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Dissertation

Autor(en): Boris Thurisch
Titel: Untersuchung der Funktion des Transkriptionsfaktors GATA-4 durch eine Mausmutante mit einem induzierbaren RNA-Interferenz System
Gutachter: Wolfgang Uckert; Christof Dame; Jörg Bungert
Erscheinungsdatum: 11.12.2007
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10084068)
Fachgebiet(e): Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter (ger): RNA-Interferenz, GATA-4, Transkriptionsfaktor, Tet-System, Doxyzyklin, Transgene Maus
Schlagwörter (eng): RNA-interference, GATA-4, transcription factor, tet-system, doxycycline, transgenic mouse
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Zitationshinweis: Thurisch, Boris: Untersuchung der Funktion des Transkriptionsfaktors GATA-4 durch eine Mausmutante mit einem induzierbaren RNA-Interferenz System; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 11.12.2007, urn:nbn:de:kobv:11-10084068
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Abstract (ger):
Hintergrund: Der Transkriptionsfaktor GATA-4 ist für die normale Entwicklung des Endoderms essentiell. Mausmutanten mit einer homozygoten Deletion des gata-4 Gens versterben zwischen den embryonalen Tagen 8.5 - 10.5 aufgrund einer Störung der ventralen Morphogenese und der Ausbildung des Herzschlauches. Zielsetzung und experimentelle Strategie: Um die Bedeutung von GATA-4 auch nach der embryonalen Entwicklung untersuchen zu können, wurden doppelt-transgene Mäuse generiert. Diese Mausmutanten exprimieren einen Tetrazyklin-Repressor und eine gegen GATA-4 gerichtete short hairpin RNA (shGATA-4). Die Expression der shGATA-4 steht dabei unter der Kontrolle eines H1-Promotors, welcher durch ein Tetrazyklin-Operator Element modifiziert wurde. Dadurch ist das System durch Doxyzyklin induzierbar. Ergebnisse: Die Integration der Transgene in dem Genom der Maus wurde durch Southern-Blot Analyse nachgewiesen. Die Expression der shGATA-4 wurde durch die Applikation von Doxyzyklin über das Trinkwasser (20 mg/ml) induziert. Langzeitstudien am Herzen haben dabei eine signifikante Suppression von GATA-4 nach 38 Tagen ergeben (80 %). Diese Reduktion konnte durch Western-Blot Analyse bestätigt werden. Obwohl die Expression verschiedener Zielgene von GATA-4 (ANF, BMP-4) ebenfalls herunterreguliert war, fiel bei den transgenen Mäusen kein kardialer Phänotyp auf. Jedoch wurde die GATA-4 Expression in den Hoden und Ovarien transgener Mäuse supprimiert, nachdem shGATA-4 durch die Applikation von Doxyzyklin induziert wurde. Weiterführende Untersuchungen an adulten Mäusen zeigten eine GATA-4 Reduktion von 20 % auch in nicht mit Doxyzyklin-induzierten Mausmutanten. Diese Reduktion könnte durch einen sog. leaky-Effekt des shGATA-4 Transgens hervorgerufen worden sein, wodurch die stark eingeschränkte Fertilität dieser Mauslinie erklärt werden könnte. Interessanterweise haben ca. 10 % der mit Doxyzyklin behandelten transgenen Weibchen Ovarial-Teratome ausgebildet. Histologisch wiesen diese Teratome überwiegend (neuro-) ektodermale, vereinzelt mesodermale und nahezu keine endodermalen Strukturen auf. Schlussfolgerung: In diesem Modell hat die Suppression von GATA-4 keinen Einfluss auf die Funktion des Herzens der adulten Maus. Jedoch scheint GATA-4 für die Fertilität der Maus von großer Bedeutung zu sein. Weiterhin scheint die Suppression von GATA-4 mit der Ausbildung von Ovarial-Teratomen assoziiert zu sein.
Abstract (eng):
Background: The transcription factor GATA-4 is crucial for the normal endodermal development. In mice, homozygous deficiency of GATA-4 causes defects in ventral morphogenesis and heart tube formation, resulting in embryonic death between day e8.5 and e10.5. Aim and experimental strategy: To analyze the implication of GATA-4 beyond embryonic development a double transgenic mouse expressing the tetracycline repressor (TetR) and an inducible small interfering RNA directed against GATA-4 was generated. This expression construct contains a H1 promoter modified with a tetracycline operator upstream of the coding region for the GATA-4 short hairpin RNA (shGATA-4). Results: The integration of the transgenes in FvB mice (H1:G4/TetR) was confirmed by Southern blot. To induce the expression of the shGATA-4 construct, transgenic mice were treated with doxycycline (20 mg/ml drinking water). In longitudinal analysis, most efficient GATA-4 suppression was detected after 38 days. Quantitative PCR revealed a GATA-4 reduction of about 80 % in the heart, if normalized against the wildtype. Reduction of GATA-4 was confirmed by Western Blot. Although GATA-4 target genes (ANP, BMP-4) were down regulated, the animals showed no clinical phenotype. In opposite to wildtype mice, GATA-4 expression was undetectable in the ovaries and testis of transgenic mice with induced shGATA-4. Additional analysis in adult transgenic mice, which were not treated with doxycycline, also showed a reduction of GATA-4 expression of about 20 %, probably caused by a leaky-effect of the transgene. This may explain the significantly reduced fertility of the colony. Importantly, 10 % of transgenic females treated with doxycycline developed ovarian teratomas. Histological examination of teratomas showed predominantly (neuro-) ectodermal and to a lower degree mesodermal, but almost no endodermal compounds. Conclusions: GATA-4 reduction in the adult murine heart is – at least to a certain degree – clinically redundant. GATA-4 seems to be required for normal fertility. In our model GATA-4 deficiency seems to be associated with an increased risk for developing ovarian teratoma.
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