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Dissertation

Autor(en): Manuel Andrade
Titel: Identifizerung von Candia-Spezies und -Stämmen durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR
Gutachter: H. Bernardt; H.-J. Tietz; Hans-Christian Korting
Erscheinungsdatum: 12.07.1999
Volltext: html (urn:nbn:de:kobv:11-10010065)
pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10010077)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): PCR, Candida, Polymorphismus, Identifizierung, ITS-Region
Schlagwörter (eng): PCR, Candida, polymorfism, identification, ITS-region
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
Zitationshinweis: Andrade, Manuel: Identifizerung von Candia-Spezies und -Stämmen durch den Nachweis von polymorphen DNA-Regionen in der PCR; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité , publiziert am 12.07.1999, urn:nbn:de:kobv:11-10010080
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Abstract (ger):
Für die Identifizierung bzw. Differenzierung von Candida- Spezies und -Stämmen sowie für die Bestimmung der genetischen und epidemiologischen Verwandtschaft von Stämmen der gleichen Spezies wurde eine PCR-Fingerprint-Technik und eine RFLP-Analyse der amplifizierten ITS-Region angewandt. Das PCR-Fingerprinting amplifiziert anonyme Sequenzen in der chromosomalen DNA, die über das gesamte Genom verteilt sind. Die ITS-Region ist Bestandteil des ribosomalen Operons, welches in ca. 50-100 Kopien/Zelle vorhanden ist. 1.a. Beide molekularbiologischen Verfahren wurden zur Unterscheidung von routinemäßig schwer differenzierbaren klinischen Candida famata und Candida guilliermondii-Isolaten genutzt. Von insgesamt 37 fraglichen Stämmen konnten 31 als C. guilliermondii und 3 als C. famata identifiziert werden, die drei verbliebenen Stämme waren mit diesen Techniken nicht identifizierbar. Mit der Biochemotypie gelang nur die Zuordnung eines der 3 C. famata-Isolate sowie von 23 der 31 C. guilliermondii-Isolate. 14 Isolate wurden mit den konventionellen Methoden gar nicht oder falsch identifiziert. 1b. Mit dem PCR-Fingerprinting wurde auch die Spezieszugehörigkeit phänotypisch veränderter Candida albicans-Isolate überprüft. Alle atypischen Stämme, bei denen solche für C.albicans charakteristischen Merkmale wie die Bildung von Chlamydosporen, die Verwertung der Aminozucker Glukosamin und N-Acetylglukosamin sowie die Assimilation von 2-Ketogluconat und Xylose nicht ausgeprägt waren, wiesen die für C. albicans typischen Fingerprintmuster auf. Unsere Studie zeigte, daß die biochemische Typisierung an Grenzen stößt, wenn typische Stoffwechselreaktionen nicht nachgewiesen werden können. 2. Bei 6 verschiedenen C. albicans-Populationen aus Angola, Madagaskar, Deutschland und Portugal wurde die Variabilität phänotypischer und genotypischer Merkmale untersucht, wobei in diese Analyse auch atypische Stämme miteinbezogen wurden. Während die phänotypischen Eigenschaften, bis auf die der atypischen Stämme, kaum variierten, wurden für die insgesamt 212 C. albicans-Isolate 87 unterschiedliche PCR-Fingerprint-Genotypen nachgewiesen. Eine Analyse der Beziehungen zwischen den Fingerprint-Genotypen wurde mit der UPGMA-Distanz-Methode durchgeführt. 3. Weiterhin wurden Candida-Vaginalisolate von Patientinnen mit rezidivierenden Episoden von Candida-Vaginitis mit Stämmen verglichen, die aus anderen Körperregionen stammten bzw. bei ihren Partnern isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, daß Stammaustausche zwischen den Partnern vorkommen, ein Stamm ohne oder mit geringfügigen genotypischen Veränderungen trotz Therapie persistieren kann und daß eine Reinfektion auch durch einen neuen Stamm möglich ist. Das Problem der Erregeridentifizierung in der mykologischen Labordiagnostik ist sowohl klinisch als auch epidemiologisch relevant. Molekularbiologische Methoden sollen gut funktionierende konventionelle Methoden zur Erregeridentifizierung nicht ersetzen, können aber bei Problemfällen eine wertvolle Ergänzung für die mykologische Diagnostik vorzugsweise in fachständigen Referenzlaboratorien darstellen.
Abstract (eng):
A PCR fingerprinting approach and a RFLP analysis of the amplified ITS region were used to differentiate Candida species and strains as well as to assess genetic and epidemiological relationships of strains belonging to the same species. The PCR fingerprinting amplifies anonymous DNA sequences sampled throughout the whole genome. The ITS region is part of the ribosomal operon which occurs in tandem arrays of nearly 50-100 copies in one cell. 1.a. Both methods were used to identify clinical isolates of C. famata and C. guilliermondii which were difficult to differentiate with routine methods. Out of 37 ambiguous isolates 31 could be identified as C. guilliermondii, 3 as C. famata and the other 3 were not identifiable. Biochemical typing (Api 32 C V.1) identified only 23 out of 31 C. guilliermondii and 1 out of 3 C. famata whereas 14 isolates were misidentified or not identified at all. 1.b. By using the PCR fingerprinting technique strains of C. albicans with altered phenotypes could be identified at species level. Atypical isolates which did not express those characteristics which are thought to be typical for C.albicans like the formation of clamydospores, the ability to metabolise the amino sugars glucosamine and N-acetylglucosamine as the sole carbon source or to assimilate 2-ketogluconate and xylose showed the PCR patterns typical for C.albicans. Our study revealed that biochemical and morphological methods of species identification are limited if some of the key reactions fail. 2. We investigated the variability of phenotypic and genotypic properties of 6 different C. albicans populations from different countries (Angola, Madagascar, Portugal and Germany) including atypical strains. Except for the atypical strains only very little phenotypical variation was observed. However, 87 different genotypes were found among the 212 strains. The relatedness of the fingerprint-genotypes were analysed by measuring genetic distances with the UPGMA method. 3. Vaginal isolates of Candida spp. obtained from patients with recurrent episodes of vaginitis were compared with isolates from different body locations of the women and from their male partners. It has been shown that strain exchanges between the partners occur, that the original strain with or without minor genotypic changes can persist despite of the therapy, but also that reinfection by a new strain is possible. The identification of an ethiological agent by the mycological diagnostic laboratory is of clinical and epidemiological importance. Molecular biological methods should not replace well established conventional methods but they can supplement the identification of fungal pathogens in specialised reference laboratories if diagnosis cannot be achieved easily by conventional diagnostic procedures.
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Generiert am 21.04.2014, 08:42:51