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Dissertation

Autor(en): Stephan Pritz
Titel: Enzymatische Ligation von Peptiden, Peptidnucleinsäuren und Proteinen
Gutachter: Michael Bienert; Oliver Seitz
Erscheinungsdatum: 13.01.2009
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10096387)
Fachgebiet(e): Chemie
Schlagwörter (ger): enzymatische Ligation, Proteinchemosynthese, Sortase, Peptidnucleinsäure
Schlagwörter (eng): enzymatic ligation, protein chemosynthesis, sortase, peptide nucleic acid
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Zitationshinweis: Pritz, Stephan: Enzymatische Ligation von Peptiden, Peptidnucleinsäuren und Proteinen; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 13.01.2009, urn:nbn:de:kobv:11-10096387
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Abstract (ger):
Peptide und Proteine sind wichtige Untersuchungsobjekte der biochemischen Forschung. Es wurden in den letzten Jahren eine Reihe von Ligationsmethoden entwickelt, um weitgehend entschützte, gereinigte Peptidsequenzen im wässrigen Milieu zu koppeln. Vor diesem Hintergrund von besonderem Interesse für einen möglichen Einsatz bei Ligationen ist die bakterielle Transpeptidase Sortase A. Dieses Enzym ist in vivo an der Anknüpfung von Proteinen an das bakterielle Peptidoglycan beteiligt, wobei es Substrate an einem LPXTG-Motiv zwischen Threonin und Glycin spaltet und auf ein Oligoglycin-Nucleophil überträgt. Zur Untersuchung der Enzymaktivität wurde in dieser Arbeit ein einfacher HPLC-basierter Assay etabliert. Die an Peptidmodellen gewonnenen Resultate wurden schließlich für den Aufbau eines löslichen Rezeptors genutzt. Ein Schlüsselschritt war die Sortase-vermittelte Ligation des in E. coli exprimierten, gefalteten Rezeptor-N-Terminus an ein 3-Loop-Konstrukt. Das erhaltene 23 kDa große Rezeptormimetikum war nach chromatographischer Reinigung homogen gemäß HPLC und MS. Es zeigte eine spezifische, hoch affine Bindung zu natürlichen Peptidliganden des CRF1-Rezeptors. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass sich Sortase für die selektive Markierung von Proteinen eignet. So wurde ein Fluoreszenzlabel C-terminal an das 50 kDa Protein NEMO geknüpft. Als weiteres Anwendungsbeispiel der Sortase-vermittelten Ligation diente die Darstellung von PNA–CPP-Konjugaten. Die Verwendung von Überschüssen des Peptides und die Entfernung der niedermolekularen Abgangsgruppe durch Dialyse erwies sich als sehr effektiv und gestattete gute bis hervorragende Kupplungsausbeuten von bis zu 94%. Die biologische Wirkung der erhaltenen CPP–PNA-Konjugate konnte in Aufnahmeuntersuchungen an Zellen gezeigt werden.
Abstract (eng):
Peptides and proteins are important research objects in biochemical research. Therefore, several ligation methods to couple unprotected, purified peptide sequences in aqueous media have been developed during the last years. At a special interest in this case is the bacterial transpeptidase sortase A. This enzyme couples proteins in vivo to the bacterial peptidoglycan by cleavage at a LPXTG-recognition motif between threonine and glycine and subsequent transfer to an oligoglycin nucleophile. In order to investigate the enzymatic activity, a simple HPLC-based assay was established in this work. Results obtained with model peptides were used for the assembly of a soluble receptor. A key step was the sortase-mediated ligation of the folded receptor N-terminus (expressed in E. coli) to the 3-loop-construct. The resulting receptor mimic of 23 kDa was homogeneous according to HPLC and MS. It showed specific binding to natural peptide ligands of the CRF1-receptor with high affinity. Furthermore, it could be shown that sortase is usable for selective protein labeling. For this purpose, a fluorescence label was attached C-terminally to the 50 kDa protein NEMO. As a further example of sortase-mediated ligation served the synthesis of PNA-CPP-conjugates. The use of an excess of the peptide and dialyzing away the small leaving group proved to be very effective and coupling yields up to 94% could be achieved. The biological activity of the CPP-PNA-conjugates could be shown by uptake studies in cells.
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Generiert am 28.11.2014, 22:47:45