Substitution E409F) oder internen Stabilisierungen durch Sekundärstrukturbildung kommt. Anders verhält es sich im Falle des C-Terminus, was auf spezifische Interaktionen mit der 9E10 CDR-H3 oder eine Sekundärstrukturbildung im Peptid hinweisen könnte, die mit 11,2 bzw. 16,4 kJ/mol (ELISA, SPR) zu einem Affinitätsanstieg führen. Eine Erklärung könnte die in dieser Arbeit postulierte Modellstruktur der α-helikalen Bindungskonformation eines verlängerten C-Terminus liefern. Nach diesem Modell könnte insbesondere der Rest KP422 und möglicherweise auch QP425 mit der CDR-H3 interagieren.

↓101

In den Bindungskinetiken äußert sich die höhere Affinität des 20-mer Peptides zum 9E10 verglichen mit dem 11-mer Peptid in einer anwachsenden Assoziationsgeschwindigkeit und sinkenden Dissoziationsgeschwindigkeit. Eine schnellere Komplexausbildung kommt in einem ca. 40-fachen Anstieg des kon-Wertes zum Ausdruck. Die Komplexe zerfallen auch langsamer, was sich in einem ca. 20-fach abnehmenden koff widerspiegelt, dass heißt also, die schnellere Assoziation der Komplexe leistet den größeren Beitrag zum Affinitätsgewinn.Da hier nur Änderungen am Peptid und nicht am Antikörper vorgenommen wurden und auch die N-terminalen Reste 408 und 409 des 20-mers keinen Beitrag zur stärkeren Bindung liefern, ist davon auszugehen, dass der verlängere C-Terminus des Peptides eine entscheidende Rolle spielt. Im c-Myc-Protein ist die Sequenz des myc-Peptides Bestandteil einer langen α-Helix. Es wäre möglich, dass die myc-Peptide in Lösung und im immobilisierten Zustand ebenfalls zu einem Teil, wenn auch nur zu einem geringen, in einer α-helikalen Konformation vorliegen. So eine isolierte α-Helix wäre eine dynamische Struktur in Lösungen, die sich schnell faltet und entfaltet. In einem längeren Peptid könnte diese α-helikale Konformation mit einer höheren Wahrscheinlichkeit entstehen als in einem kürzeren, da sich mehrere für die Bildung einer α-Helix kritischen Nukleationspunkte bilden könnten (Creighton, 1993). Wäre für die Bindung des myc-Peptides an 9E10 am C-Terminus (415-427) des Peptides eine α-helikale Struktur energetisch günstig, könnte die Tendenz zur Ausbildung einer solchen Konformation im myc-Peptid die schnellere Assoziation des 9E10 an das 20-mer erklären.

Eine stabile α-Helix ist für die selektive Erkennung der Peptidschlüsselreste IP414, SP415 und LP419 durch 9E10 entscheidend, da die Bindungstaschen dieser Peptidseitenketten teilweise von den Peptidresten des α-helikalen C-Terminus, wie in der Kristallstruktur des 9E10 mit dem myc-tag-Peptid ersichtlich, gebildet werden. Die für die selektive Erkennung wichtigen Umgebungen dieser Schlüsselreste kommen also nur im Falle einer α-helikalen Konformation des C-Terminus (ab Position 415) des Peptides zustande. Somit bestimmt die Konformation des myc-Peptides die Bindungsspezifität des 9E10 mit.

Die Bindung an das 20-mer Peptid, verbunden mit einer höheren Affinität, könnte den Bindungsmodus des Antikörpers an das als Immunogen eingesetzte längere Peptid(408-439) als Konjugat mit KLH (KLH = keyhole limpet hemocyanin), Evan et al., 1985) mimen. Das 20-mer Peptid könnte also eine Konformation ähnlich der des verwendeten Antigens annehmen. Es bleibt mit Hilfe der Kristallstrukturanalyse oder NMR zu untersuchen, ob die Peptidreste 408-439 als Konjugat mit dem Protein KLH eine α-Helix ausbilden, welche Bindungskonformation das 20-mer-Peptid, insbesondere die C-terminalen Reste 415-427, bei der Bindung an 9E10 einnimmt und welche Bindungskonformation die CDR-H3 bildet (falls abweichend von der Bindung an das myc-tag-Peptid). Analog hierzu untersuchten Zahnd et al. (2004) die Bindung des scFv H6 an ein 12-mer Peptid, dessen Sequenz Teil eines coiled-coil Leuzin-Zippers des Hefetranskriptionsfaktors GCN4 ist. In der Kristallstruktur war im Komplex mit dem H6 das Peptid deutlich als eine α-Helix mit drei Drehungen zu erkennen. Zahnd et al. vermuten, dass der Ursprung des Peptides (α-Helix) die Tendenz zur Ausbildung einer α-Helix im Komplex mit dem H6 erklären könnte. Ihre CD-Analysen haben gezeigt, dass das Peptid in Lösung klar als ein random coil (Knäuelkonformation) vorliegt und die Ausbildung der α-Helix vom H6 induziert wird. Es wäre also auch interessant, CD-Spektren der verschiedenen myc-Peptide aufzunehmen, um eine Aussage über deren Konformation in Lösung machen zu können. Ein helikaler Konformationsbereich von an Antikörper gebundenen Peptiden ist ungewöhnlich und wurde bisher nur für zwei weitere Kristallstrukturen des Komplexes des C21 mit P-Glycoprotein, in dem alle 11-Peptidreste eine α-Helix ausbilden (van den Eisen et al., 1999), und des Komplexes des anti-Interleukin 2 Fab mit einem Nonapeptid mit sieben Resten in einer α-helikalen Konformation (Afonin et al., 2001) beschrieben.

↓102

Die Kinetik der Komplexassoziation zwischen 9E10 und dem 20-mer-myc-Peptid ist, verglichen mit vielen anderen Antikörpern, eine langsame bis mittelschnelle (kon = 0,99 ± 4 x 105 M-1 s-1,myc(408-427)-Peptid). Die Komplexe sind jedoch sehr stabil und zerfallen nur langsam (koff = 0,12 ± 0,03 10-3 s-1). Mit einem kon von 0,99 ± 0,04 x 105M-1 s-1 zum myc(408-427)-Peptid bei 23°C ist 9E10 vergleichbar mit dem kon anderer hochaffiner Antikörper wie dem anti-Hapten-Fab 9T10, das NP (4-Hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl) mit einem KD = 8,3 ± 0,2 nM und einem kon = 1,8 x 105 M-1 s-1 (Sagawa et al., 2003) bei 25°C bindet. Das simulierte Sensorgramm der Bindung dreier Moleküle an ihren Bindungspartner in einer Standard-SPR in der Abbildung 7.2. (nach Andersson, 2004) soll zeigen, dass eine gleich hohe nM-Affinität durch unterschiedliche Bindungskinetiken erreicht werden kann. Der 9E10 folgt dem Beispiel A. Die hohe Affinität zum Peptid wird vorrangig durch den langsamen Zerfall der Komplexe, ausgedrückt durch die langsame Dissoziation, erreicht. Die im Peptid teils vorhandene Flexibilität sowie die partiell flexible Bindungstasche des 9E10 könnten der Grund für die mittelschnelle Assoziation der Komplexe sein. In der Kristallstruktur des freien 9E10-Fab (Krauß et al., 2007) ist keine definierte Elektronendichte für die Loop-Regionen der CDR-H3 und Teile der CDR-L1 auszumachen. In der Komplexstruktur des 9E10-Fab mit dem myc-tag-Peptid gibt es große Konformationsunterschiede in der CDR-H3-Schleife zwischen dem bindenden und dem nicht bindenden Fab, die im Kristall mit einer Stöchiometrie von zwei Fab auf ein Peptid vorliegen (Krauß et al., 2007). Die Kristallstrukturdaten deuten auf eine hohe Flexibilität der CDR-H3 hin, außerdem berichten Krauß et al. von einem ungünstigen Beitrag der Entropie zur freien Bindungsenergie. Die gebildeten Sekundärstrukturen des Peptides im Komplex (insbesondere das β-Faltblatt mit der 9E10-CDR-H3) sind möglicherweise einer der Gründe für die hohe Stabilität des Komplexes.

Abb.7.2. : Simulierte SPR-Diagramme dreier Moleküle, die mit gleicher Affinität (KD = 10 nM) jedoch mit unterschiedlichen kinetischen Parametern interagieren. Das Diagramm A zeigt eine langsame Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeit (kon = 104 M-1 s-1 undkoff = 10-4 s-1). Im Diagramm B sind mittelschnelle Kinetiken (kon = 105 M-1 s-1 und koff = 10-3 s-1) und im Diagramm C schnelle (kon = 106 M-1 s-1 und koff = 10-2 s-1) zu sehen (nach Andersson, 2004).

Einen weiteren wichtigen Hinweis für die mögliche Existenz einer C-terminalen α-Helix im Peptid liefern die Substitutionsanalysen an den verlängerten myc-Peptiden. Einfach substituierte Peptide mit Prolinen im Bereich 416-421 werden im Falle des 20-mers nicht gebunden. In der Kristallstrukturanalyse des 9E10 im Komplex mit dem myc-tag-Peptid bilden die Reste 415-420 eine α-helikale Struktur (Abb.7.3). In den Substitutionsanalysen am myc-tag-Peptid wird nur an der letzten Position (420) der α-helikalen Struktur ein P schwach toleriert. Im 20-mer-Peptid wird trotz hoher Gesamtaffinität ein P an Position 420 nicht toleriert. Erst ab der Position 422 werden Proline im 20-mer-Peptid zunächst schwach und zum C-Terminus hin stärker toleriert. Die Diskriminierung von Prolinresten am C-Terminus könnte auf eine α-helikale Struktur deuten. Auch wenn die Substitutionsanalysen keine Aussage über die Peptidrückgratkonformation geben, liefert das folgende Beispiel eine gute Übereinstimmung zwischen der Selektivität zum Prolinrest 415 im Peptid in den Substitutionsanalysen und der Bindungskonformation des myc-tag-Peptides in der 9E10-Bindungsregion in der Kristallstruktur. Das Peptidrückgrat ändert nur an einem Punkt seine Richtung (Kristallstrukturdaten) – am Rest 415 (Abb.7.3). An der Schlüsselposition SP415 werden neben S auch die Substituenten P, A und G im myc-tag-Peptid toleriert. Ein P an dieser Position kann die für die Bindung des myc-Peptides notwendige Richtungsänderung erzwingen, ein G würde es dagegen erlauben. Prolinreste passen auch gut an den N-Terminus einer α-Helix (Creighton, 1993).

↓103

Abb.7.3: Modellierte Bindung des verlängerten Epitops (E410QKLISEEDLLRKR423) an den 9E10. Die Aminosäuren 410-419 entsprechen der Konformation des Peptides im Komplex mit 9E10 aus der Kristallstrukturanalyse. Die Konformation der Aminosäuren 420-423 (blau) des Peptides ist modelliert. Vom 9E10-Antikörper ist die Lösungsmittel zugängliche Oberfläche dargestellt. In Rot wird die C-terminale α-Helix gezeigt.

Basierend auf den hier diskutierten Messdaten wird das in der Literatur beschriebene 9E10-Epitop E410QKLISEEDL419 um vier Aminosäurereste auf die Sequenz E410QKLISEEDLLRKR423 verlängert. Die Bindung des verlängerten C-Terminus (420-424) an den 9E10 wird in einer α-helikalen Konformation vorgeschlagen (Abb. 7.3.). Die für die Bindung entscheidenden Schlüsselpositionen im Peptid werden um LP419 auf L413ISEXXL419 erweitert. Mit dem in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Modell der Bindung des verlängerten Peptides an den 9E10, das eine α-Helix am C-Terminus (420-424) des Peptides postuliert, kann die hohe Affinität an das verlängerte Peptid erklärt werden.

7.4 Charakterisierung der Bindungseigenschaften von Rückmutanten

7.4.1  Einfluss von Einzelrückmutationen auf die Bindungseigenschaft

7.4.1.1  Die Einzelrückmutationen HH31S, RH53G und GH52S

In der Kristallstruktur des 9E10 im Komplex mit dem myc-tag-Peptid befinden sich die Aminosäuren HH31 und RH53 im direkten Kontakt zu dem Peptid. Ein Histidin an der Position 31 der VH-Domäne ist laut der R.U.Bi.C.-Datenbank selten. Einzelrückmutationen dieser Aminosäuren auf die Keimbahngensequenz haben nur einen geringen Einfluss auf den KD der Bindung des Antikörpers zum Peptid. Die geringen Änderungen im KD waren in den Bindungsexperimenten zum schwächer affinen myc-tag-Peptid besser messbar. So kam es mit der Rückmutation RH53G zum 8-fachen Affinitätsverlust des Antikörpers bei der Bindung an das myc-tag-Peptid in den ELISA- und zum 20-fachen Affinitätsverlust in den SPR-Experimenten. Die Einzelrückmutation HH31S ergab eine 2-fache (ELISA) bzw. 3-fache (SPR) Einbuße für die Affinität des Antikörpers. Im Vergleich hierzu brachte die Bestimmung des KD bei der Bindung der 9E10-Rückmutante RH53G an das höher affine myc(408-427)-Peptid (ELISA) keine signifikanten Unterschiede zum KD der Bindung des 9E10 an das Peptid, was wiederum den geringen Einfluss dieses Seitenrestes auf die Affinität des 9E10 unterstreicht. Die Mutagenese von Lösungsmittel-exponierten Aminosäuren kann laut Lo Conte et al. (1999) nur einen geringen Einfluss auf die Affinität ausüben. Die geringen Effekte der Einzelrückmutationen HH31S und RH53G auf die Affinität des Antikörpers könnten ebenfalls auf die Lösungsmittel-exponierte Lage dieser Positionen zurückgeführt werden.

↓104

Die Substitutionsanalysen mit myc-Peptiden unterschiedlicher Affinität zum Antikörper machten zudem eine feinere Analyse der Bindungsspezifität der Rückmutanten möglich. So konnte die Bindungsspezifität der 9E10-Rückmutante HH31S besser am verkürzten 8-mer c-myc(412-419)-Peptid und die der Rückmutante RH53G am längeren 11-mer myc-tag-Peptid charakterisiert werden. Wie aus diesen Substitutionsanalysen zu ersehen ist, nimmt die selektive Erkennung von EP417 durch den Antikörper mit der Rückmutation dieser Reste ab. Die Abbildung 7.4. zeigt die räumliche Umgebung des Peptidseitenkettenrestes EP417 in der Kristallstruktur des 9E10 im Komplex mit dem myc-tag-Peptid. Die Position EP417 ist Bestandteil der kurzen C-terminalen α-Helix. Der Peptidrest EP417 wird von den RestenSH30 über eine Wasserstoffbrücke über ein Wassermolekül, von HH31 über Van-der-Waals-Kontakte und von RH53 über ionische Wechselwirkungen (3,08 Å Abstand) gebunden. In der Kristallstruktur des c-Myc-Proteins im Komplex mit dem Max-Protein (Nair et al., 2003) bildet der Proteinrest E417 dagegen eine Salzbrücke mit dem Rest R421 derselben α-Helix aus (2,8 Å-Entfernung). Allerdings bleibt unklar, welche Bindungskonstellation für den Peptidrest EP417 bei der Bindung des 9E10 an das verlängerte 20-mer Peptid vorliegt, wenn durch eine Verlängerung des Peptides der Rest RP421 hinzukommt.

Abb. 7.4.: Bindung des Peptidrestes EP417 durch die Reste HH31, RH53 und SH30 im 9E10. Die Abstände zwischen den Atomen sind in Å angegeben.

Die Substitutionsanalyse am verkürzten Peptid c-myc(412-419) mit der HH31S Einzelrückmutation im 9E10 zeigt eine zunehmende Toleranz des Antikörpers gegenüber den Peptidresten G, L und M an Position 417. Jene substituierten Peptide werden von 9E10 HH31S-Fab besser gebunden als vom 9E10. Dagegen wird das Peptid mit einem Y am Rest 417 von dieser Rückmutante schwächer gebunden als vom gereiften 9E10-Fab, da wahrscheinlich die günstigen Wechselwirkungen des Y mit dem H wegfallen. Auch die Rückmutation RH53G im 9E10 begünstigt eine höhere Toleranz zu den Substitutionen L, M, S, T, und V am Rest 417 des Peptides. Mit den Einzelrückmutationen von HH31 und RH53 zu S und G werden zwei positiv geladenen Reste in der Bindungstasche des Peptidrestes EP417 eliminiert. Apolare Aminosäurereste, wie I, L und V, an der Position 417 im Peptid können nun auch von dem rückmutierten Antikörper toleriert werden, wobei bereits eine dieser Rückmutationen (HH31 oder RH53) zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Substitutionen an dieser Position führt. Demzufolge führen die Reste HH31 in der CDR-H1 und RH53 in der CDR-H2 zu einer stärkeren Diskriminierung von G und den apolaren Resten I, L und M an der Peptidposition 417 bei der Bindung des 9E10-Antikörpres an das Peptid. In der Gesamtheit haben die somatischen Mutationen von SH31H und GH53R zu einer erhöhten Selektivität des 9E10-Antikörpers zu dem Rest EP417 im myc-tag-Peptid geführt. Somit könnte man in einer auf 9E10 basierenden Bibliothek über Randomisierung der Positionen 31 und 53 im 9E10 höher affine Binder zu der verkürzten 8-mer Peptidvariante (KLISEF417EL) selektieren.

↓105

Die zunehmende Affinität während der Reifung von Antikörpern kann durch eine zunehmende Assoziationsgeschwindigkeit und/oder abnehmende Dissoziations-geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Komplexe zustande kommen. In der Literatur wird ein erhöhter kon während der Affinitätsreifung von Antikörpern mit der kinetischen Selektion der Antigenbindungstasche für eine schnelle Antigenassoziation erklärt (Manivel et al., 2000). Die Abnahme des koff wird mit der Stabilisierung einer günstigen Bindungskonformation erklärt, durch versteifende Mutationen, von denen das Antigen langsamer dissoziiert als von einer stärker flexiblen Bindungstasche (Sagawa et al., 2003).

Die Reste HH31 und RH53 könnten dadurch, dass sie eine teils positiv geladene Oberfläche auf dem Antikörper schaffen, die Kinetik der Assoziation des Peptid-Antikörper-Komplexes durch Anziehung der negativ geladenen Seitenkettenreste EP416, EP417 und DP418 im Peptid beschleunigen. Allerdings sollte der zu erwartende Effekt auf die Kinetik der Komplexbildung gering ausfallen, da die an der Antikörperoberfläche gelegenen Reste HH31 und RH53 im Peptid-Antikörper-Komplex von Wassermolekülen umgeben sind und jene zu einer Abschwächung von elektrostatischen Wechselwirkungen führen. In der Tat sind die Änderungen im kon auch gering und konnten am Beispiel der 9E10-Rückmutante RH53G nur bei der Bindung an das schwächer affine myc-tag-Peptid detektiert werden. So kommt es bei der Rückmutation RH53G im 9E10 während der Komplexausbildung mit dem myc-tag-Peptid zu einer Abnahme der Assoziationsgeschwindigkeit um das 20-fache. Die Rückmutation HH31S im 9E10 hat dagegen keinen Effekt auf den kon, jedoch einen auf den koff. Mit dieser Einzelrückmutation zerfallen die Komplexe mit einer 2-fach schnelleren Geschwindigkeit. Fersht diskutiert in einer Zusammenfassung in Structure and Mechanism in Protein Science am Beispiel von α-Helices (1999), dass Lösungsmittel-exponierte Salzbrücken durchaus eine Beitrag, wenn auch einen geringen, zur thermodynamischen Stabilität von Helices liefern. Danach resultiert der geringe Beitrag aus der Solvatisierung durch das Wasser und aus dem Verlust der Entropie bei der Immobilisierung zweier geladener Seitenreste. Jedoch kann der Entropieverlust durch externe hydrophobe oder van-der-Waals-Wechselwirkungen eines Seitenrestes mit dem Protein kompensiert werden. Histidin 31 könnte analog hierzu einen wichtigen Beitrag zur Stabilisierung der Salzbrücke zwischen EP417 in dem Peptid und RH53 im 9E10-Fab durch Fixierung der Seitenkette des EP417 über van-der-Waals-Wechselwirkungen leisten. Demzufolge könnte die Rückmutation RH53G die Assoziation zwischen dem Antikörper und dem Peptid durch den Wegfall einer elektrostatischen Anziehung verlangsamt haben, während die Rückmutation HH31S zu einem schnelleren Zerfall der Komplexe aufgrund einer fehlenden Stabilisierung der Salzbrücke zwischen EP417 und RH53 geführt haben könnte. Hierzu könnte man auch den Kooperationseffekt zwischen den Resten HH31 und RH53 bei der Bindung an das Peptid durch Herstellung einer 9E10-Doppelrückmutante untersuchen. Ein oft zitiertes Beispiel für eine zunehmende Assoziationskinetik als ein Resultat zusätzlicher elektrostatischer Wechselwirkungen wird von Fersht (1999) für den Barstar-Barnase-Komplex gegeben. Andererseits kann auch nicht ausgeschlossen werden, dass mit dem Austausch von RH53 zu G im 9E10 die Änderungen im kon auf Konformationsänderungen in der CDR-H2 zurückzuführen ist.

Der Seitenrest der Schlüsselposition EP416 im Peptid wird vom 9E10 in einer vorgeformten Bindungstasche fixiert (Abb. 7.5.A.). Die Bindung des folgenden Seitenkettenrestes EP417 im Peptid an den 9E10 ermöglicht eine Drehung des Peptidrückgrates. Zwischen dem Oγ-Atom des Peptidseitenkettenrestes SP415 ist eine Wasserstoffbrücke zum N-Atom der Peptidbindung der Aminosäure DP418 oder zum O-Atom der Carboxylgruppe des selben Restes möglich, der wiederum über ein Wassermolekül eine Wasserstoffbrücke zum N-Atom der Peptidbindung der Aminosäure SP415 bilden kann (Abb. 7.5.B.). Die Konformation der Seitenkette von SP415 wird dagegen durch Wechselwirkungen mit dem 9E10-Rest YH32 fixiert. Diese Vielzahl der möglichen Wasserstoffbrücken führt zur Stabilisierung der α-helikalen C-terminalen Konformation des Peptides. Interessanterweise kommt es bei einer Überlagerung der Cα-Atome der α-Helix aus dem c-Myc-Protein mit denen des myc-tag-Peptides in der Kristallstruktur mit dem 9E10 fast zu einer Überdeckung des Oγ-Atom des SP415 im myc-tag-Peptid mit dem O-Atom der Peptidbindung der Aminosäure I414 im c-Myc-Protein (0,46 Å Abstand) (Abb. 7.5.B.).

↓106

Abb. 7.5.: Interaktionen des C-Terminus (415-420) des Peptides mit dem 9E10. (A.) Darstellung der Lösungsmittel-zugänglichen Oberfläche des 9E10. Der C-Terminus des Peptides wird in einer α-helikalen Konformation erkannt, die unter anderem durch die vom 9E10 vorgeformten Bindungstaschen für die Seitenreste EP416 und EP417 ermöglicht wird. (B.) Darstellung möglicher intramolekularer Wasserstoffbrücken am N-Terminus der α-Helix. Eine mögliche Wasserstoffbrücke des Oγ-Atoms des SP415 zum N-Atom der Peptidbindung an der Position i+4 kann die Fortsetzung der α-Helix am N-Terminus mimen (Rückgrat der α-Helix im c-Myc-Protein, grün). (C.) Darstellung der möglichen Wasserstoffbrücken des O-Atoms der Peptidbindung der Aminosäure HH31, wobei wieder die Fortsetzung der α-Helix durch eine Wasserstoffbrücke zur Position i+4 gemimt werden kann (Rückgrat der α-Helix im c-Myc-Protein, grün). Die Abstände zwischen den Atomen sind in Å angegeben.

Auch für das O-Atom der Peptidbindung von HH31 in der VH-Domäne des 9E10 ist eine annähernde Überlagerung mit dem O-Atom der Peptidbindung von L413 im c-Myc-Protein (1,18 Å Abstand) möglich (Abb. 7.5.C.). Der Sauerstoff der Peptidbindung von HH31 in der VH-Domäne des Antikörpers wäre in der Lage, eine Wasserstoffbrücke zum N-Atom der Peptidbindung der Aminosäuren 416 oder 417 im myc-tag-Peptid auszubilden. Der Serinrest 415 im myc-tag-Peptid und das O-Atom der Peptidbindung des HH31 im Antikörper könnten also Wasserstoffbrückenpartner zu den N-Atomen der Peptidbindungen an den Positionen 418 und 416 bzw. 417 im myc-tag-Peptid, wie sie in der α-Helix des c-Myc-Proteins zu diesen Atomen zustande kommen, mimen. All diese Interaktionen fördern die Ausbildung einer α-Helix am C-Terminus des Peptides bei der Bindung an den 9E10. Hier liegt die Vermutung nahe, dass der Antikörper die Bildung einer α-Helix im Peptid bei der Bindung induzieren kann, wie es für die Bindung des H6-Antikörper an sein Peptidantigen berichtet wurde (Zahnd et al., 2004), oder diese, was wahrscheinlicher ist, stabilisieren kann.

In den ELISA-Experimenten zur Bestimmung des KD der 9E10-Rückmutante GH52S bei der Bindung an das 20-mer c-myc(408-427)-Peptid werden im Vergleich zum 9E10-Fab keine Abweichungen in den Konstanten gemessen. Ein KD der Bindung der Rückmutante an das 11-mer myc-tag-Peptid konnte aufgrund der kaum nachweisbaren Bindungssignale weder mit der ELISA- noch mit der SPR-Methode bestimmt werden. Zum 20-mer c-myc(408-427)-Peptid gelang es nur mit der SPR-Methode Bindungsunterschiede zwischen dem 9E10 und der 9E10 GH52S-Rückmutante zu detektieren. Auch in den Substitutionsanalysen am myc-tag-Peptid wird der Affinitätsverlust der 9E10-Rückmutante GH52S zum Peptid erkennbar. Die Unterschiede in den ermittelten KD-Werten aus der ELISA- und SPR-Messung sind auf Methodenunterschiede und auf die unterschiedliche Präsentation der myc-Peptide in beiden Methoden zurückzuführen.

↓107

Der KD erhöhtsich um das 40-fache bei der Bindung dieser 9E10-Rückmutante an das immobilisierte 20-mer myc(408-427)-Peptid, dabei war es die 40-fache Abnahme im kon, die zur Abnahme der Affinität geführt hatte. Hier kann man vermuten, dass die Rückmutation GH52S im 9E10 einen Einfluss auf die Konformation der CDR-H2 und/oder der benachbarten CDR-H1 haben könnte und dadurch zu einer Abnahme in der Assoziationsgeschwindigkeit des Komplexes geführt hat. Die Aminosäure GH52 ist Bestandteil einer β-Schleife in der CDR-H2 (Abb. 7.6.). Die Konf ormation kurzer Loops ist abhängig von der Position bestimmter Reste im Loop, z. B. von der Aminosäure G, die es der Kette erlauben könnte, eine ungewöhnliche Konformation anzunehmen (Creighton, 1993). Es ist durchaus möglich, dass der Austausch gegen S zu Änderungen der Konformation in der CDR-H2 geführt haben könnte. Die Abbildung 7.6. zeigt das Cα-Atom des G in 3,58 Å-Entfernung zu einem O-Atom der Carboxylgruppe des Restes EP417. Die Aminosäure GH52 ist Bestandteil einer Seitenrestbindungstasche von 9E10, die Wechselwirkungen mit dem Schlüsselrest EP416 im Peptid eingeht (siehe auch Abb. 7.12.). In den Substitutionsanalysen am 8-mer Peptid wird die zunehmende Toleranz zu F an der Position 416 beobachtet, die mit der Rückmutation GH52S zustande kommt. Dies könnte ein Hinweis auf Änderungen in der Bindungstasche sein, die durch Konformationsänderungen in der CDR-H2 verursacht werden.

Abb. 7.6.: Lage der Aminosäure GH52 in der CDR-H2 der 9E10-VH-Domäne (rot). Der Abstand zum myc-Peptidrest EP416 (grün) beträgt 3,58 Å.

7.4.1.2 Die neutrale Einzelrückmutation HH58Y

Von den in dieser Arbeit charakterisierten Positionen befindet sich die Aminosäure HH58 in der CDR-H2 in größter Entfernung zum Peptid (10,58 Å Abstand). Histidin58 hat somit keinen direkten Kontakt zum Peptid. Die Abbildung 7.7. zeigt die Aminosäure HH58 in der Kristallstruktur des 9E10-Peptid-Komplexes an der Grenzfläche zur benachbarten VL-Domäne mit einem Abstand von 4,88 Å zum Rest VL94 in der CDR-1. Die Rückmutation HH58Y wird als neutral charakterisiert, da keine messbaren signifikanten Unterschiede in der Gleichgewichtskonstante KD mit der ELISA- und der SPR-Methode ermittelt wurden. Auch in den Substitutionsanalysen am 11-mer myc-tag- und am 8-mer c-myc(412-419)-Peptid konnten keine wesentlichen Änderungen in der Affinität und Spezifität zum Peptid beobachtet werden. Es ist nicht auszuschließen, dass die somatische Mutation YH58H einen Einfluss auf die Affinitätsreifung hat, z. B. durch Beeinflussung der Konformation der CDR-H2, der Domänenorientierung oder des Domänenabstands zwischen VH und VL, die zu einer Optimierung der Bindungsgeometrie führen könnten. Diese Mutation ist möglicherweise als Rückmutation neutral. Es ist auch nicht bekannt, welchen Effekt diese Rückmutation in Kombination mit anderen Rückmutationen (z. B. in der CDR-H2) haben könnte. Genauso wenig sind die Reihenfolge der somatischen Mutationen während der Affinitätsreifung und ein möglicher Einfluss der somatischen Mutation YH58H in einem anderen Kontext bekannt. Allerdings treten im Zuge der Affinitätsreifung auch neutrale Mutationen auf, wie z. B. Yang und Schultz (1999) am Beispiel des 48G7-Antikörpers zeigen konnten.

↓108

Abb. 7.7.: Lage der Aminosäure HH58 in der 9E10-VH-Domäne (rot). Der Abstand zur VL-Domäne (blau) beträgt 4,88 Å (VL94).

7.4.1.3 Die Einzelrückmutationen SH100hY sowie FL30I und TL91S

Der 9E10 bindet das myc-tag-Peptid nicht im zentralen Teil der Antigenbindungstasche zwischen denbeiden variablen Domänen, wie bei vielen Antikörpern üblich, sondern außerhalb. Das Zentrum der Antigenbindungsstelle wird von der langen CDR-H3 okkupiert, die jetzt gegenüber der CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 liegt. Die Verschiebung der Antigenbindungsstelle im 9E10 ermöglicht einen Kontakt der langen CDR-H3 mit der CDR-L1 in der Schleifen-Region und der CDR-L3 an der Basis-Region.

Die Aminosäuren SH100h, FL30 und TL91 befinden sich in der Kristallstruktur des Peptid-9E10-Komplexes in einem Abstand von jeweils 6,54 Å, 5,83 Å und 8,65 Å zum myc-tag-Peptid und haben somit keinen direkten Kontakt zum Peptid. Dennoch ist insbesondere der Einfluss der Reste SH100h und FL30I auf die Affinität des Antikörpers zum Peptid hoch. Die Aminosäuren SH100h, FL30 und TL91 haben eine Gemeinsamkeit: Sie sind entweder Bestandteil der CDR-H3 (SH100h) oder stehen im direkten Kontakt (FL30I und TL91S) zu dieser. Die Einzelrückmutationen dieser Reste im 9E10 unterscheiden sich in ihrem Einfluss auf die Kinetiken der Bindung an die myc-Peptide. Während die Fabs mit den VL-Einzelrückmutationen FL30I und TL91S stärker den koff bei der Bindung an das Peptid beeinflussen, hat die Einzelrückmutation SH100hY einen größeren Einfluss auf den kon. Die Schlussfolgerung könnte sein: während S100h eine günstige Bindungskonformation der CDR-H3 mit beeinflusst, die VL-Reste FL30 und TL91 diese günstige Bindungskonformation der CDR-H3 stabilisieren.

↓109

Nach Furukawa et al. (2001) ermöglicht die Flexibilität in der CDR-H3-Struktur eine effiziente Antikörperreifung dadurch, dass sie eine Vielzahl von Antigenbindungsmodi einnehmen kann. Die Affinität der Einzelrückmutante 9E10 SH100hY zum löslichen c-myc(408-427)-Peptid nimmt um das 9-fache (ELISA) und zum immobilisierten Peptid um das 70-fache (SPR) ab. Der Rest SH100h liegt nach der Definition von Morea et al. (1998), wonach am C-Terminus die letzten sechs Reste der Region 92-104 (Nummerierung nach Kabat) zu der Basis gezählt werden, nahe der Basis der CDR-H3. Die Kristallstrukturen des im Komplex befindlichen und des freien 9E10-Fab zeigen eine Verschiebung des Cα-Atoms des Restes SH100h um 4.1 Å während der Bindung an das Peptid (siehe auch Abb. 3.8. zur Konformationsänderung der CDR-H3). Diese Verschiebung ermöglicht eine Interaktion mit dem in der Basis-Region lokalisierten Rest RH95 (Abb. 7.8.). Bei der Bindung an das Peptid bildet das Cγ-Atom des Restes TL91 einen van-der-Waals-Kontakt zum Cβ-Atom des Restes SH100h. Eine Wasserstoffbrücke des Oγ-Atoms von TL91 zum O-Atom der Peptidbindung des Restes YH100g fixiert unter anderem den neu entstandenen Knick in der CDR-H3. Damit könnten die Reste TL91 and SH100h mit an der Ausbildung einer günstigen Bindungskonformation der CDR-H3 beteiligt sein. Die Häufung von somatischen Mutationen (RH95H, SH100hY und TL91S) in dieser Region und die Konformationsänderungen der CDR-H3-Schleife bei der Bindung an das Peptid unterstreichen die Bedeutung dieses Bereiches für die Bindung.

Abb. 7.8.: Dargestellt sind die Aminosäuren SH100h in der VH-Domäne (gelb) und TL91 in der VL-Domäne (blau) in der Nähe der Basis der CDR-H3. Die Aminosäure TL91 steht im direkten Kontakt zu den Aminosäuren SH100h und YH100g, während SH100h auch einen Kontakt zu RH95 bildet. Von den V-Domänen ist die Lösungsmittel zugängliche Oberfläche dargestellt. Das myc-tag-Peptid ist grün dargestellt.

Eine Stabilisierung der Bindungskonformation der CDR-H3 könnte durch eine dichtere Packung des unteren Bereiches der CDR-H3 mit der VL-Domäne bewirkt werden. Die geringe Auswirkung der Rückmutation TL91S auf die Affinität ist an der Bindung zum myc-tag-Peptid messbar. Der Affinitätseinfluss der Rückmutation TL91S ist mit einer 3- (ELISA) bzw. 8-fachen (SPR) Affinitätsabnahme zum schwächer affinen myc-tag-Peptid geringer als der Einfluss der Rückmutante FL30I in der CDR-L1 mit einer 6- (ELISA) bzw. 10-fachen (SPR) Affinitätsabnahme zum höher affinen c-myc(408-427)-Peptid. Die herabsetzende Wirkung der Rückmutation FL30I auf die Affinität könnte auf einen ungünstigen Entropieeffekt für die freie Standardenergie der Bindung zurückgeführt werden. Der Rest 30 ist von aromatischen Resten der CDR-H3 and CDR-L1 umgeben (Abb. 7.9.). Der große hydrophobe Rest des Phenylalanins kann im Vergleich zum Keimbahngen-kodierten Isoleuzin durch geringere Entropieverluste immobilisiert werden. Dies könnte die Interaktion der CDR-L1 mit der CDR-H3 durch eine stärkere Immobilisierung der CDR-H3-Schleife begünstigen. Dem großen Entropieverlust, der durch die Immobilisierung einer flexiblen CDR-H3 entsteht, wirkt ein Entropiegewinn des Wassers, verursacht durch die Abschirmung der hydrophoben aromatischen Reste bei einer Wechselwirkung der CDR-H3 mit der CDR-L1, entgegen.

↓110

Abb. 7.9.: Die Aminosäure FL30 in der VL-Domäne ist Bestandteil eines Clusters gebildet von aromatischen Resten der CDR-H3 (rot) und CDR-L1 (blau). Das Peptid (grün) bindet außerhalb der konventionellen Bindungstasche.

Die treibende Kraft zur Immobilisierung der CDR-H3 könnte neben der Antigenbindung die Clusterbildung der aromatischen Reste in dieser Region sein, und sie wird wahrscheinlich durch die somatische Mutation IL30F begünstigt. Die Selektion einer längeren CDR-L1 und die somatische Mutation FL30 in dieser CDR könnten eine entscheidende Rolle in der Stabilisierung der sehr langen und flexiblen 9E10-CDR-H3 gespielt haben. Berichte von Ofek and Cardoso zeigen, dass aromatenreiche CDR-H3 der Antikörper 2F5 und 4E10 besser mit Membran-gebundenen viralen Epitopen interagieren können, indem sie zusätzlich mit den Membranlipiden interagieren (Ofek et al., 2004, Cardoso et al., 2005). Beim 9E10 begünstigen die zahlreichen Aromaten in der CDR-H3 die Wechselwirkungen mit der Stabilität gebenden CDR-L1. Diese Beobachtungen unterstreichen eine mehrfunktionale Rolle einer langen und hydrophoben CDR-H3.Der positive Einfluss der leichten Kette auf die Affinitätsreifung liegt unter anderem in der Bereitstellung einer unterstützenden Bindungsplattform für eine günstige Bindungskonformation der CDR-H3 durch die CDR-L1 und CDR-L3, wie mit den Einzelrückmutationen in der CDR-L1 (FL30I) und CDR-L3 (TL91S) gezeigt werden konnte.

Die Bedeutung der leichten Domäne für die Bindung wird zudem durch die Experimente von Schiweck et al. belegt, wonach die VH-Domäne ohne die VL-Domäne keine nachweisbareBindung an das myc-Peptid aufweist (Schiweck et al., 1997). Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse belegen die Rolle der 9E10-VL-Domäne als Bindungsplattform für die lange CDR-H3, die von Ramsland et al. (2001) für Antikkörper mit langen CDR-H3, wie z. B. bei den humanen Pot-, Mez- und dem murinen NC10.14-Antikörpern vermutet wurde. Bei diesen Antikörpern kommen die Interaktionen mit der VL-Domäne vorrangig über die CDR-L3 zustande. Die CDR-H3 des 9E10-Antikörpers bildet auch Kontakte mit der um vier Aminosäuren längeren CDR-L1 aus. Mit der 9E10-Einzelrückmutante FL30I konnte außerdem belegt werden, dass der Beitrag der CDR-L1 für die Affinität des Antikörpers während des Reifungsprozesses sogar größer ist als der der CDR-L3 (TL91S). Analog hierzu nutzen, wie in der Einleitung beschrieben, lange CDR-H3 in VHH-Domänen, wie z. B. der Lysozym-bindende cAb-Lys3-Antikörper, β-Stränge, die normalerweise an die VL-Domäne binden, als Bindungsplattform (Ramsland et al., 2001). Die Struktur der CDR-H3 solcher Antikörper ist auch weniger variabel (De Genst et al., 2005), was wiederum zeigt, dass die VL-Domäne einen großen Einfluss auf die Struktur einer langen CDR-H3 nehmen kann und auf diese Weise mit zur hohen strukturellen Variabilität von konventionellen Antikörpern beiträgt.

7.4.2 Einfluss der rückmutierten V-Domänen auf die Bindungseigenschaft

↓111

Eine komplettrückmutierte VH-Domäne im 9E10-Fab führt zu einem Anstieg im KD um das 400-fache auf 480 ± 20 nM (SPR) bei der Bindung an das immobilisierte c-myc(408-427)-Peptid, welches vor allem auf die 60-fache Abnahme im kon zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu ist der gestiegene KD (432 ± 2 nM) bei der Bindung an das selbe immobilisierte Peptid mit der Komplettrückmutation der VL-Domäne weniger durch die Änderungen im kon (10-fache Abnahme) bestimmt. Bei dem in der Literatur beschriebenen anti-Hapten-Antikörper 28B4 ist es ebenfalls die VH-Domäne, die durch ihre Rückmutation den kon am stärksten (540-fach, kon = 650 M-1 s-1) herabsenkt. Während der gereifte 28B4 mit einem kon von 3,5 x 105 M-1 s-1 das Hapten 3 nach einem Schloss-Schlüssel-Mechanismus bindet, werden bei der Bindung des Keimbahngen-kodierten 28B4-Antikörpers (kon = 430 M-1 s-1) signifikante Konformationsänderungen in der CDR-H3 und CDR-L1 beobachtet. Hierzu wurden die Kristallstrukturen des gereiften bzw. Keimbahngen-kodierten Antikörpers mit und ohne Hapten betrachtet (Yin et al., 2001). Analog hierzu könnte man ebenfalls auf stärkere Konformationsänderungen in der rückmutierten VH-Domäne des 9E10-Antikörpers während der Bindung an das Peptid schließen.

Die Rückmutationen in der VL-Domäne dominieren in ihrem Einfluss auf den koff-Wert. Während die rückmutierte leichte Kette im 9E10 bei der Bindung an das 20-mer Peptid den koff um das 30-fache beschleunigt, beschleunigt die rückmutierte schwere Kette im 9E10 diesen nur um das 7-fache. In der Arbeit von Jimenez et al. (2003) werden ebenfalls Einbußen im koff (7-fach) mit Rückmutationen in der VL-Domäne des Antikörpers 4-4-20 bei der Bindung an Fluorescein beschrieben. Mit Messungen der Proteindynamik des 4-4-20 wurde gezeigt, dass die somatischen Mutation in der VL-Domäne die Affinität durch Versteifung des Antikörper-Fluorescein-Komplexes beeinflussen, indem sie das Antigen stärker im Protein verankern und den Komplex dichter packen. Keines der somatisch mutierten Reste in der 9E10-VL-Domäne befindet sich im direkten Kontakt mit dem Peptid und lediglich zwei nicht mutierte Reste (YL49 und NL53) bilden direkte Kontakte zum Peptid aus, womit der bis zu 360-fache (KD = 432 ± 2 nM, SPR) bzw. 100-fache (KD = 760 ± 240 nM, ELISA) Affinitätsverlust mit der Rückmutation dieser Domäne bei der geringen Anzahl der direkten Kontakte zum Peptid erstaunlich ist. Von den Insgesamt 696 Å2 Interaktionsfläche des 9E10 mit dem Peptid trägt die VL-Domäne nur 91 Å2 (13 %) bei (N. Krauß) und liefert dennoch einen sehr hohen Beitrag zur Affinität. Die VL-Domäne bildet jedoch direkte Kontakte, insbesondere zu der CDR-H3, die 59 % der Interaktionsfläche mit dem Peptid stellt, mit ihrer CDR-1 und -3, die jeweils an keiner direkten Interaktion mit dem Peptid beteiligt sind, aus. Hier kann der Einfluss in der Stabilisierung einer günstigen Bindungskonformation der Antigen-bindungstasche liegen, von der das Peptid langsamer dissoziiert als von einer flexibleren Bindungstasche, wie es im Kapitel 7.4.1.3 für den Einfluss der Positionen FL30 und TL91 diskutiert wurde.

Die mit der ELISA- und SPR-Methode bestimmten KD-Werte der Bindung des 9E10-Fab mit der rückmutierten VL-Domäne LKeimbahn/H9E10 an das 20-mer Peptid weisen keine signifikanten Unterschiede (Faktor 1,8) auf. Für das 9E10-Fab mit der rückmutierten VH-Domäne werden dagegen große Unterschiede zwischen den gemessenen KD-Werten aus den SPR- (480 ± 20 nM) und ELISA-Messungen (5,3 ± 3,3 µM) beobachtet. Die 11-fache Abweichung der Werte ist nicht so stark wie bei der im Kapitel 7.4.3. diskutierten kompletten 9E10-Rückmutante (500-fach), sie könnte aber auf ähnliche Ursachen zurückgeführt werden und wird später in diesem Kapitel erörtert. Die aus den ELISA-Experimenten stammenden KD-Werte der Bindung von H9E10/LKeimbahn (760 nM) bzw. HKeimbahn/L9E10 (5,3 µM) an das 20-mer Peptid repräsentieren stärker die Beiträge der einzelnen Domänen zur Affinitätsreifung, wie sie für Rückmutanten von anti-Hapten-Antikörpern in der Literatur publizierten werden. So haben die Rückmutanten des anti-Hapten-Antikörpers 28B4 LKeimbahn/H28B4 und L28B4/HKeimbahn einen KD von 82 nM bzw. 23µM bei der Bindung an das Hapten (Yin et al., 2001). Der gereifte 28B4-Antikörper bindet dagegen mit einem KD von 37 nM sein Antigen. Die gemischten Mutanten LKeimbahn/H7G12 und L7G12/HKeimbahn des Ferrochelatase-Antikörpers 7G12 binden mit einem KD von 203 nM bzw. 1,02 µM an N-Methylmesoporphyrin (Yin et al., 2003). Auch hier bindet der gereifte Antikörper 7G12 im nM-Bereich das Antigen (KD = 20,7 nM). Die größeren Affinitätseinbußen entstehen hier durch Rückmutationen in den VH-Domänen. Auch die Reifung der VL-Domänen spielt eine wesentliche Rolle in der Affinitätsreifung der Antikörper, auch wenn sie nicht den größten Teil zur Affinitätsreifung beiträgt. Ebenso hat es sich beim 9E10-Fab gezeigt, dass die VH-Domäne während des Reifungsprozesses die Affinität stärker beeinflusst, was allerdings deutlicher aus den ELISA-, und nicht den SPR-Messungen hervorgeht. Die ermittelten KD-Werte mit der SPR-Methode weisen kaum Affinitätsunterschiede (Faktor 1,1) zwischen der rückmutierten VH- bzw. VL-Domäne im 9E10 bei der Bindung des Fabs an das 20-mer Peptid auf. Mögliche Ursachen hierfür werden im Kapitel 7.4.3. am Beispiel der 9E10-Rückmutante diskutiert.

↓112

Die gereifte 9E10-VH-Domäne zeichnet sich dadurch aus, dass von den 14 somatischen Mutationen nur 3 Aminosäurereste im direkten Kontakt zum myc-tag-Peptid stehen. Von den einzeln untersuchten rückmutierten Positionen, die das myc-tag-Peptid direkt kontaktieren (HH31 und RH53), ist im Falle der Rückmutation RH53G keine signifikante Änderung in der freien Bindungsenergie bei der Bindung des Antikörpers an das 20-mer Peptid gemessen wurden. Für die 9E10-Rückmutante HH31S wurden keine Bindungsexperimente mit dem 20-mer Peptid durchgeführt, da hier aufgrund von bereits geringen Energieverlusten bei der Bindung an das myc-tag-Peptid auch keine messbaren Änderungen zu erwarten waren. Der Energieverlust der rückmutierten VH-Domäne im 9E10 bei der Bindung an das lösliche Peptid im ELISA beträgt dagegen 16,5 kJ/mol. Der Gewinn für die freie Standardenergie der Bindung während der Reifung der VH-Domäne kann nicht allein auf zusätzliche direkte Kontakte des HH31 und RH53 zum Peptid zurückgeführt werden. Wie bereits erwähnt, bildet auch die somatisch mutierte Aminosäure TH100d einen direkten Kontakt zum Peptid. Ebenso könnte die somatisch mutierte Aminosäure NH100c nach dem in dieser Arbeit vorgestellten Modell einen Kontakt zum 20-mer-Peptid bilden. Um dies zu belegen fehlen allerdings experimentelle Daten. Da hier keine Effekte der einzelrückmutierten Reste TH100d und NH100c auf die Bindung zum Peptid untersucht wurden, kann auch keine klare Aussage über einen Beitrag zur freien Standardenergie der Bindung gemacht werden, der allein durch zusätzliche Kontakte des Antikörpers zum Peptid zustande kommt. Die Einzelrückmutationen SH100hY im 9E10-Fab hat einen starken Einfluss auf die Affinität. Wird im 9E10 der Rest SH100h nach Y rückmutiert, kommt es zum größten Verlust für die freie Standardenergie (5,3 kJ/mol) bei der Bindung an das lösliche 20-mer Peptid. Demzufolge könnte die fehlende Differenz von ca. 11 kJ/mol auf den Einfluss weiterer somatisch mutierter Reste auf die Bindungsstärke des Antikörpers vor allem aber auch auf kooperative Effekte zwischen den somatisch mutierten Aminosäuren während der Affinitätsreifung des 9E10-Antikörpers, wie ebenfalls für den 48G7-Antikörper beschrieben wurde (Yang et al., 1999), hindeuten. Zahnd et al. (2004) berichten über ein anti-Peptid-scFv, das durch die Ribosomen-Display-Technologie generiert wurde und mit einem KD von 5 pM an sein Antigen bindet. Die 500-fache Affinitätszunahme während der Reifung des H6-scFv basiert auf wenigen Mutationen, die keinen direkten Kontakt zum Peptid ausbilden. Diese Ergebnisse beweisen, dass die Affinitätsreifung des hochaffinen H6 durch Modulierung bereits existierender Interaktionen über Änderungen in den FR-Regionen und nicht durch zusätzliche neue Kontakte erreicht wird. Für die Charakterisierung der 9E10-Rückmutanten konnte, wenn auch nur ein geringer, Beitrag für die im direkten Kontakt zum Peptid stehenden Aminosäuren HH31 und RH53 auf die Affinität durch Bindungsexperimente mit dem schwächer affinen myc-tag-Peptid nachgewiesen werden.

Infolge der Rückmutation der leichten Kette im 9E10 kommt es im ΔG° zu einem Verslust von 11,6 kJ/mol (ELISA) bei der Bindung an das lösliche 20-mer Peptid, wovon der Verlust von 4,2 kJ/mol durch die Einzelrückmutation FL30I verursacht wird. Änderungen in der freien Bindungsenergie für die Bindung des Fab 9E10 TL91S an das 20-mer Peptid wurden nicht bestimmt, da hier aufgrund des geringen Einflusses dieser Rückmutante auf die Affinität auch keine Änderungen zum 20-mer Peptid zu erwarten wären. Es bleibt also eine Differenz von ca. 7 kJ/mol übrig. Da auch in der VL-Domäne nicht alle somatisch mutierten Aminosäuren einzeln als Rückmutanten charakterisiert wurden, bleibt auch hier die Frage nach dem Beitrag dieser Rückmutationen zur freien Standardenergie der Bindung und nach kooperativen Effekten zwischen den mutierten Resten offen. Speziell die zwei somatisch mutierten Positionen ohne direkten Kontakt zum Peptid IL51 und RL54 in der CDR-L2 könnten als Rückmutationen einen Einfluss auf die Bindungsenergie nehmen.

Addiert man die relativ zum 9E10 gemessenen Änderungen im ΔG° aus den ELISA-Experimenten der rückmutierten V-Domänen im 9E10 während der Bindung an das lösliche 20-mer Peptid von 11,7 und 16,5 kJ/mol (ELISA), kommt man auf insgesamt 28,2 kJ/mol. Dieser Wert entspricht nicht genau den 31 kJ/mol an gemessener verlorener Bindungsenergie, die mit der kompletten 9E10-Rückmutation erreicht wird. Der Unterschied könnte mit der Fehlerbreite der KD-Bestimmung bei der Bindung der 9E10-Rückmutante an das 20-mer Peptid im ELISA begründet werden. Andererseits könnte diese Differenz auch auf einen kooperativen Effekt zwischen den beiden Domänen während der Reifung hindeuten.

↓113

Bei der Bindung der 9E10-Rückmutanten an das myc-Peptid finden nur sehr geringfügige Selektivitätsänderungen zu den Schlüsselpositionen LISEXXL im Peptid statt. Eine hiervon ist die Toleranz gegenüber dem Austausch von IP414 gegen Q im 20-mer Peptid, die mit der kompletten Rückmutation der VH-Domäne im 9E10 hervorgerufen wird. Der Rest IP414 im Wildtyppeptid zeigt in eine hydrophobe Tasche des Antikörpers (Abb. 7.10.). Die Methylgruppe des Restes TH100d in der VH-Domäne ist Teil dieser Tasche. Eine Rückmutation von TH100d auf das im Keimbahngen-kodierte S könnte die Toleranz des polaren Q durch die nun fehlende Methylgruppe erklären. Die Methylgruppe des Antikörperrestes TH100d befindet sich in direkter räumlicher Nachbarschaft zum Rest IP414 im Peptid (Abb. 7.10.). Diese Selektivitätsänderung könnte direkt auf die Rückmutation TH100dS zurückgehen.

Abb. 7.10. : Bindungstasche des Peptidschlüsselrestes IP414, die unter anderem vom 9E10-Rest TH100d in der CDR-H3 und vom Peptid (grün) ausgekleidet wird. Beide Reste sind 3,84 Å voneinander entfernt.

Die Kreuzreaktivität von LKeimbahn/H9E10-Fab mit dem an der Schlüsselposition LP419 zu S substituierten 20-mer-Peptid wäre möglicherweise ein Hinweis auf eine zunehmende Flexibilität der Seitenrestbindungstasche (Abb. 7.5.) für den Rest LP419. Die Aminosäure LP419 befindet sich, nach den kristallographischen Daten, in keinem direkten Kontakt mit der VL-Domäne. Dennoch kann die Selektivitätsänderung zu dieser Schlüsselposition bei der Bindung an das Peptid auf einen indirekten Einfluss der VL-Domäne zurückgeführt werden. Ähnliches wird auch bei der Bindung des Fab L9E10/HKeimbahn an das myc-tag-Peptid beobachtet. Auch hier ändert sich die Selektivität zum Rest LP419 im myc-tag-Peptid. Auch die Substitution des Restes LP419 gegen H bewirkt eine schwache Bindung des Fab L9E10/HKeimbahn an das substituierte myc-tag-Peptid, die nur bei diesem Fab-Konstrukt beobachtet wurde. Ein Grund hierfür könnte wiederum die zunehmende Flexibilität in der Bindungstasche des 9E10 sein. Die Bindung des Fab L9E10/HKeimbahn an das gegen HP419 substituierte 20-mer-Peptid konnte dagegen nicht nachgewiesen werden.

↓114

Mit der rückmutierten VH-Domäne im Fab L9E10/HKeimbahn werden im Vergleich zu der rückmutierten VL-Domäne im Fab LKeimbahn/H9E10 deutlich stärkere Unterschiede in der Bindungsspezifität des Antikörpers zum myc-Peptid beobachtet. Dies betrifft insbesondere die Erkennung des Restes EP417 im Peptid. Die Substitutionsanalysen am myc-tag-Peptid zeigen die Selektivitätsänderung des Antikörpers, die mit der Rückmutation der jeweiligen V-Domäne korrelieren. Ein Peptid mit den Substituenten D, G, L, M, S, T oder V an der Position 417 wird im Gegensatz zum Fab der VL-Rückmutante von der VH-Rückmutante gebunden. Die Toleranz gegenüber den Resten G, L, M, S, T und V sowie die Diskriminierung von Y an Position 417 im Peptid ist auf die bereits diskutierten 9E10-Einzelrückmutationen HH31S und RH53G zurückzuführen. Die Toleranz des Antikörpers L9E10/HKeimbahn gegenüber dem Rest D bei der Bindung an das Peptid könnte durch einen kombinatorischen Effekt der multiplen Rückmutationen in der 9E10-VH-Domäne verursacht worden sein. Bei der Bindung an das höher affine 20-mer Peptid sind nur noch Selektivitätsunterschiede zwischen den einzelrückmutierten Domänen für die Reste I, K, L und W an Position 417 zu erkennen. Damit war es anhand der unterschiedlichen Affinitäten zu den Peptiden gelungen die feinen Unterschiede in der Selektivität besser zu definieren.

Weitere weniger ausgeprägte Unterschiede in der Bindungsspezifität zwischen den Fabs L9E10/HKeimbahn und LKei m bahn/H9E10 äußern sich bei der Bindung an das 11-mer myc-tag-Peptid in der Erkennung der Position DP418. Ein einfachsubstituiertes myc-tag-Peptid mit den Austauschen H, K, L oder N an der Position 418 wird von 9E10 mit der rückmutierten VH-Domäne besser gebunden als von 9E10 mit der rückmutierten VL-Domäne. Aufgrund der polyspezifischen Reaktion des anti-Maus-Nachweisantikörpers mit den durch F, I, L, T, V oder Y substituierten Peptide an der Position 418 kann die Erkennung des Restes DP418 im 20-mer Peptid nicht weiter diskutiert werden. Signifikante Unterschiede in der Erkennung des Restes DP418 im höher affinen 20-mer Peptid sind nicht mehr zu erkennen.

Die Rückmutationen in der VH-Domäne hat demnach die Bindungsspezifität des Antikörpers durch eine Feinmodulation der Erkennung einzelner Peptidreste durch direkt im Kontakt zum Peptid stehenden Antikörperreste, wie HH31, RH53, TH100c herabgesetzt.

7.4.3 Bindungseigenschaft der 9E10-Keimbahngenrückmutante

↓115

Die Bindungsexperimente mit dem Keimbahn-kodierten 9E10 an das c-myc(408-427)-Peptid im kompetitiven ELISA und in der SPR an der Biacore lieferten reproduzierbare Ergebnisse. In den kompetitiven ELISA-Experimenten ist eine vollständige Kompetition der Bindung mit freiem Peptid nicht möglich. Der abgeschätzte KD von ca. 2 mM ist sehr hoch, aber für biochemische Vorgänge liegt er noch im relevanten Bereich. In den Kontrollmessungen mit dem randomisierten 20-mer c-myc-Peptid setzt die Kompetition erst bei 8 mM Peptid ein. Bei diesen hohen Peptidkonzentrationen ist die Kompetition auf unspezifische Bindungen und Auswascheffekte zurückzuführen. Beim nativen c-myc-Peptid setzt sie bereits bei 0,3 mM ein. Es dürfte sich somit um eine reale, wenn auch sehr schwache Bindung der 9E10-Rückmutante an das c-myc(408-427)-Peptid handeln. Der mit der SPR-Methode ermittelte, deutlich abweichende KD (3,93 ± 0,04 µM) ergab sich aus dem Verhältnis koff/kon. Dabei wurde der Berechnung der kinetischen Konstanten kon und koff wieder das einfache Modell einer Ein-Schritt-Bindung zugrunde gelegt. Die KD-Werte, die mit beiden Meßmethoden ermittelt wurden, weichen um einen Faktor von ca. 500 voneinander ab. Auch die errechneten Differenzen im ΔG° relativ zum 9E10 für die beiden einzelrückmutierten V-Domänen von 14,6 kJ/mol für LKei m bahn und 14,8 kJ/mol für HKeimbahn sind in der Summe höher als der ΔΔΔG° von 20 kJ/mol für die 9E10-Rückmutante. Die sehr große Abweichung im KD-Wert aus den ELISA- und SPR-Messungen könnte den folgenden Rückschluss zulassen: Das in der SPR-Messung über den N-Terminus immobilisierte 20-mer myc-Peptid wird von der 9E10-Rückmutante besser gebunden als das lösliche Peptid. Veränderungen am N-Terminus des 20-mer Peptides, verursacht z. B. durch den Austausch EP409F im c-myc(408(E409F)427)-Peptid, durch eine N-terminale Markierung mit dem Fluorophor Abz (Schiweck et al., 1997) oder durch eine Kürzung des N-Terminus um die Aminosäuren AP408 und EP409 haben immer zu einem Affinitätsanstieg geführt. Das Fab L9E10/HKeimbahn zeigt gleichfalls eine erhöhte Affinität zum immobilisierten 20-mer Peptid in den SPR-Analysen. Unterschiede in der Präsentation des Peptides zwischen der immobilisierten Form auf der festen Phase und der löslichen Form sowie ein Einfluss des für die Thiolkopplung verwendeten N-terminalen Cysteins auf die Affinität können ebenfalls die beobachteten Abweichungen erklären. Bei den im ELISA mit einer höheren Affinität bindenden Fabs LKeimbahn/H9E10 und 9E10 konnten dagegen keine signifikanten Unterschiede zu den KD-Werten aus den SPR-Messungen festgestellt werden. Nicht auszuschließen wäre auch die folgende Ursache: Der beschrieben KD der Bindung der 9E10-Rückmutante an das 20-mer myc-Peptid mit der SPR-Methode ergab sich aus dem Verhältnis koff/kon und wurde nicht aus Gleichgewichtstitrationen ermittelt. Zur Berechnung des KD wurde das Modell des Ein-Schritt-Bindungsmechanismus zugrunde gelegt. Mit dem Modell könnte jedoch die Bindung des 20-mer Peptides an die 9E10-Keimbahnrückmutante nicht ausreichend beschreiben worden sein. Demgegenüber steht jedoch die gute Übereinstimmung der experimentellen Daten mit dem Ein-Schritt-Bindungsmodell. Ein komplexerer Mechanismus, als angenommen, könnte das Bindungsverhalten der 9E10-Rückmutante deutlicher widerspiegeln und auf größere Konformationsänderungen in der Bindungstasche der Keimbahnrückmutante hindeuten. Solche mehrstufigen Bindungsmechanismen wurden z. B. von Gakamsky et al. (2004) für einen MHC-Peptid-Komplex-bindenden T-Zellrezeptor (sT1), der auch eine langsame Assoziationsgeschwindigkeit im Bereich von 103 M-1s-1 und in kristallographischen Studien merkliche Konformationsänderungen bei der Bindung aufweist, vorgeschlagen.

Rückmutationen auf die Keimbahngensequenz im 9E10 bewirken einen ca. 3300-fach zunehmenden KD zum immobilisierten c-myc(408-427)-Peptid, verbunden mit einer um den Faktor 90 langsamer werdenden Assoziationsgeschwindigkeit und einer 40-fach schnelleren Dissoziationsgeschwindigkeit der Komplexe. In der Literatur beschriebene Keimbahngen-kodierte Antikörper haben ähnliche KD-Werte wie der Keimbahngen-kodierte 9E10. Der ungereifte anti-Hapten-Antikörper N1G9 hat einen KD = 5 µM (SPR) und erreicht mit der Affinitätsreifung einen KD von 200 nM zum immobilisierten NP2-HEL (Sagawa et al., 2003). In der Literatur findet man auch Bindungskonstanten (SPR) für den 28B4, einem katalytisch aktiven anti-Hapten-Antikörper, mit KD = 37 nM. Für das dazugehörige Keimbahngen-kodierte Fab liegt der KD bei 25µM (Yin et al., 2001). Das in der selben Arbeitsgruppe beschriebene 7G17-Fab bindet mit einem KD von 20,7 nM N-Methylmesoporphyrin, das Keimbahn-kodiertes Fab bindet dagegen mit einem KD von 1,96 µM an das Antigen (Yin et al., 2003). Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante der Reaktion zwischen dem Fab des anti-JWJ1(Hapten)-Antikörper 48G7 und dem Hapten beträgt 16 ± 2 nM (SPR). Wird der Antikörper auf seine Keimbahngensequenz rückmutiert, steigt der KD auf 46 ± 11 µM (Yang and Schultz 1999). Bei anti-Peptid-Antikörpern gegen das 38-mer Peptid PS1CT3 wurden KD-Werte (SPR) von 0,4 bis 30,3 µM für Antikörper aus der primären Immunantwort und Werte von 100 bis 700 nM für Antikörper aus der sekundären Immunantwort mit dem immobilisierten Peptid gemessen (Manivel et al., 2000). Die mit der SPR-Methode gemessenen Unterschiede zwischen dem 9E10-Fab und seiner kompletten Rückmutante sind vergleichbar mit den Daten für die Reifung anderer Antikörper aus der Literatur.

Rückmutationen im 9E10 führen zu einer Spezifitätsänderung des Antikörpers. Mit der vollständigen Rückmutation des 9E10 verringert sich die selektive Erkennung des Restes EP416 im humanen 18-mer c-myc-Peptid durch den Antikörper. Neben dem E werden nun auch die Reste F, I und L an der Position 416 im 18-mer-Peptid toleriert. Auch eine sehr schwache Bindung an das 18-mer mit den Aromaten W und Y an dieser Position kann nachgewiesen werden. Die Erkennung von Q an der Position 416 im 18-mer ist dagegen nicht mehr nachweisbar. Bemerkenswerterweise ist diese veränderte Selektivität der 9E10-Rückmutante bei der Bindung an das substituierte c-myc(408(E409F)-427)-Peptid nicht zu erkennen. In der Kristallstruktur des 9E10 im Komplex mit dem Peptid befindet sich der Peptidrest EP416 in einer engen Bindungstasche, die von der CDR-H2 und -H3 ausgebildet wird (Abb. 7.12.).

↓116

Abb. 7.12. :Bindungstasche des Peptidschlüsselrestes EP416, die unter anderem von den CDR-H3-Resten EH97 und YH100f sowie von den CDR-H2-Resten GH52 und SH52a ausgekleidet wird. Die Abstände zwischen den Atomen sind in Å dargestellt. Vom 9E10 ist die Oberfläche zusätzlich gezeigt.

Die zunehmende Kreuzreaktivität der 9E10-Rückmutante mit den an der Position 416 substituierten 18-mer-Peptiden könnte auf eine zunehmende Flexibilität oder auf Konformationsänderungen in dieser schmalen Seitenrestbindungstasche hindeuten, da nun Peptide mit großen Aminosäuren (F, W und Y) und verzweigten Aminosäuren (I und L) stärker gebunden werden können. Da diese Beobachtung nur bei der kompletten Rückmutante des 9E10 und nicht bei den Einzelrückmutanten gemacht werden konnte, könnte sie ein Hinweis auf Kooperationseffekte zwischen den somatisch mutierten Resten sein.

Keine Änderungen konnten hingegen in der Erkennung des Schlüsselrestes LP413, das mit einer sehr hohen Selektivität erkannt wird, festgestellt werden. Die Seitenrestbindungstasche des LP413 wird von der VH- und VL-Domäne gebildet. Dies könnte darauf hindeuten, dass es während der Reifung zu keinen Änderungen des Winkels zwischen den beiden V-Domänen kommt, die zu einer Änderung der Seitenrestbindungstasche des LP413 führen würden.

↓117

Eine große Anzahl substituierter 20-mer myc-Peptide, die in den Substitutionsanalysen mit einer deutlich höheren Affinität als der Wildtyp gebunden werden, weisen vermehrt R, F, I, L, W und Y als Substituenten auf. Studien von Lo Conte et al. zur Zusammensetzung der Aminosäuren in der Antikörper-Antigen Interaktionsfläche (Lo Conte et al., 1998) zeigen einen signifikant hohen Anteil an aromatischen Resten, wie z. B. Y und W. Geladene Reste wie D, E und K, jedoch nicht R, treten seltener auf (Sundberg und Mariuzza, 2002). Die Bevorzugung solcher Reste ist auf die Fähigkeit dieser Reste, eine Vielzahl günstiger Wechselwirkungen einzugehen, zurückzuführen. So kann zum Beispiel R hydrophobe Kontakte, Wasserstoff- und Salzbrücken ausbilden.

Ein entscheidendes Kriterium für die spezifische Bindung des gereiften 9E10-Fab an das myc-Peptid ist die Anzahl der Schlüsselpositionen im Peptid. Die Schlüsselpositionen LISEXXL werden vom Keimbahngen-kodierten 9E10 ebenfalls größtenteils sehr selektiv erkannt. Diese Selektivität ist bereits durch die Keimbahngensequenz des 9E10-Antikörpers und durch die Eigenschaft des myc-Peptides, im Komplex eine α-Helix auszubilden, vorgegeben. Mit zunehmender Affinität des 9E10 zum myc-Peptid werden durch die hohe Gesamtaffinität neben den Schlüsselresten auch solche Reste toleriert, die dem Originalrest strukturell oder chemisch ähnlich sind. Die Kreuzreaktivität des 9E10-Fab mit dem murinen c-myc(K417E)-Peptid ist auf die hohe Gesamtaffinität des 9E10 und die Toleranz der Mutation der Schlüsselposition IP414 gegen T zurückzuführen. Threonin wird aufgrund seiner Ähnlichkeit zu I toleriert. Dieser Austausch ist dafür verantwortlich, dass das murine Peptid, wenn auch schwächer, vom 9E10 in den Peptidspot-Analysen gebunden wird. Diese Kreuzreaktivität des 9E10 deckt sich mit der von Siegel et al. (1998) beobachteten Bindung des 9E10 an das murine c-Myc-Protein in Immunoblots und in murinen Zellen. Das 9E10-Fab bindet das aviane c-myc- und das virale v-myc-Peptid nicht. Diese Beobachtung stimmt mit der Aussage von Evan et al. (1985) überein, wonach das 9E10-IgG keine Bindung an das aviane und virale Myc-Protein aufwies. Die komplette 9E10-Rückmutante bindet hingegen das aviane 20-mer c-myc-Peptid trotz zweier für die Gesamtaffinität der Bindung ungünstigen Austausche in den Schlüsselpositionen. Auch das Fab L9E10/HKeimbahn weist noch eine sehr schwache Kreuzreaktivität mit dem avianen c-myc-Peptid aufweist, was wiederum belegt, dass die VH-Domäne den größeren Einfluss auf die Spezifität des 9E10 hat. Da die Kreuzreaktivität des 9E10-Fab mit dem avianen c-myc-Peptid trotz der sehr hohen Gesamtaffinität des Fabs nicht nachzuweisen war, liegt die Vermutung nahe, dass es während der Reifung des Antikörpers zu Konformationsänderungen im Paratop gekommen ist.

Substitutionsanalysen am 20-mer Peptid mit dem N-terminalen Austausch EP409F zeigen eine veränderte Bindungsspezifität des ungereiften 9E10-Fab-Fragmentes, was auf eine höhere strukturelle Variabilität des ungereiften Paratops schließt. Der ungereifte 9E10 passt sich an. Auch das aviane 20-mer c-myc-Peptid wird zwar von LKeimbahn/HKeimbahn-Fab jedoch nicht vom 9E10-Fab gebunden. Dennoch wurde keine deutliche Reaktion des LKeimbahn/HKeimbahn-Fab mit dem N-terminal substituierten avianen 20-mer c-myc(408(E409F)-427)-Peptid gemessen. Das heißt, dass mit der höheren Affinität von LKeimbahn/HKeimbahn-Fab zum substituierten 20-mer c-myc(408(E409F)-427)-Peptid auch die Kreuzreaktivität mit dem avianen c-myc(E409F)-Peptid abnimmt. Der zusätzliche Kontakt von FP409 am N-Terminus der Peptide erfolgt zu aromatischen Resten in der CDR-H3, die im übrigen Bestandteil eines Aromtenklusters, gebildet von der CDR-H3 und -L1, sind (siehe auch Abb. 7.9.). Damit wären die beobachteten Spezifitätsänderungen auf eine Immobilisierung der flexiblen CDR-H3 zurückzuführen. Es könnten demzufolge mehrere Bindungsmodi im Keimbahn-kodierten 9E10-Antikörper existieren. Diese Erkenntnis stimmt gut mit der weit verbreiteten Annahme überein, dass die Bindungsstellen der Keimbahnantikörper in der Lage sind, viele Konformationen anzunehmen und eine Vielzahl von Epitopen nach einem induced fit-Mechanismus zu binden. Unlängst zeigten Sethi et al. (2006) am Keimbahn-kodierten Antikörper 36-65 die Bindung dreier unterschiedlicher Peptide in verschiedenen Bindungsmodi jedoch, innerhalb einer gleichen Paratoptopologie. Der Vergleich von vier Kristallstrukturen des ungebundenen Fab hat dagegen eine Vielzahl von Konformationen der CDRs ergeben.

7.5 Fazit der Affinitätsreifung von 9E10

↓118

Durch die Kombination der Daten aus der 9E10-myc-tag-Peptid-Kristallstruktur mit der biochemischen Charakterisierung der Bindungseigenschaft der Keimbahngenrückmutanten des 9E10 zu c-myc-Peptiden unterschiedlicher Länge und somit Affinität gelang es einen Einblick in die Affinitätsreifung des 9E10-Antikörpers zu bekommen.

Mit der Reifung des 9E10-Antikörpers verringert sich der KD der Bindung an das lösliche 20-mer Peptid (ELISA) um das 30000-fache, während der KD für die Bindung an das immobilisierte 20-mer-Peptid (SPR) nur um das 3300-fache abnimmt. Dabei sind es sowohl Änderungen in kon als auch in koff, die zu einer Affinitätszunahme des 9E10 zum immobilisierten 20-mer Peptid während der Affinitätsreifung des Antikörpers geführt haben. Die Assoziations-geschwindigkeit stieg um das ca. 90-fache an, während die Dissoziationsgeschwindigkeit um das ca. 40-fache abnahm. Die Affinitätsreifung hat demnach eine schnellere Assoziation des Antikörpers mit dem Peptid und einen langsameren Zerfall des gebildeten Komplexes zufolge. Hierbei sind es vor allem die somatischen Mutationen in der VH-Domäne, die für die schnellere Kinetik der Assoziation selektiert wurden. Die somatischen Mutationen in der VL-Domäne beeinflussen hingegen stärker den Dissoziationsprozess des Komplexes. Solche Änderungen in den kinetischen Konstanten könnten auf eine Umorganisation der Bindungstasche während der Reifung hindeuten. Beim vergleichsweise 48G7-Antikörper korrelieren die Konformationsänderungen in der Bindungstasche mit Änderungen in der Dissoziationsrate koff, die primär zum Affinitätsgewinn während der Reifung führte (Wedemayer et al., 1997).

Die Affinitätszunahme des 9E10 zum 20-mer myc-Peptid ist nicht vorrangig durch die Ausbildung zusätzlicher Kontakte zum Peptid charakterisiert. Die zusätzlichen Kontakte zum myc-Peptid, die mit den hier analysierten Resten HH31 und RH53 (Abb. 7.13.) generiert werden, haben nur einen geringen Einfluss auf die Gesamtaffinität. Mit diesen Resten als auch mit dem somatisch mutierten Rest TH100d werden jedoch Seitenreste im Paratop eingeführt, die mit der Bindung von Resten in den Nicht-Antigenen interagieren und somit zu einer feinen Modulierung der Spezifität des 9E10 führen.

↓119

Von den hier analysierten somatischen Mutationen sind die für die Gesamtaffinität des Antikörpers entscheidenden Reste solche, die die Konformation der myc-Peptid bindenden CDRs direkt oder indirekt beeinflussen. Eine der entscheidenden Positionen ist die nahe der CDR-H3-Basis liegende Aminosäure SH100h, die 6,54 Å vom Peptid entfernt ist. Die Konformation der langen, flexiblen und aromatenreichen CDR-H3 spielt eine bedeutende Rolle im Affinitätsreifungsprozess des 9E10. Hierbei scheinen die CDR-L3 und vor allem die CDR-L1 in der VL-Domäne die Funktion einer Plattform für eine günstige Bindungs-konformation der langen und herausragenden CDR-H3 zu übernehmen (Abb. 7.13.), wobei der CDR-L1 durch ihre verlängerte Struktur und hydrophoben Reste (drei Aromaten) eine neue bedeutende Rolle zugekommen ist.

Abb. 7.13. : Seitenansicht (A.) und Draufsicht (B.) auf die Bindungsregion des 9E10-Antikörpers mit den charakterisierten rückmutierten Resten (rot). Die rückmutierten Einzelpositionen SH100h , FL30 , TL91 sowie GH52 haben einen Einfluss auf die Affinität, wobei SH100h als Bestandteil der CDR-H3 und FL30 in der CDR-L1 den größten Effekt haben. Die rückmutierten Einzelpositionen HH31 und RH53 verfeinern die selektive Erkennung der Peptidposition EP417. Der neutrale Rest HH58 ist in Gelb und die nicht charakterisierten Aminosäuren in Schwarz dargestellt. Von der VH-Domäne ist die Oberfläche und von der VL-Domäne das Peptidrückgrat gezeigt. Das Peptid (410-423) ist in Blau dargestellt.

Diese Annahme stützt sich auf den beschriebenen Affinitätsverlust des 9E10 bei der Bindung an die myc-Peptide mit den Rückmutationen der Reste FL30 in der CDR-L1 und TL91 in der CDR-L3. Die Konformation oder Flexibilität der myc-Peptid kontaktierenden CDR-H2 wird direkt von der in derselben CDR liegenden Aminosäure GH52 bestimmt. Die CDR-Konformation beeinflussenden Reste SH100h, FL30 (indirekt) und GH52 bestimmen die Affinität des Antikörpers, wobei die CDR-H3 und die mit ihr im Kontakt stehende CDR-L1 den größten Einfluss haben. Das könnte ein Hinweis auf konformationelle Änderungen in der Bindungstasche während des Reifungsprozesses sein, die zu einer für die Bindung günstigen Umorganisierung und Stabilisierung des Paratops führen könnten. Die Affinitätsreifung des 9E10 hat gezeigt, dass somatische Mutationen vorrangig eine optimale Bindungskonformation aufbauen und fixieren. Diese Beobachtung deckt sich mit der in der Literatur beschriebenen Affinitätsreifung des Ferrochelatase-Antikörpers 7G12 (Yin et al., 2003) und scheint ein gängiges Prinzip in der Antikörperaffinitätsreifung zu sein.

↓120

Wie die Substitutionsanalysen belegen, bindet bereits das ungereifte 9E10-Fab das myc-Peptid in einer ähnlichen Art und Weise wie das gereifte Fab. Mit der Affinitätsreifung des Antikörpers wird dieser Bindungsmodus optimiert (Schloss-Schlüssel-Prinzip). Die Schlüsselpositionen LISEXXL im myc-Ppetid werden während des Antikörperreifungs-prozesses größtenteils mit einer unveränderten Selektivität vom Antikörper erkannt. Eine feine Optimierung der selektiven Erkennung der Schlüsselpositionen im Peptid durch 9E10 erfolgt vorrangig durch Reste, die nicht direkt an der Erkennung der Schlüsselpositionen im Peptid beteiligt sind. Die für die Bindungsenergie wichtigen Reste, die z. B. die Seitenkettenbindungstaschen für die Schlüsselpositionen im Peptid ausbilden, unterliegen kaum somatischen Mutationen. Eine Ausnahme bildet der Rest SH100d der zu T mutiert wurde. Diese Reste sind für eine Bindung bereits optimiert. Die Seitenkettenbindungstaschen unterliegen im Laufe des 9E10-Reifungsprozesses lediglich einer Feinmodellierung ihrer Bindungsgeometrie. Die Peripherie ist dagegen mehr für stärkere Optimierungen geeignet, da sie toleranter gegenüber Mutationen ist. Die bereits in den Keimbahngenen des 9E10 kodierten Aminosäuren, die die Seitenrestbindungstaschen speziell für die Schlüsselreste LP413 und EP416 im Peptid ausbilden, könnten ihre Funktion darin haben, das Peptid in eine Bindungskonformation zu zwingen, während durch somatische Mutationen die gebundene Konformation des Peptides stabilisiert wird.

Von den zwanzig somatischen Mutationen wurden sieben hot spot-Positionen als einzelne Rückmutationen charakterisiert (Abb. 7.13.). Der Einfluss der weiteren dreizehn Austausche als Einzelmutationen ist im Detail nicht bekannt. In einer einfachen Annahme kann jede somatische Mutation zum Affinitätsgewinn führen. Es können aber auch neutrale Mutationen, wie am Beispiel der 9E10 Rückmutation HH58Y gezeigt werden konnte, auftreten. Das konnte auch am Beispiel des 48G7-Antikörpers gegen das Phosphonathapten JWJ1 gezeigt werden (Yang und Schultz, 1999). Über die Hälfte der insgesamt neun Mutationen, die als Rückmutationen und somatische Mutationen von Yang und Schultz beschrieben wurden, sind neutral. Auch kann der Effekt einer einzelnen Mutation in Kombination mit anderen Mutationen variieren. Am 48G7-Antikörper sind, wie bereits berichtet, energetische Kooperationen zwischen den Mutationen für die 30000-fache Zunahme der Affinität während der Reifung der Antikörpers verantwortlich (Yang und Schultz, 1999). Kooperationseffekte zwischen den Rückmutationen im 9E10 müssen die geringfügig veränderte Selektivität zum EP416-Rest bewirkt haben.

Diese Arbeit konzentrierte sich auf Mutationen in den CDRs. In der Literatur sind viele Bespiele für Antikörper mit nanomolaren bis pikomolaren Affinitäten beschrieben, die auch viele Mutationen in den FRs aufweisen. Die FR-Mutationen scheinen auch zur Affinitätsreifung beizutragen und sollten in solchen Affinitätsreifungsstudien nicht außer Acht gelassen werden.

↓121

Im ungereiften 9E10 scheinen mehr schwache Bindungsmodi zu existieren, die über Konformationsänderungen oder einer Einschränkung der Flexibilität der Bindungsregion modifiziert werden. Hier unterscheidet sich die Affinitätsreifung des 9E10-Antikörpers nicht wesentlich von der in der Literatur beschriebenen anti-Hapten-Antikörpern wie dem 48G7 (Wedemayer et al., 1997), dem 7G12 (Yin et al., 2003) oder den anti-Peptid-Antikörpern wie dem H6-scFv (Zahnd et al., 2004). Im Gegensatz zu der langen CDR-H3-Region des anti-Protein-Schwereketten-Antikörpers cAb-Lys3 (DeGenst et al., 2004) ist die lange CDR-H3 des 9E10-Antikörpers flexibel und ist wahrscheinlich in der Lage mit der unterstützenden Wirkung der VL-Domäne eine Vielzahl von Bindungskonformationen einzunehmen. Die Philosophie der Reifung des 9E10-Antikörpers liegt vor allem in der Stabilisierung der Bindungskonformation der für die Affinität und Spezifität wichtigen CDR-H3 durch die VL-Domäne.

Um die strukturellen Vorgänge während des Reifungsprozesses des 9E10-Antikörpers besser verstehen zu können, wären kristallographische Untersuchungen des 9E10 und der kompletten 9E10-Rückmutante mit und ohne des 18-mer c-myc(410-427)- und des modifizierten 20-mer c-myc(408(E409F-427)-Peptides sehr aufschlussreich. Auch kann so die Rolle der Wassermoleküle für die Komplementarität der Bindung untersucht werden. Änderungen in der Flexibilität der CDRs können zusätzlich durch Studien zur Proteindynamik aufgeklärt werden. Um Änderungen in der Bindungsspezifität des Keimbahn-kodierten und des gereiften Antikörpers intensiver zu betrachten, könnten verschiedene Peptide und Antigenklassen in ihrer Bindung getestet werden. So können statistische Peptidbibliotheken erstellt und die Polyspezifität des gereiften und des ungereiften 9E10 im Vergleich untersucht werden. Denkbar wären auch Kristallstrukturanalysen mit selektierten Peptiden aus einer Peptidbibliothek.

7.6 Fehlerbetrachtung der Peptidspot-Analysen

In den Peptidspot-Analysen waren Bindungen des 9E10-Fab und seiner Rückmutanten an die myc-Peptide mit Affinitäten vom unteren nM-Bereich bis in den unteren mM-Bereich (ELISA, SPR) nachweisbar. Kramer et al. (1997) beschreiben ebenfalls einen breiten Nachweisbereich für die Bindung des CB4-1-Antikörpers an sein Epitoppeptid (300 nM bis < 1 mM). Die beobachteten affinitätsbedingten scheinbaren Selektivitätsänderungen einiger 9E10-Rückmutanten und des 9E10-Fab zu einigen Peptidpositionen in den Substitutionsanalysen (6.6.2.1.) sollten mit einer weiteren Methode überprüft werden. Hierfür könnte man die Affinitäten der 9E10-Rückmutanten zum Wildtyppeptid und zu einigen ausgewählten substituierten Peptiden bestimmen und mit den Affinitäten des 9E10 zu denselben Peptiden ins Verhältnis setzen.

↓122

Die Bindungssignale in der Arbeit von Kramer et al. sind reproduzierbar und haben eine mittlere Standardabweichung von 0,18, die nicht mit der Länge der Peptide (6-13 AS) korreliert. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte eine Reproduzierbarkeit der Bindungssignale in den Peptidspotanalysen am Beispiel der Bindung des LKeimbahn/H9E10-Fabs an das myc-tag-Peptid in drei Substitutionsanalysen belegt werden. Die mittlere Standardabweichung lag hier bei 0,15. Das Bindungsmuster von LKeimbahn/H9E10 an das einzelsubstituierte myc-tag-Peptid war bei unterschiedlichen Detektionszeiten und Proteinkonzentrationen der Fabs unverändert. Es traten lediglich Unterschiede in der Bindung an Cystein-substituierte Peptide zwischen dem löslich im Periplasma exprimierten Fab und dem in vitro rückgefalteten Protein auf. Die verstärkte Bindung der rückgefalteten Fab-Fraktion an Cystein-substituierte Peptide könnte auf frei vorhandene reduzierte SH-Gruppen in den Proteinen deuten. Kramer et al. untersuchten weiterhin die Reinheit der synthetisierten Peptide mittels RP-HPLC und MS. Dabei stellte sich heraus, dass die Reinheit der Peptide in Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz verschieden seien kann. Für ein 11-mer Peptid konnte ein bis zu 70% reines Produkt ermittelt werden. Deletionen in den Peptidsequenzen sind ebenfalls laut Kramer et al. möglich. Jedoch sind selbst bei Ausbeuten von unter 40% an korrekt synthetisiertem Peptid sehr zuverlässige Bindungssignale möglich. Das heißt, dass die Methode sehr sensitiv ist und selbst geringe Mengen an korrekt synthetisierten Peptiden detektiert werden können. Zum Vergleich soll hier erwähnt werden, dass die in dieser Arbeit verwendeten löslichen Peptide (11-mer myc-tag und 20-mer c-myc(408-427)) eine Reinheit von 70-75% aufwiesen (P. Henklein). Die Frage nach korrekt synthetisierten Peptiden stellt sich insbesondere bei längeren Peptiden (> 10 AS). In der vorliegenden Arbeit werden Peptide mit bis zu zwanzig Aminosäuren Länge direkt auf der Membran synthetisiert. Bei der spezifischen Bindung der kompletten 9E10-Rückmutante an das 20-mer c-myc(E409F)-Peptid in den Substitutionsanalysen ist zu erkennen, dass noch ein ausreichend hoher Anteil der Peptide die korrekte Aminosäuresequenz beinhaltet. Peptidspots mit längeren Peptiden könnten für nachfolgende experimentelle Arbeiten über die Synthese von löslichen und gereinigten Peptiden mit anschließender Immobilisierung auf der Membran hergestellt werden. Diese Technik ist jedoch aufwendiger und lässt aus praktischen Gründen nur eine limitierte Anzahl von Peptiden auf einer Membran zu.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
30.03.2007