| Autor(en): |
André Dallmann |
Titel: |
Structure and dynamics of fluorophore-labelled DNA helices probed by NMR-spectroscopy |
| Gutachter: |
Nikolaus P. Ernsting; Christian Griesinger; Clemens Mügge |
| Erscheinungsdatum: |
11.02.2010 |
| Volltext: |
pdf
(urn:nbn:de:kobv:11-100106129)
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| Fachgebiet(e): |
Chemie |
| Schlagwörter (ger): |
fluorophor-modifizierte DNA, NMR, Strukturbestimmung, Basenpaardynamik |
| Schlagwörter (eng): |
fluorophore-modified DNA, NMR, structure determination, base pair dynamics |
| Einrichtung: |
Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Lizenz: |
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| Zitationshinweis: |
Dallmann, André:
Structure and dynamics of fluorophore-labelled DNA helices probed by NMR-spectroscopy;
Dissertation,
Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 11.02.2010, urn:nbn:de:kobv:11-100106129
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| Abstract (ger): |
| Mittels NMR-Spektroskopie werden Störungen in Struktur und Dynamik von
DNA untersucht, die durch den Einbau jeweils eines der beiden Fluorophore 2-
Aminopurin (2AP) und 2-Hydroxy-7-nitrofluoren (HNF) hervorgerufen werden. Zu
diesem Zweck werden die NMR-Strukturen der modifizierten Duplexe mit der Sequenz
5’-GCTGCAXACGTCG-3’ berechnet. Im Fall X=2AP (13mer2AP) ist die
Partnerbase im Komplementärstrang ein T, während gegenüber X=HNF (13mer-
HNF) eine abasische Stelle eingeführt wird.
Durch den Vergleich der Ergebnisse zum 13mer2AP mit denjenigen des entsprechenden
unmodifizierten DNA Doppelstranges (13merRef, X=A) konnte jegliche Änderung
eindeutig dem Einbau von 2AP zugordnet werden. Für die NMR-Strukturen
von 13merRef und 13mer2AP können kleine aber signifikante, über die gesamte Helix
verteilte Strukturstörungen nachgewiesen werden. Experimente zum Iminoprotonenaustausch
mit Wasser ergeben, daß der Einbau von 2AP die Basenpaarlebensdauern
der 7 zentralen Basenpaare erniedrigt. Die kürzere Lebensdauer des 2AP:T Basenpaares
kann jedoch nicht den schnellen Wasseraustausch im Sättigungstransfer-
Experiment ohne Zugabe von Basenkatalysator erklären. Als Erklärung für diese
Diskrepanz wird eine effizientere intrinsische Katalyse vermutet. Als mögliche, katalytisch
aktive Stelle wird das T O4 Atom diskutiert, welches über die große Furche
leicht zugänglich ist und das keine Wasserstoffbrückenbindung innerhalb des Basenpaares
ausbilden kann.
Die übergeordnete Struktur des 13merHNF ist eine B-Form DNA Helix. Die NOE
Kreuzpeaks zu den Protonen im HNF können jedoch nur durch zwei verschiedene
Orientierungen des HNFs in der helikalen Anordnung beschrieben werden. Das
Verhältnis der beiden Orientierungen untereinander wird als 1:1 abgeschätzt. Störungen
in der Basenpaardynamik werden durch die höhere Linienbreite und die
starke Hochfeldverschiebung des T auf der 5’-Seite ausgehend von der abasischen
Stelle angedeutet. |
| Abstract (eng): |
| Structural and dynamic perturbations in DNA upon incorporation of either fluorophore,
2-Aminopurine (2AP) or 2-Hydroxy-7-nitrofluorene (HNF), are characterized
by NMR spectroscopy. For this purpose the NMR solution structures of the
modified DNA duplexes with the sequence 5’-GCTGCAXACGTCG-3’ are solved.
For X=2AP (13mer2AP) the partner base in the complementary strand is T, while
for X=HNF (13merHNF) an abasic site is introduced to avoid steric strain.
By comparing results on 13mer2AP with the corresponding unmodified DNA duplex
(13merRef, X=A), any perturbation can be unambiguously assigned to 2AP
incorporation. For the NMR solution structure of 13merRef and 13mer2AP small
but significant changes in helical parameters are found throughout the helix. Imino
proton exchange measurements reveal an extended, distributed effect of 2AP incorporation
on the lifetimes of the central seven base pair. However, the reduced base
pair lifetime of 2AP:T cannot fully account for the rapid water exchange observed
with saturation transfer experiments in the absence of base catalyst. This indicates
enhanced intrinsic catalysis. As a possible catalytic site the T O4 atom opposite
2AP is discussed, which is easily accessible through the major groove and lacks a
hydrogen bonding partner within the base pair.
The overall NMR solution structure is found to be B-DNA. However the NOE
cross-peaks involving the HNF residue can only be accounted for by two different
orientations of the HNF inside the DNA helical stack. Their population ratio is
estimated to be 1:1. Dynamical perturbation is indicated by the increased linewidth
and strong upfield shift of the T residue to the 5’-side of the abasic site. |
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