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Habilitationsschrift

Autor(en): Christian Stoll
Titel: Phänotypische Untersuchungen zur prognostischen Bedeutung Proliferations- und Apoptose-assoziierter Faktoren sowie der Expression von Adhäsionsmolekülen in Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx
Gutachter: E. Dielert; H. von Domarus
Erscheinungsdatum: 06.03.2001
Volltext: html (urn:nbn:de:kobv:11-10022084)
pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10022095)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): Apoptose, Adhäsionsmoleküle, Prognose, Plattenepithelkarzinom
Schlagwörter (eng): apoptosis, adhesion molecules, prognosis, squamous cell carcinoma
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
Zitationshinweis: Stoll, Christian: Phänotypische Untersuchungen zur prognostischen Bedeutung Proliferations- und Apoptose-assoziierter Faktoren sowie der Expression von Adhäsionsmolekülen in Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx; Habilitationsschrift, Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité , publiziert am 06.03.2001, urn:nbn:de:kobv:11-10022104
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Abstract (ger):
Tumorwachstum ist durch eine Störung des Gleichgewichts zwischen Zellproliferation und Apoptose charakterisiert. Sinn des ersten Teils dieser Untersuchungen war es, die Bedeutung von Proliferations- und Apoptose-assoziierten Faktoren in primären Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx bei 107 Patienten zu beurteilen. In neun Fällen wurden auch entsprechende Lymphknotenmetastasen untersucht. Für die Ermittlung der Apoptoseraten wurde eine durch terminale Transferase katalysierte enzymatische Markierung von DNA-Fragmenten verwendet. Die Parameter p53, p90MDM2, p21CIP, p16INK4a, Cyclin D1, pRB, BCL-2, BAX und das Proliferations-assoziierte Antigen Ki-67 wurden immunhistologisch bestimmt. Der Tumorsuppressor p53 war in den basalen Schichten des in den Tumorpräparaten miterfaßten Epithels abhängig vom Dysplasiegrad vermehrt nachweisbar (p<0,01). Eine positive Korrelation vom p53-Nachweis zum nur in höheren Zellagen zu findenden Antagonisten p90MDM2 ergab sich im dysplastischen und dysplasiefreien Epithel (p<0,05), zum ebenfalls nur in höheren Zellagen erkennbaren Effektormolekül p21CIP nur im dysplastischen Epithel (p<0,05). Im Tumorgewebe war p53 in etwa der Hälfte der Fälle immunhistologisch nachzuweisen. Positive Fälle waren dabei mit geringeren Apoptoseraten (p<0,003) und einem positiven p90MDM2-Nachweis (p<0,001) verknüpft. Die Apoptoserate war außerdem mit dem BCL-2-Nachweis negativ und dem BAX-Nachweis positiv korreliert (p<0,001). Letzterer zeigte wiederum eine reziproke Beziehung zum immunhistologisch nachweisbaren p53 (p<0,03). Die Antagonisten BCL-2 und BAX wiesen dabei auch eine negative Korrelation zueinander auf (p<0,001). Der BCL-2-Nachweis gelang in etwa einem Drittel der Fälle und zwar häufiger in geringer differenzierten Tumoren als in höher differenzierten Karzinomen (p<0,001), was aus seiner physiologischen Aufgabe resultieren könnte, "Stammzellen" vor der Apoptose zu bewahren. Sowohl die Proliferation (p<0,006) als auch die Apoptoserate (p<0,03) waren in größeren gegenüber kleineren Tumoren erhöht, auch wenn sich kein direkter Zusammenhang zwischen diesen beiden Parametern ergab. Außerdem war in größeren Tumoren vermehrt pRB zu finden (p<0,002), das wiederum eine positive Korrelation zur Proliferationsaktivität (p<0,001) und zu p53 (p<0,05) zeigte. Der Phosphorylierungsgrad von pRB wird im Zellzyklus unter anderem durch die Konzentration an Cyclin D1 bestimmt, das in metastasierenden Tumoren häufiger zu finden war als in solchen ohne Lymphknotenmetastasen (p<0,001). In bis zu 29% der 31 Fälle, in denen mehrere verschiedene Blöcke identischer Primärtumoren miteinander verglichen werden konnten, ergaben sich Differenzen zwischen diesen bei der Bestimmung der hier untersuchten Parameter als Zeichen einer intratumoralen Heterogenität, die die Bedeutung der Feldkanzerisierung für diese Tumorentität unterstreicht. Auch zu den entsprechenden Lymphknotenmetastasen wurden vereinzelt Unterschiede gefunden, die aber keine Systematik im Sinne einer Expressionsänderung dieser Parameter im Laufe des Metastasierungsprozesses erkennen ließen. Im Gegensatz zum konventionellen Tumor-Grading und -Staging zeigte keiner der in diesem Teil der Arbeit bestimmten Parameter einen signifikanten Einfluß auf das Überleben und Rezidiv-freie Überleben der Patienten mit manifesten Plattenepithelkarzinomen der Mundhöhle und des Oropharynx. Lediglich ein positiver BAX-Nachweis und eine hohe Proliferationsrate hatten tendenziell einen negativen Einfluß auf die Prognose. Während einer Expressionsänderung dieser Faktoren also eher eine Relevanz in frühen Stadien der Kanzerogenese zukommt, könnten im Rahmen der Progression von manifesten Tumoren vielmehr andere Faktoren wie Adhäsionsmoleküle eine prognostische Bedeutung besitzen, die im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht wurden. Beim immunhistologischen Nachweis von E-Cadherin war im Epithel außerhalb der Plattenepithelkarzinome ausnahmslos eine membranöse Färbung der Zellen im Stratum spinosum und granulosum erkennbar. Im Tumorgewebe war diese Färbung keineswegs immer auf die Zellmembran beschränkt. In 20,9% ergab sich im Zytoplasma eine vergleichbare Färbung und in 14,3% überwog sogar die zytoplasmatische Färbungsintensität. Eine prognostisch negative, wenn auch nicht signifikante Bedeutung für das Überleben und Rezidiv-freie Überleben hatte aber nur der in 15,4% der Fälle gefundene vollständige Verlust der E-Cadherin-Expression im Tumorgewebe. Auch die durch die varianten Exons V4, V5, V6, V7 und V9 kodierten und durch alternatives Spleißen der prä-mRNA nur bei bestimmten Isoformen des Adhäsionsmoleküls CD44 exprimierten Polypeptidabschnitte konnten mit Hilfe von spezifischen monoklonalen Antikörpern im gesamten Epithel außerhalb der Plattenepithelkarzinome nachgewiesen werden. Im Tumorgewebe war eine Expressionsminderung gegenüber dem Epithel für die Isoformen CD44v4, CD44v5 und CD44v6 nur in einzelnen Fällen von gering differenzierten Karzinomen zu finden. CD44v7 und CD44v9 waren in 13,2% und 34,1% der Fälle häufiger vermindert. Diese Expressionsminderungen zeigten einen signifikant negativen Einfluß sowohl auf das Überleben als auch auf das Rezidiv-freie Überleben der Patienten nach Kaplan und Meier (CD44v7: p<0,05; CD44v9: p<0,02). Die Expressionsminderung von CD44v9 war dabei signifikant mit einem höheren Tumor-Grading verknüpft (p<0,001). Eine Verminderung der Expression von mindestens einer der hier untersuchten CD44-Isoformen im Tumorgewebe gegenüber dem Epithel war in insgesamt 39,4% der Fälle zu finden, in denen das Überleben (p<0,002) und Rezidiv-freie Überleben (p<0,005) der Patienten nach Kaplan und Meier signifikant gegenüber den übrigen Patienten verkürzt war. In einer multivariaten Analyse des Überlebens nach Cox unter Einschluß der Parameter Tumorgröße und -infiltration pT, Lymphknotenmetastasierung pN, histologisches Tumor-Grading G und Verminderung der Expression von mindestens einer der hier untersuchten CD44-Isoformen im Tumorgewebe waren nur pT (Wald-Statistik: W=5,24; p<0,03), pN (W=9,48; p<0,003) und die Bestimmung der Expression der CD44-Isoformen (W=9,67; p<0,002) unabhängige Prognosefaktoren. Für das Rezidiv-freie Überleben hatten in diesem Modell nur die Lymphknotenmetastasierung pN (W=4,72; p<0,03) und die CD44-Expression (W=6,14; p<0,02) unabhängige prognostische Bedeutung. Somit stellen in diesem Tumorkollektiv Veränderungen der Expression von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Tumorzellen gegenüber dem Epithel prognostisch bedeutsame Ereignisse im Verlauf der Tumorprogression dar.
Abstract (eng):
Tumour growth is characterized by an imbalance between cell proliferation and apoptosis. The aim of the first part of this study was to estimate the importance of proliferation- and apoptosis-associated factors in primary squamous cell carcinomas of the oral cavity and the oropharynx obtained from 107 patients. In nine cases also corresponding lymph node metastases were examined. DNA-fragments were marked enzymaticly catalysed by a terminal transferase reaction for the recognition of apoptosis. The parameters p53, p90MDM2, p21CIP, p16INK4a, cyclin D1, pRB, BCL-2, BAX, and the proliferation-associated antigen Ki-67 were determined immunohistochemically. The tumour suppressor p53 was mainly detectable in the basal cell layers of the epithelium included in the tumour specimens additionally depending on the grade of dysplasia (p<0.01). A positive correlation of p53 to its antagonist p90MDM2, recognizable only in higher cellular layers, was found in the dysplastic and non-dysplasic epithelium (p<0.05), to the effector molecule p21CIP, limited to the higher cellular layers as well, only in the dysplastic epithelium (p<0.05). P53 was recognized immunohistochemically in about half of the cases of tumour tissue. Positive cases were associated with lower apoptosis (p<0.003) and a positive p90MDM2-detection (p<0.001). In addition, apoptosis was correlated negatively with BCL-2- and positively with BAX-measurements (p<0.001). Latter one showed in turn a reciprocal relationship to the immunohistochemically provable p53 (p<0.03). The antagonists BCL-2 and BAX demonstrated a negative correlation to each other (p<0.001). The detection of BCL-2 succeeded in approximately a third of all cases and more frequently indeed in less well-differentiated tumours than in more well-differentiated carcinomas (p<0.001), what might correspond to its physiological function of preserving stem cells from apoptosis. Both proliferation (p<0.006) and apoptosis (p<0.03) were increased in larger tumours even if no direct connection between these two parameters resulted. In addition, pRB was predominately found in larger tumours (p<0.002) and showed a positive correlation to the proliferation activity (p<0.001) and to p53 (p<0.05). The grade of pRB-phosphorylation in the cell cycle depends on the concentration of cyclin D1 which was found more frequently in metastasizing tumours than in such without lymph node metastases (p<0.001). A variance among these results was detectable in up to 29% of the 31 cases in which several distinct blocks of identical primary tumours could be compared with each other as a signs of an intratumoural heterogeneity which underlines the importance of a multifocal cancerogenesis for this tumour entity. Additionally differences to the corresponding lymph node metastases were found which would not let recognize any systematics, however, in the sense of a changed expression of these parameters in the course of the metastatic spread. Unlike the conventional tumour-grading and -staging none of the parameters tested in this part of the study showed a significant influence on the survival and recurrence-free survival of the patients with apparent squamous cell carcinomas of the oral cavity and the oropharynx. Only a positive BAX-determination and a high proliferation rate had tendentially a negative influence on prognosis. While a relevancy is therefore rather coming up to a changed expression of these factors in early stages of the cancerogenesis, other factors as adhesion molecules could have a prognostic importance that were examined in the second part of this study within the framework of the progression of manifest tumours. By the immunohistochemical detection of E-cadherin a membranous staining of the cells was recognizable without exception in the prickle-cell and granular layers of the epithelium outside of the squamous cell carcinomas. In the tumour tissue this staining was not always limited to the cell membranes. A comparable staining was found in 20.9% of the cases in the cytoplasm and in 14.3% even the cytoplasmic staining intensity predominated. A prognostically negative, but not significant importance for the survival and recurrence-free survival had, however, only the complete loss the E-cadherin expression in the tumour tissue discovered in 15.4% of the cases. Similarly, the polypeptide sections coded by the various exons V4, V5, V6, V7, and V9 and expressed after alternative splicing of the pre-mRNA only in specific isoforms of the adhesion molecule CD44 were verified in the entire epithelium outside of the squamous cell carcinomas by means of specific monoclonal antibodies. In the tumour tissue a reduced expression of the isoforms CD44v4, CD44v5, and CD44v6 compared with the epithelium was found only in individual cases of less well-differentiated carcinomas. CD44v7 and CD44v9 were decreased more frequently in 13,2% and 34,1% of the cases. This diminished expression showed a significantly negative influence both on the survival and the recurrence-free survival of the patients according to Kaplan and Meier (CD44v7: p<0.05; CD44v9: p<0.02). The decreased expression of CD44v9 was associated with a higher tumour-grading significantly (p<0.001). A diminution of the expression of at least one or more of the here examined CD44 isoforms in the tumour tissue compared with the epithelium was provable in 39,4% of all cases, in which the survival (p<0.002) and recurrence-free survival (p<0.005) of the patients according to Kaplan and Meier was reduced significantly as against the other patients. In a multivariate analysis of the survival according to Cox under inclusion of the parameters tumour-size and -infiltration as pT, formation of lymph node metastases as pN, histopathological tumour-grading as G, and a decrease of the expression of at least one of the here examined CD44 isoforms in the tumour tissue only pT (Wald-statistics: W=5.24; p<0.03), pN (W=9.48; p<0.003), and the expression of the CD44 isoforms (W=9.67; p<0.002) were independent prognostic factors. For the recurrence-free survival only the lymphatic spread as pN (W=4.72; p<0.03) and the CD44 expression (W=6.14; p<0.02) showed an independent prognostic importance in this model. Thus, alterations of the expression of adhesion molecules on the surface of tumour cells compared with the epithelium represent prognostically important events during the tumour progression in this collective.
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Generiert am 30.07.2014, 21:15:21