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Dissertation

Autor(en): Stephan Heinke
Titel: Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen
Gutachter: B. Nilius; H. Kühnert; Uwe Heinemann
Erscheinungsdatum: 18.08.1998
Volltext: html (urn:nbn:de:kobv:11-1008180)
pdf (urn:nbn:de:kobv:11-1008197)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): Chlorid-Kanäle, Endothel, patch clamp, intrazelluläres Kalzium
Schlagwörter (eng): chlorid currents, endothelium, patch clamp, intracellular calcium
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
Zitationshinweis: Heinke, Stephan: Zur Modulation volumenaktivierter Chloridströme in Endothelzellen; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité , publiziert am 18.08.1998, urn:nbn:de:kobv:11-1008209
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Abstract (ger):
Volumeninduzierte Chloridströme wurden bereits in einer Reihe von Zelltypen charakterisiert. In dieser Arbeit wurde die Modulation volumenaktivierte Chloridströme ICl,Vol und der Signalweg zu ihrer Aktivierung untersucht. In Endothelzellen aus der Pulmonalarterie des Rindes (CPAE) wurden der Membranstrom unter Anwendung der 'patch clamp' - Technik und simultan dazu die Konzentration des freien intrazellulären Kalziums [Ca2+]i gemessen.
  1. Bisher wurde davon ausgegangen, daß die Aktivierung von ICl,Vol kalziumunabhängig erfolgt. In dieser Arbeit wurde ICl,Vol unter Pufferung des [Ca2+]i mit BAPTA und EGTA gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß freies intrazelluläres Kalzium in Konzentrationen niedriger als 50 nM zur Stromaktivierung notwendig ist. Bei einer höheren Konzentration verliert der Strom jedoch seine Kalziumabhängigkeit.
  2. Chromoglycinsäure (CL) blockiert ICl,Vol in Endothelzellen. Dieser Effekt ist jedoch im Vergleich zu dem klassischen Chloridkanalblocker NPPB geringer (Ki=15mM) und sehr langsam (im Mittel 100 s). Damit sind die blockierenden Eigenschaften auch geringer ausgeprägt als z.B. auf ICl,Vol und Hemmung der Serotoninsekretion in Mastzellen.
  3. Weiterhin war die Rolle von durch Proteinphosphorylierung modulierten intrazellulären Signalwegen bei der Aktivierung von ICl,Vol Gegenstand von Experimenten. Weder die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) durch direkte Applikation des Phorbolesters PMA noch deren Ab - Regulation durch 24-stündige Inkubation mit PMA hatten Einfluß auf die Aktivierung von ICl,Vol. Auch Wortmannin, ein Inhibitor sowohl der MAP - Kinasen (und damit des Tyrosinkinase - assoziierten Rezeptor - Signalweges) als auch der PI3 - Kinase, zeigte keinen Effekt auf ICl,Vol. Der Aktivator der MAP - Kinasen und der fokalen Adhaesionskinase p125FAK, die Substanz Lysophosphatsäure (LPA), zeigte weder einen Effekt auf ICl,Vol, noch konnte damit ein Chloridstrom induziert werden. Die Induktion von HSP durch Applizierung von thermischem und chemischem Streß unter Inkubation bei bis zu 45 °C über 60 min und Einwirkung von 0,3 mM Natriumarsenit zeigte keinerlei Einfluß auf ICl,Vol. Es konnte auch keine Aktivierung eines Chloridstromes beobachtet werden.
  4. Zur Untersuchung des Aktivierungsmechanismus von ICl,Vol dienten Experimente unter gleichzeitiger Messung von ICl,Vol, Membrankapazität (CM) und (jedoch zeitlich unabhängig voneinander) der Zellhöhe. Die Ergebnisse wurden an Hand dreier Modellvorstellungen zur Aktivierung von ICl,Vol diskutiert.
Es bestand eine enge Korrelation zwischen Veränderungen der Zellhöhe und des aktivierten Stromes. Beide korrelieren jedoch nicht mit den Änderungen von CM. Dabei änderte sich CM bei einem Teil der Zellen praktisch nicht, d.h. geringer als 2% des Ausgangswertes vor Applikation hypotoner Lösung (n=17), bei den verbliebenen Teil zeigten sich deutliche Veränderungen von durchschnittlich 10,6 ± 0,9 % ( ± SEM, n=5). In letzterem Fall änderte sich jedoch immer zuerst ICl,Vol und dann CM. Nach Inhibierung des intrazellulären Vesikeltransports durch Brefeldin A war ICl,Vol ohne signifikante Änderungen auslösbar. Unter Cycloheximid, einem Blocker der Proteinsynthese auf Transkribtionssebene, wurden keine spezifischen Veränderungen von ICl,Vol beobachtet. Auf jeden Fall ist CM nicht der primäre Trigger für ICl,Vol. Die Aktivierung von volumeninduzierten Chloridströmen erfolgt nicht maßgeblich durch die Inkorporierung von Ionenkanal - Proteinen enthaltenden Membranvesikeln.
Abstract (eng):
Volume-induced chlorid currents are characterised for many types of cells. I have investigated the modulation and activation of these currents. In cultered pulmonary artery endothelial cells (CPAE) patch clamp maesurements of membrane currents and simultaneous maesurements of free intracellular calcium ([Ca2+]i) were performed.
  1. Until now, activation of ICl,Vol was characterised as Calcium-independently. I maesured the current buffering [Ca2+]i with the Calcium chelators BAPTA and EGTA. It could be observed, that [Ca2+]i at concentrations less than 50 nM is required to activate ICl,Vol. At higher concentrations, there is no modulation by [Ca2+]i.
  2. Sodiumchromoglycate (CL) blocks ICl,Vol in endothelium cells. This effect is small (Ki=15mM) and slow (100 s) as compared of those of the classical chlorid channel blocker NPPB. Inhibitory effects of CL to ICl,Vol in endothelial cells are weaker than to ICl,Vol and to secretion of serotonin in mast cells.
  3. The role of intracellular phosphorylation signal pathways on activation of ICl,Vol was investigated. Neither activation of protein kinase C (PKC) throught direct application of the phorbol ester PMA nor down-regulation through preincubation with PMA had any effect on activation of ICl,Vol. Also Wortmannin, an inhibitor of MAP-kinases, failed to have significant effects on I. Lysophosphatic acid, wich activates MAP kinases as well as focal adhaesion kinase p125FAK, did not have any effect on ICl,Vol or activated some chlorid current. Induction of heat shock proteins (HSP) through application of thermical or chemical stress (incubation under 45 °C over 60 min or with 0,3 mM Sodiumarsenit) had no effect on ICl,Vol nor some activation of chlorid currents could be observed.
  4. We have combined maesurements of currents with maesurements of membrane capacitance (CM) and (but not simultaniously) of changes in cell height to study the activation mechanism of ICl,Vol.
The swelling-induced current is correlated with the changes in cell height. However, neither the changes in cell height nor ICl,Vol were correlated with CM. In some cells (n=17), there was no substantial change (less than 2%) in CM. In the remaining 5 cells, changes in CM are arround 10,6% ± 0,9% (average ± SEM). Thereby changes of CM started allways after those of ICl,Vol. Inhibition of vesicular transport by Brefeldin A did not affect ICl,Vol significantly. The block of protein synthesis by Cyclophosphamid did not have specific effects on ICl,Vol. It is concluded, that CM is not the primary trigger for ICl,Vol. Its activation is not due to incorporation of ion channels by vesicle fusion.
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Generiert am 21.10.2014, 12:21:29