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Dissertation

Autor(en): Kelvin Eckert
Titel: Cloning and characterization of two glycosidases from the acidothermophile Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009
Gutachter: Erwin Schneider; Evert Bakker; Rainer Borriss
Erscheinungsdatum: 06.02.2004
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10021143)
Fachgebiet(e): Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter (ger): Alicyclobacillus, Endoglucanase, acidophil, thermophil
Schlagwörter (eng): Alicyclobacillus, endoglucanase, acidophile, thermophile
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Zitationshinweis: Eckert, Kelvin: Cloning and characterization of two glycosidases from the acidothermophile Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 06.02.2004, urn:nbn:de:kobv:11-10021143
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Abstract (ger):
Zwei Glykosylhydrolasen des acidothermophilen Bakteriums Alicyclobacillus acidocaldarius konnten charakterisiert werden. Die jeweiligen Gene wurden kloniert und sequenziert. Das intrazelluläre Enzym CelA und das extrazelluläre Enzym CelB könnten zusammen eine tragende Rolle im Abbau von beta-1,4-verknüpften Polysacchariden spielen. Ein Gen, welches für eine beta-1,4-Endoglucanase (CelA) kodiert, wurde kloniert und überexpremiert. Das Enzym wurde gereinigt. Das Protein besitzt eine Immunoglobulin-ähnliche Domäne, jedoch keine Cellulosebindedomäne. Zusammen mit den Sequenzähnlichkeiten der katalytischen Domäne zeigen diese Merkmale, daß das Protein zur Familie 9, Untergruppe E1 der Glykosylhydrolasen gehört. CelA zeigte höchste Aktivität gegenüber beta-1,4-Glucanen, besaß jedoch auch Aktivität gegen Haferspelzenxylan. Das Enzym hatte ein pH optimum von 5.5 und ein Temperaturoptimum von 70 °C. Im Protein waren zwei Zink- und zwei Calcium-Ionen gebunden, die wahrscheinlich wichtig für die Temperaturstabilität sind. Gegenüber p-Nitrophenylglykosiden ergab sich ein überraschendes Hydrolysemuster: Höchste Aktivität wurde auf dem Cellobiosidderivat gefunden, eine niedrigere Aktivität fand sich auf dem Cellotetraosederivat, wohingegen keine Aktivität auf den Glucose- und Cellotriosederivaten gemessen wurden. Das Hydrolysemuster führte zu dem Schluß, daß in CelA die Bindung von beta-1,4-Glucanen entweder auf der nicht reduzierenden Seite der -2 Substratunterbindestelle sterisch verhindert wird, oder alternativ zwei starke Substratunterbindestellen -1 und -2 vorhanden sind. Es wurde kein Signalpeptid zur Markierung des Proteins für die Translokation über die Membran gefunden. Zusammen mit der hohen Aktivität gegenüber Oligosacchariden, dem fast neutralen pH Optimum und der Inaktivierung bei niedrigem pH, deutet dies auf eine Rolle des Proteins als cytoplasmatisches Enzym zum Abbau importierter Oligosaccharide hin. Ein zweites Enzym mit Xylanase- und Cellulaseaktivität wurde zunächst aus A. acidocaldarius Kulturen gereinigt. CelB besaß eine molekulare Masse von 100 kDa und konnte nur mit Hilfe von Detergenz von den Zellen abgelöst werden. Klonierung und Sequenzanalyse des entsprechenden Gens ergaben einen offenen Leserahmen, welches für ein Präprotein kodierte, das ein typisches Sec-abhängiges Signalpeptid besaß. Gereinigtes, rekombinantes CelB und eine verkürzte Variante, der die letzten 203 Aminosäuren fehlten, zeigten Enzymaktivitäten, die dem Wildtypprotein ähnlich waren. Ein niedriges pH-Optimum von 4 wurde bestimmt. Auch die Stabilität war bei niedrigem pH hoch, wobei das Enzym nach Inkubation über nacht bei pH 1.5 bis 7 eine Restaktivität von 80 % aufwies. Das Temperaturoptimum betrug 80 °C. Bei dieser Temperatur war das Enzym auch stabil und zeigte nach 1 h 60 % Restaktivität. CelB hatte die Spezifität eines Endoenzyms, jedoch wurden nach längeren Inkubationszeiten Cellobiose und Xylobiose aus Cellulose bzw. Xylan freigesetzt. Das Enzym gehörte zur Familie 51 der Glykosylhydrolasen, aber es war erst der zweite Eintrag dieser Familie mit typischer Endoglucanaseaktivität. CelB hatte höchste Sequenzähnlichkeit mit der zweiten Endoglucanase, EGF aus Fibrobacter succinogenes, wobei diese beiden Proteine eine markante Gruppe im phylogenetischen Baum dieser Familie bildeten. Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung der katalytischen Domänen ergab, daß CelB in Übereinstimmung mit der Anpassung an einen niedrigen pH-Wert, weniger geladene Aminosäuren als die neutrophilen Enzyme der gleichen Familie besitzt. Wildtyp-CelB und unverkürztes, rekombinantes CelB waren nur in Anwesenheit von Detergenz löslich. Dagegen war das verkürzte CelB Protein vollständig in Wasser löslich. Daher wird eine Rolle der C-terminalen Region bei der Zellassoziation nahegelegt. Dieser hydrophobe Bereich zeigte lokale Übereinstimmungen der Aminosäuresequenz mit einer hydrophoben Region einer Amylase aus dem gleichen Organismus.
Abstract (eng):
Two glycoside hydrolases from the thermoacidophilic bacterium Alicyclobacillus acidocaldarius were characterized and the corresponding genes cloned and sequenced. Together the intracellular enzyme CelA and the extracellular enzyme CelB may play a major role in the degradation of beta-1,4-linked polysaccharides. A gene encoding a beta-1,4-endoglucanase (CelA) was cloned and the enzyme overexpressed and purified. The protein contained an immunoglobulin-like domain but lacked a cellulose-binding domain. In conjunction with sequence similarities of the catalytic domain these features demonsrated the protein to be a member of glycoside hydrolase family 9, subgroup E1. CelA was most active against substrates containing beta-1,4-linked glucans, but also exhibited activity against oat spelt xylan. It displayed a pH optimum of 5.5 and a temperature optimum of 70 °C. The protein was found to contain one zinc and two calcium ions, likely to be important for temperature stability. It showed a striking pattern of hydrolysis on p-nitrophenyl glycosides, with highest activity on the cellobioside derivative, some on the cellotetraoside derivative and none on the glucoside and trioside derivatives. The hydrolysis patterns led to the conclusion that CelA contained a steric block for beta-1,4-linked glucans on the non reducing side of subsite -2 or, alternatively, two strong binding sites -1 and -2. No signal peptide for transport of CelA across the membrane was detected. This, together with high activity on oligosaccharides, a near neutral pH optimum, and inactivation at low pH, suggests a role for the protein as a cytoplasmic enzyme for the degradation of imported oligosaccharides. A second enzyme with xylanase and cellulase activity was purified from A. acidocaldarius cultures. CelB displayed a molecular mass of 100 kDa and could only be removed from cells with the help of detergent. Cloning and sequence analysis of the corresponding gene revealed an ORF encoding a preprotein with a typical sec-dependent signal peptide. Purified recombinant CelB and a truncated varient lacking the C-terminal 203 amino acid residues displayed enzymatic properties similar to the wild-type protein. A low pH optimum of 4 was found. Stability was also high at low pH, the enzyme retaining 80 % of activity after incubation over night from pH 1.5 to 7. The temperature optimum was 80 °C, a temperature at which the enzyme was also stable, showing 60 % residual activity after 1 h. CelB displayed an endo mode of action, but release of cellobiose and xylobiose from cellulose and xylan, respectively, was observed after prelonged periods of incubation. CelB belonged to glycoside hydrolase family 51, but it was only the second entry in this family with activity typical of an endoglucanase. Highest sequence similarity was found towards the other endoglucanase, EGF from Fibrobacter succinogenes, the two forming a distinct group in the phylogenetic tree of this family. Analysis of the amino acid composition of the catalytic domains demonstrated that CelB contains fewer charged amino acids than its neutrophilic counterparts, which is in line with adaptation to low pH. Wild-type and full-length recombinant CelB were soluble only in detergent. In contrast, truncated CelB was completely water soluble, suggesting a role of the C-terminal region in cell association. This C-terminal hydrophobic region displayed local sequence similarities to a hydrophobic region of an amylase from the same organism.
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Generiert am 01.10.2014, 05:06:55