| Autor(en): |
Stephanie Vanessa Engel |
Titel: |
Assembly von Influenzaviren – Analyse von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen mittels biochemischer und biophysikalischer Methoden |
| Gutachter: |
A. Herrmann; M. Veit; E. Ponimaskin |
| Erscheinungsdatum: |
23.04.2009 |
| Volltext: |
pdf
(urn:nbn:de:kobv:11-10097820)
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| Fachgebiet(e): |
Biowissenschaften, Biologie |
| Schlagwörter (ger): |
Influenzavirus, Hämagglutinin, FLIM-FRET, FRAP |
| Schlagwörter (eng): |
influenza virus, hemagglutinin, FLIM-FRET, FRAP |
| Einrichtung: |
Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Zitationshinweis: |
Engel, Stephanie Vanessa:
Assembly von Influenzaviren – Analyse von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen mittels biochemischer und biophysikalischer Methoden;
Dissertation,
Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 23.04.2009, urn:nbn:de:kobv:11-10097820
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| Abstract (ger): |
| Es wird angenommen, dass das Influenzavirus-Glykoprotein Hämagglutinin (HA) für seine Funktion sowohl bei der Virusfreisetzung als auch bei der Fusion von viraler und zellulärer Membran mit Cholesterin- und Sphingolipidreichen Domänen, sogenannten Membran-Rafts, assoziiert sein muss. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die Membran-Raft-Affinität von HA in lebenden Zellen mittels FLIM-FRET gemessen werden. Dabei wurde mit Hilfe der Fluroreszenz-Lebenszeit-Messung (FLIM) der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von fluoreszenzmarkiertem HA auf einen etablierten Raft-Marker bestimmt. Diese Messungen zeigten, dass beide Proteine in gemeinsamen Klustern in der Plasmamembran vorkommen. Durch Cholesterinentzug und durch den Einsatz von Cytochalasin D, welches die Mikrofilamente zerstört, konnte diese Klusterbildung reduziert werden. Demnach tragen sowohl die Membran-Rafts als auch das Aktinnetzwerk zu dieser Klusterbildung bei. Mittels FLIM-FRET konnte zusätzlich bestätigt werden, dass die Signale für die Detergenslöslichkeit von HA in Triton-Extraktionsexperimenten, die Palmitylierung und die stark hydrophoben Aminosäuren zu Beginn der Transmembrandomäne (TMD), auch im lebenden System eine wichtige Rolle spielen. Zusätzlich konnten biochemische Experimente zeigen, dass die hydrophoben Aminosäuren zu Beginn der HA-TMD den intrazellulären Transport, nach der Trimerbildung, entscheidend verzögern. Diese Verzögerung ist vermutlich auf einer erschwerten Integration dieser Proteine in die Membran-Rafts begründet. Die virale Fusion mit der Wirtszellmembran wird durch eine pH5-Behandlung vermittelte Konformationsänderung von HA ausgelöst. FLIM-FRET-Messungen zeigten für die pH5-Konformation von HA eine verglichen mit der pH7-Konformation verringerte Klusterbildung mit dem Raft-Marker. Somit ist offensichtlich, dass die Membranfusion-vermittelnde HA-Konformation eine verringerte Raft-Affinität besitzt. Diese verringerte Raft-Affinität könnte eine wichtige Rolle bei der Störung der Lipide an der Fusionsstelle spielen und somit die Bildung und/oder Vergrößerung der Fusionspore erleichtern.
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| Abstract (eng): |
| It has been supposed that the hemagglutinin (HA) of influenza virus is recruited to cholesterol- and sphingolipid-enriched domains, also named membrane-rafts, to accomplish its function in virus budding and membrane fusion. This study aimed at verifying the affinity of HA for membrane-rafts in living cells using fluorescence-lifetime imaging microscopy to measure Förster’s resonance energy transfer (FLIM-FRET). FLIM-FRET revealed strong clustering between a fluorescence-tagged HA-protein and a well-established raft-marker in CHO cells. Clustering was significantly reduced when rafts were disintegrated by cholesterol depletion and when microfilaments were disrupted with cytochalasin D. Thus, membrane-rafts as well as the actin meshwork contribute synergistically to clustering. Clustering was also reduced by the removal of the known signals for the association of HA with detergent-resistant-membranes, the palmitoylation and the first amino acids in the transmembrane region (TMR). Since these mutations are obviously important for the raft-association of HA their function during the transport through the ER and the Golgi-complex was studied. These investigations showed that the exchange of the first three amino acids of the HA-TMR led to a decelerated transport after trimer-formation of the protein, probably due to retarded integration of these proteins into membrane-raft domains. Mediating viral fusion with the host cell membrane requires an irreversible conformational change of HA. FLIM-FRET studies of this low pH conformation unveiled that the clustering with the raft-marker is decisively reduced compared to the pre-fusion conformation of the protein. It might be assumed that the fusion-mediating conformation of HA reduces the proteins affinity for membrane-rafts. Therefore it is likely that this reduced affinity for rafts after the conformational change is relevant to cause perturbation of lipids at the fusion site and thereby facilitating the formation and/or enlargement of the fusion pore.
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