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Dissertation

Autor(en): Kaishan Liu
Titel: Etablierung der Echtzeit-Fluoreszenz-PCR zur Bestimmung des BCL-2-Transkriptes bei akuten myeloischen Leukämien
Gutachter: Andreas Neubauer; Christian A. Schmidt; Wolfgang Siegert
Erscheinungsdatum: 22.04.2003
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10018764)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): Die Echtzeit-Fluoreszenz-PCR, BCL-2 Gen, Akute myeloische
Schlagwörter (eng): Real time fluorescence PCR, Bcl-2 gene, Acute myeloid leukemia, Chemoresistance
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
Zitationshinweis: Liu, Kaishan: Etablierung der Echtzeit-Fluoreszenz-PCR zur Bestimmung des BCL-2-Transkriptes bei akuten myeloischen Leukämien; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité , publiziert am 22.04.2003, urn:nbn:de:kobv:11-10018764
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Abstract (ger):
Das BCL-2 Gen wurde als Onkogen der t (14;18)(q32;q21)-Translokation bei follikulären Non- Hodgkin-Lymphomen identifiziert. Die biologische Wirkung des BCL-2 Proteins liegt in der Hemmung der Apoptose. Bei der AML wird eine vermehrte BCL-2 Expression und eine dem- entsprechend verminderte Apoptose bei unreifen malignen myeloischen Vorläuferzellen gefun- den. Diese Krankheit ist teilweise auch chemoresistent. Goldstandard der Induktionstherapie bei AML ist eine Kombination aus Ara-C und Idarubicin, welche Doppel- und Einzelstrang- brüche der DNA induzieren. Apoptose der Leukämiezellen wird durch Schädigung der DNA ausgelöst. BCL-2 kann die Zellen durch Hemmung der Apoptose schützen, indem es die Cy- tochrom-C-Freisetzung blockiert. Darüber hinaus befinden sich die BCL-2- überexprimierenden Zellen in der G0-Phase und sprechen dabei schlecht auf die Chemothera- pie an. Deshalb stellt BCL-2 den Leukämiezellen "doppelten" Schutz zur Verfügung. BCL-2 spielt somit eine wichtige Rolle bei der Chemoresistenz. Ob ein Therapieprotokoll in der Be- handlung der AML effektiv ist, schlägt sich in der Kinetik der zunehmenden oder abnehmen- den BCL-2-Transkripte nieder. Zur Kontrolle des BCL-2-Transkriptes ist die quantitative PCR der qualitativen PCR überlegen. Die Quantifizierung dieses Transkriptes wurde mittels Echtzeit-Fluoreszenz-PCR realisiert. Bei der Echtzeit-Fluoreszenz-PCR wird die Reaktion im geschlossenen Reaktionsgefäß durchge- führt, sodass die Gefahr von Kontamination minimiert werden kann. Da keine Post-PCR Schrit- te nötig sind, wird die Überprüfung zahlreicher Proben durch ein 96-well-Format innerhalb eines Laufes ermöglicht. Die Echtzeit-Fluoreszenz-PCR garantiert ihre Spezifität durch eine spezifi- sche Sonde-Zielsequenz-Bindung und erlaubt eine exakte Quantifizierung der BCL-2- Transkriptzahl. In der vorliegenden Arbeit wurde die BCL-2-Expression in 53 AML-Fällen mittels Echtzeit- Fluoreszenz-PCR untersucht. Das ?-Actin Gen wurde als Referenzgen benutzt. Für die BCL-2- Expression wurde eine Ratio aus der Transkriptzahl des BCL-2 Gens und des ?-Actin Gens ge- bildet. Bei 53 AML-Fällen, die den sieben AML-Subtypen zugeordnet werden konnten(FAB M0-M7), konnte eine BCL-2-Expression nachgewiesen werden. Trotz der unterschiedlich hohen BCL-2-Expression bei diesen Patienten, ergab sich keine signifikante Korrelation zwischen der BCL-2-Expression und den FAB-Subtypen. Außerdem wurde die BCL-2-Expression in T- Zellen, B-Zellen und Granulozyten aus 5 AML-Patienten nachgewiesen. Die BCL-2-Expression wurde nicht von den Subpoplationen der mononukleären Zellen wie z.B. T-Zellen, B-Zellen, Granulozyten beeinflusst. Bei sieben Patienten wurden Proben im Verlauf untersucht. Dabei korrelierte eine hohe oder ansteigende BCL-2-Expression mit einem Rückfall der AML. Die Anzahl der untersuchten Proben im Verlauf ist jedoch zu klein, um definitive Schlußfolgerungen zu ziehen. Eine prospektive Untersuchung von größeren Patientenzahlen erscheint sinnvoll.
Abstract (eng):
The bcl-2 oncogene was discovered by virtue of its association with the translocation, t(14;18) (q32;q21), observed in most follicular lymphomas. The bcl-2 protein is a 26 kDa integral membrane protein which functions by enhancing cell viability through the inhibition of apoptotic death. Acute myeloid leukemia is a lethal malignant disease characterized by an abnormal proliferation and differentiation of myeloid progenitor cells. The bcl-2 oncogene contributes to leukemogenesis by prolonging the life span of defected progenitor cells. Although the expression of bcl-2 in blast cells of acute myeloid leukemia is heterogeneous, a significant proportion of blast cells are shown to have high bcl-2 levels. The highest bcl-2 levels are found in cells that grow autonomously in vitro and also in blast cells expressing the CD34 surface antigen. These groups of AML patients are tranditionally the ones in which the prognosis is poor, because most of the chemotherapeutic agents like cytosine-arabinoside (Ara-C) exert their effect by triggering apoptosis. The high level of the bcl-2 gene that inhibits apoptosis is implicated in the resistance of AML blast cells to chemotherapy and leads to unfavorable prognosis. In this study, a real time fluorescence PCR assay was used to monitor the expression of the bcl-2 transcript in the therapeutic course of AML patients. By applying this rapid new developed quantitative method, the changes of the bcl-2 transcript with chemotherapy can help to evaluate the efficacy of therapeutic interventions in AML. The real time fluorescence PCR has many advantages over traditional measures. First, the assay is extremely rapid because post-PCR processing steps are unnecessary. All relevant data are collected real time during the course of a 2h PCR cycle program; data analysis can be completed in less than 10 min. Second, the assay from reaction set-up to data collection and analysis is a closed-tube system, which reduces the risk of false positive resulting from PCR product carry- over contamination and eliminates variation from additional pipetting steps. Finally, the real time fluorescence PCR is highly specific for the gene target of interest. Here the expression levels of the bcl-2 gene were measured in 53 patients with acute myeloid leukemia and normalized by ?-actin, a house-keeping gene expression as endogenous reference. The bcl-2/?-actin ratio from the 53 patients with AML was various, but not related to FAB subtypes. And also, this transcript ratio was not affected by mononucleated cell types. The samples from seven patients were measured to evaluate the association between the bcl-2 expression and the responsiveness of AML patients to the chemotherapy. The high or gradual elevation of the bcl-2 expression demonstrated the loss of effect in update-therapy protocol and the relapse in AML patients. Although the amount of samples are not large enough to reach the final conclusion, it is of significance that a number of patients will be analyzed in the future.
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Generiert am 29.07.2014, 16:11:01