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Dissertation

Autor(en): Sarah Bhargava
Titel: Carbocyanin-markierte Derivate des vasoaktiven intestinalen Peptids fü die Tumordiagnostik
Gutachter: Oschkinat; Semmler; J. Schneider-Mergener
Erscheinungsdatum: 18.03.2002
Volltext: html (urn:nbn:de:kobv:11-10016648)
pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10016652)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): Cyaninfarbstoffe, VIP, VPAC1, optische Bildgebung, Tumordiagnostik
Schlagwörter (eng): cyanine dyes, VIP, VPAC1, optical imaging, tumour diagnosis
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
Zitationshinweis: Bhargava, Sarah: Carbocyanin-markierte Derivate des vasoaktiven intestinalen Peptids fü die Tumordiagnostik; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité , publiziert am 18.03.2002, urn:nbn:de:kobv:11-10016652
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Abstract (ger):
Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP) ist ein 28meres Neuropeptid, das eine Vielzahl biologischer Aktivitäten ausübt, welche durch die Bindung an die heptahelikalen Transmembranrezeptoren VPAC1 und VPAC2 vermittelt werden. VPAC1 ist auf der Oberfläche vieler Tumorzellen überexprimiert. Daher ist VIP gekoppelt mit Signalmolekülen wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffen eine interessante Zielstruktur für die optische Detektion von Tumoren. Der Einsatz von VIP in der Tumordiagnostik ist jedoch aufgrund der schnellen proteolytischen Degradation stark limitiert. In der vorliegenden Arbeit wurden VIP-Analoga mit höherer in vitro und in vivo Stabilität identifiziert und synthetisiert. Hierfür wurde eine neue Synthesestrategie entwickelt, welche die hochparallele Herstellung von löslichen VIP-Farbstoff-Konjugaten auf Cellulosemembranen (Spotsynthese) erlaubt. Es wurden 533 N-terminal Carbocyanin-farbstoff-markierte VIP-Analoga synthetisiert, wobei jeder VIP-Rest durch alle übrigen 19 L-Aminosäuren ausgetauscht wurde (Substitutionsanalyse). Alle Analoga wurden mittels Durchflußzytometrie hinsichtlich ihrer Bindung/Internalisierung an VPAC1-überexprimieren-den Zellen getestet. Diese Ergebnisse führten zur Identifizierung von VIP Aminosäureresten, die für die Wechselwirkung mit VPAC1 essentiell sind und lieferten weiterhin Hinweise über eine vorwiegend helikale Struktur des Rezeptor-gebundenen VIPs. Durch Einbau des Farbstoffs an alle VIP-Reste wurden die für die Wechselwirkung mit VPAC1 günstigen Positionen ermittelt. In Kompetitionstudien und cAMP-Assays ausgewählter Farbstoff-markierter VIP-Konjugate wurde demonstriert, daß sowohl die Spezifität als auch die Produktion von cAMP mit Hilfe der Modifikation der Farbstoffposition gesteigert werden konnte. Für die in Rattenleber getestete metabolische Stabilität der VIP-Analoga zeigte die Farbstoffposition nur einen geringen Einfluß. Die metabolische Stabilität konnte jedoch durch eine einzige Modifikation an Position 8 (Asp8 ® Arg8) erhöht werden. Weiterhin wurde das [Arg8]-VIP-Analogon als Kontrastmittel in in vivo Imaging-Experimenten mit VPAC1-überexprimierenden Tumoren inokulierter Mäuse appliziert. Hierbei wurden die Ergebnisse der Stabilitätstests in Rattenleber bestätigt. Das N-terminal farbstoffmarkierte [Arg8]-VIP-Derivat zeigte gegenüber dem nativen N-terminal markierten VIP-Konjugat eine höhere Halbwertszeit in vivo. Darüber hinaus konnte mit [Arg8]-VIP ein höherer Fluoreszenzkontrast zwischen normalen und Tumorgewebe induziert werden.
Abstract (eng):
Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) is a 28meric neuropeptide with a broad range of biological activities which are mediated via binding to the heptahelical transmembrane receptors VPAC1 and VPAC2. Since VPAC1 is overexpressed on the surface of numerous tumour cells, VIP coupled with signal structures like fluorescence dyes is an interesting target for the tumour detection in the near-infrared range. The use of VIP in tumour diagnosis is limited due to the rapid proteolytic degradation and therefore suggests need for optimised VIP-analogues with enhanced stability. In the present work a complete substitutional analysis of VIP N-terminally labelled with carbocyanine dyes was performed. For that reason a new synthetic strategy has been developed, which allows the parallel production of soluble VIP-dye conjugates using the spot synthesis technique. The resulting 560 derivatives were tested for binding and internalisation using VPAC1-overexpressing cells by means of flow cytometry. Based on these results a VIP binding motif has been delineated, which facilitates the modification of VIP concerning stability enhancement and preservation of binding characteristics. Using a dye-walk the dye-coupling positions beneficial for cell binding were identified. Radioactive competitions studies and cAMP assays of selected dye-labeled VIP-conjugates demonstrated that specifity as well as production of cAMP or biological activity has been increased by alteration of the dye-position. For increasing metabolic stability of labelled VIP-analogues the dye-position showed little influence. But is has been shown that stability of VIP was increased by only one modification at position 8 (Asp8®Arg8). Furthermore [Arg8]-VIP-derivative has been used as a contrasting agent in in vivo-Imaging experiments with VPAC1-overexpressing tumours inoculated in mice. Here the results of stability test in rat liver extract were confirmed. N-terminally dye-labelled [Arg8]-VIP analogue revealed higher half-life-time in vivo towards N-terminally labelled native VIP-derivative. In addition the [Arg8]-VIP induced a higher tumour contrast between normal and tumour tissue.
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