| Autor(en): |
Erik Haaf |
Titel: |
Qualitative und quantitative Analyse der Phosphorylierung von Proteinen der circadianen Uhr |
| Gutachter: |
Michael W. Linscheid; Wolf Dieter Lehmann |
| Erscheinungsdatum: |
03.09.2012 |
| Volltext: |
pdf
(urn:nbn:de:kobv:11-100203984)
|
| Fachgebiet(e): |
Chemie |
| Schlagwörter (ger): |
Massenspektrometrie, circadiane Uhr, Proteomics, Protein Phosphorylierung, Phosphopeptidanreicherung mit TiO2 |
| Schlagwörter (eng): |
circadian clock, mass spectrometry, proteomics, protein phosphorylation, phosphopeptide enrichment with TiO2 |
| Einrichtung: |
Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Lizenz: |
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| Zitationshinweis: |
Haaf, Erik:
Qualitative und quantitative Analyse der Phosphorylierung von Proteinen der circadianen Uhr;
Dissertation,
Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 03.09.2012, urn:nbn:de:kobv:11-100203984
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| Abstract (ger): |
| Die Phosphorylierung als posttranslationale Modifikation von Proteinen spielt bei Signalwegen in Zellen eine große Rolle. Für die Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der circadianen Uhr ist es daher von Interesse, die Phosphorylierungsstellen beteiligter Proteine zu identifizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die
Proteine Period I und II mittels Flüssigkeitschromatographie und Tandemmassenspektrometrie
(LC-MS/MS) auf Phosphorylierungsstellen untersucht. Hierbei lag der Fokus auf der Verbesserung bestehender Methoden, um eine bessere und umfassendere Identifizierung der Phosphorylierungsstellen, insbesondere in Bezug auf mehrfach phosphorylierte Peptide, zu erreichen. Der Arbeitsablauf beinhaltete die Verwendung mehrerer Proteasen, um eine hohe Sequenzabdeckung des Proteins zu
erreichen. Nach der Proteolyse wurden die Phosphopeptide mittels Titandioxid angereichert.
Hierbei und bei der LC-MS/MS-Analyse wurde Citrat als Additiv verwendet,
welches eine bessere Chromatographie multiphosphorylierter Peptide ermöglicht.
Bei der MS/MS-Analyse wurden CID und ETD als Fragmentierungsmethoden eingesetzt. Es konnten durch diese Methodik 30 bzw. 42 Phosphorylierungsstellen an den Proteinen Period I und II identifiziert werden, von denen 26 bzw. 14
zuvor nicht beschrieben waren. Nach der qualitativen Identifizierung wurden quantitative
Varianten der optimierten Analytik untersucht, um die biologische Funktion
der gefundenen Phosphorylierungsstellen untersuchen zu können. Hierbei wurden
das metabolische Labeling der Zellen mit 15N-stickstoffhaltigen Aminosäuren und
die säurekatalysierte Isotopenmarkierung auf Peptidebene mit 18O-Sauerstoff untersucht.
Mit einer optimierten Variante der säurekatalysierten Isotopenmarkierung
mit 18O-Sauerstoff lassen sich die Carboxygruppen der Peptide in 5h 30min mit
einer Rate von >97% 18O-Sauerstoff markieren. Mit dieser Methode können weitere
funktionelle Untersuchungen der Phosphorylierung an den Period-Proteinen durchgeführt
werden. |
| Abstract (eng): |
| Protein phosphorylation, a posttranslational modification, plays an important role
in signal cascades in cells. In order to understand the molecular mechanism of the
circadian clock, it is thus of interest to identify the phosphorylation sites on proteins
contributing to the system. During the work for this thesis, the proteins Period I
and II were analyzed for phosphorylation sites with liquid chromatography and tandem
mass spectrometry (LC-MS/MS). Hereby the focus was on improving existing
methods in order to better identify multi-phosphorylated peptides. In the workflow,
the Period proteins were digested with several proteases in order to archive
a high sequence coverage for analysis. After proteolysis the phosphopeptides were
subsequently enriched with titanium dioxide. During phosphopeptide enrichment
and reversed phase chromatography, citrate was used as an additive for a better
chromatography and recovery of multiphosphorylated peptides. During LC-MS/MS
analysis, CID and ETD were used as fragmentation mechanisms in the mass spectrometer.
Using these methods, 30 and 42 phosphorylation sites could be identified
on the proteins Period I and II, respectively, including 26 and 14 which were
previously unpublished. In order to unravel the biological function of these phosphorylation
sites, quantitative methods for the optimized LC-MS approach were
investigated. This included the metabolic labeling of cells with amino acids containing
15N-nitrogen as well as acid catalyzed 18O-oxygen labeling on peptide level.
The developed optimized variant of acid catalyzed 18O-oxygen labeling achieves an
inclusion of 18O-oxygen at the peptide carboxy groups with a rate of >97% in 5h
30min. This method can be used for further investigation of the biological function
of the phosphorylation on the Period proteins. |
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