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Dissertation

Autor(en): Silvia Scolari
Titel: Lateral organization of the transmembrane domain and cytoplasmic tail of influenza virus hemagglutinin revealed by time resolved imaging
Gutachter: Andreas Herrmann; Michael Veit; Manuel Prieto
Erscheinungsdatum: 25.08.2009
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-100102051)
Fachgebiet(e): Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter (ger): Influenzavirus, Hämagglutinin, FLIM-FRET, Lipid Rafts, Zusammenbau
Schlagwörter (eng): assembly, influenza virus, hemagglutinin, FLIM-FRET, lipid rafts
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Lizenz: Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung (CC BY NC ND)
Zitationshinweis: Scolari, Silvia: Lateral organization of the transmembrane domain and cytoplasmic tail of influenza virus hemagglutinin revealed by time resolved imaging; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 25.08.2009, urn:nbn:de:kobv:11-100102051
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Abstract (ger):
Der Viruspartikelzusammenbau hängt von der Anreicherung viraler Untereinheiten in spezifischen Domänen der PM ab. Es wird vorgeschlagen, dass Membran-Rafts – geordnete, sphingomyelin- und cholesterinreiche Mikrodomänen in der PM – als lokale Rekrutierungsstellen dienen. Hämagglutinin (HA) ist ein homotrimeres Glykoprotein in der Hülle des Influenzavirus. Es dient der Bindung an die Wirtszelle und der Fusion mit dem Endosom. Es wird angenommen, dass HA bei der Abschnürung der Viruspartikel von der Zelle mitwirkt. Zwei Hauptbeobachtungen führten zu der Hypothese, dass sich HA in Lipid-Mikrodomänen einlagert: HA wurde biochemisch in Detergens-resistenten Membranen nachgewiesen und die Virushülle ist mit raftbildenden Lipiden angereichert. Um die Rolle der HA-Transmembrandomäne für die Lipid-Raft-Inkorporation aufzuklären, wurde ein Konstrukt entwickelt, das den C-Terminus von HA mit dem gelb fluoreszierenden Protein YFP fusioniert, und die Transmembrandomäne, nicht aber die N-terminale Ektodomäne von HA enthält. In transfizierten Säugetierzellen wurde der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischen diesem Konstrukt und einem GPI-verankerten cyan fluoreszierenden Protein CFP (Raft-Marker) durch Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich HA-Konstrukte in Cholesterin-abhängigen Lipiddomänen anreichern, was durch eine erhöhte FRET-Effizienz nachgewiesen wurde. Zudem führen ein Cholesterinentzug aus der PM und die Deletion hochkonservierter Palmitylierungsstellen zu einer signifikanten Verringerung selbiger; sehr gering war diese zwischen dem HA-Konstrukt und einem Nicht-Raft-Marker. Darüberhinaus konnte durch ortsspezifische Mutagenese gezeigt werden, dass die verwendeten Konstrukte disulfidbrückenverbundene Oligomere bilden, welche Voraussetzung für den Transport der Konstrukte an die PM sind. Zeitaufgelöste Anisotropiemessungen ergaben für diese ein starkes Homo-FRET-Signal, welches die Oligomerisierungshypothese bestätigt.
Abstract (eng):
Numerous enveloped viruses bud from the host cell plasma membrane (PM). Assembly of the new viral particles depends on the accumulation of the viral subunits at specific sites of the cell membrane. Lipid domains or rafts enriched of sphingomyelin and cholesterol were suggested as sites for local recruitment of viral components. Hemagglutinin (HA), a homotrimeric glycoprotein embedded in the envelope of influenza virus, mediates binding of the virus to the host cell and fusion between the viral envelope and the endosomal membrane. HA might play an important role in budding of the viral particles from the host cell. Two observations led to the suggestion that HA entraps in lipid microdomains. First, HA was rescued in DRM fractions, second the viral envelope was found to be enriched in lipids generally forming rafts. To elucidate the role of the HA transmembrane domain in lipid raft localization we expressed constructs harboring the transmembrane domain and the cytoplasmic tail but lacking the N-terminal ectodomain of HA in the PM of mammalian cells. We studied energy transfer (FRET) between these constructs and a GPI anchored CFP as a raft marker by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Our results suggest that HA constructs are indeed sorted into cholesterol-dependent lipid domains since cholesterol depletion of the PM caused a significant decrease of FRET efficiency. Likewise, deletion of the three highly conserved palmitoylation sites of HA is also accompanied by a reduction of FRET efficiency. Site directed mutagenesis demonstrated that TMD-HA constructs form disulfide linked oligomers and that oligomerization is fundamental for the transport to the PM. This result was corroborated by time resolved anisotropy measurements that revealed strong homoFRET between TMD-HA-YFP molecules, thus indicating protein clustering. Accordingly, trimerization of full length HA is fundamental for stability and the subsequent delivery of the protein to the cell surface.
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Generiert am 02.09.2014, 06:21:15