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Dissertation

Autor(en): Sam Asami
Titel: Method development for biomolecular solid-state NMR spectroscopy – accessing structure and dynamics of biomolecules in the solid-state
Gutachter: Bernd Reif; Andreas Möglich; Hartmut Oschkinat
Erscheinungsdatum: 17.10.2014
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-100220957)
Fachgebiet(e): Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter (ger): Dynamik, Deuterierung, Festkörper-NMR Spektroskopie, Proteine, Protein-RNA Komplexe, Mikrokristalle, Amyloidfibrillen, NMR Methodenentwicklung, 1H-Detektion, Aliphaten, 13C T1, REDOR, Order Parameter, dipolarer Kopplungstensor, ultraschnelles MAS, 1.3 mm Rotoren
Schlagwörter (eng): deuteration, dynamics, Solid-State NMR spectroscopy, proteins, protein-RNA complexes, microcrystals, amyloid fibrils, NMR method development, 1H detection, aliphates, 13C T1, REDOR, order parameter, dipolar coupling tensor, ultrafast MAS, 1.3 mm rotors
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Lizenz: Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung (CC BY NC ND)
Zitationshinweis: Asami, Sam: Method development for biomolecular solid-state NMR spectroscopy – accessing structure and dynamics of biomolecules in the solid-state; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 17.10.2014, urn:nbn:de:kobv:11-100220957
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Abstract (ger):
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit, wird ein neuartiges Markierungsschema für die Festkörper-NMR-Spektroskopie vorgestellt, das sogenannte Reduced Adjoining Protonation (RAP) Schema, welches die Protonendetektion sämtlicher Aliphaten erlaubt. Hochaufgelöste, 1H-detektierte 1H,13C Korrelationsspektren wurden erhalten. Des Weiteren wurde der Vorteil von hohen MAS-Frequenzen untersucht. 1H- und 13C-detektierte 3D Zuordnungsexperimente wurden implementiert, welche uns die Zuordnung von 90% aller aliphatischen Resonanzen von alpha-Spektrin SH3 erlaubten. Da die chemische Verschiebung abhängt vom Strukturmotiv, kann sie verwendet werden, um Sekundärstruktur-Informationen abzuleiten. Darüber hinaus wurde ein 1H-detektiertes H(H)CH 3D Experiment entwickelt, um weitreichende 1H,1H Kontakte zu ermitteln, welche für die Bestimmung der Tertiärstruktur genutzt werden können. Um artefaktfreie Relaxationsdaten zu erhalten, wurde das RAP-Markierungsschema modifiziert, um 1H- und 13C-verdünnte Proben zu erhalten, in denen Spindiffusion unterdrückt ist. Für die Untersuchung von Sub-Mikrosekunden-Dynamik werden Experimente vorgestellt zur Bestimmung von 13C T1 Relaxationszeiten und 1H,13C dipolaren Kopplungstensoren für Rückgrat- und Seitenketten-Resonanzen. Des weiteren zeigen wir, dass das RAP-Markierungsschema auf nicht-kristalline Systeme, wie Amyloidfibrillen des Abeta1-40 Peptids der Alzheimer-Krankheit, angewendet werden kann. Unter Verwendung von 1H-Detektion, erhielten wir hochaufgelöste 1H,13C Korrelationsspektren. Schließlich wurde der Perdeuterierungsansatz auf den L7Ae-box C/D Protein-RNA Komplex aus P. furiosus angewendet. Wir erhielten hochaufgelöste, 1H-detektierte 1H,15N, sowie 13C,13C Korrelationsspektren des Protein-RNA Komplexes. Weiterhin haben wir eine Methode zur Bestimmung genauer Abstands- und Winkelinformationen für die Protein-RNA Schnittstelle etabliert und schlagen Ansätze vor, für die Zuordnung der chemischen Verschiebungen von RNA-Resonanzen.
Abstract (eng):
In this thesis, a novel labeling scheme for solid-state NMR spectroscopy, the Reduced Adjoining Protonation (RAP) scheme, is introduced, which allows proton detection of all aliphatic sites, as shown for the microcrystalline SH3 domain of alpha-spectrin. These samples yield high-resolution, 1H-detected 1H,13C correlation spectra. In addition, the benefit of high MAS frequencies was investigated. 1H- and 13C-detected 3D assignment experiments are implemented, which allowed us to assign 90% of all aliphatic resonances of alpha-spectrin SH3. As the chemical shift is dependent on the structural motif, it can be employed to derive secondary structure information. Furthermore, a 1H-detected H(H)CH 3D experiment is introduced, to obtain long-range 1H,1H contacts, which can be used for the determination of the tertiary structure. To obtain artifact-free relaxation data, the RAP labeling scheme was modified to obtain sparsely proton labeled, 13C dilute samples, in which spin diffusion is suppressed. To probe sub-microsecond dynamics, we report experiments to determine 13C T1 relaxation times and 1H,13C dipolar coupling tensors for backbone and side chain resonances, respectively. Furthermore, we show, that the RAP labeling scheme can be applied to non-crystalline systems, such as amyloid fibrils of the Alzheimer’s disease peptide Abeta1-40. Using 1H-detection, we obtained high-resolution 1H,13C correlation spectra. Finally, we applied the perdeuteration approach to the L7Ae-box C/D protein-RNA complex from P. furiosus. We obtained high-resolution, 1H-detected 1H,15N, as well as 13C,13C correlation spectra of the protein-RNA complex. In addition, we established a methodology to determine accurate distance and angular restraints for the protein-RNA interface and propose approaches for the chemical shift assignment of RNA resonances.
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Generiert am 29.03.2017, 13:25:05