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Habilitationsschrift

Autor(en): Horst Rudolf Laube
Titel: Aspekte der Angiogenese durch Angiogenin
Gutachter: Hermann Haller; K.-L. Schulte; Wolfgang Konertz
Erscheinungsdatum: 18.03.1996
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10021334)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (eng): Bio-technology, Tissue-engineering, Angiogenesis, Growth factors
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
Zitationshinweis: Laube, Horst Rudolf: Aspekte der Angiogenese durch Angiogenin; Habilitationsschrift, Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité , publiziert am 18.03.1996, urn:nbn:de:kobv:11-10021334
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Abstract (ger):
In der vorliegenden Arbeit wurden einige Aspekte der Angiogenese unter besonderer Berücksichtigung des Wachstumsfaktors Angiogenin untersucht. In der Sektion I der Arbeit wird ein standardisiertes Tiermodell in der Ratte vorgestellt, das die Wirkung angiogenetischer Faktoren zur Stimulierung der Angiogenese in ischämischen Geweben quantitativ erfaßt. Damit wurde ein in vivo Modell geschaffen, das die quantitative Beurteilung der therapeutischen Effekte von lokal applizierten Wachstumsfaktoren zur indirekten Revaskularisation ischämischer Gewebe erlaubt. Bereits 1,9 ng des Wachstumsfaktors Angiogenin, lokal appliziert, stimulierten 07 Tage nach Ischämieinduktion die Angiogenese signifikant. Gesamtgefäßanzahl und Kapillaren pro mm 2 waren nach Angiogeningabe signifikant höher. Langzeitbeobachtungen bis 70 Tage nach Ischämieinduktion zeigten, daß die Regulation der Angiogenese einer gedämpften sinusförmigen Schwingung entspricht, deren Amplitude und Frequenz durch Angiogeninapplikation im Vergleich zu den Kontrollen deutlich gesteigert wurde. Dieser Trend ließ sich abgeschwächt auch bei alleiniger lokaler Applikation von Collagen I ohne Gabe eines Wachstumsfaktors nachweisen. Bei dem Vergleich der Dosis-Wirkungsbeziehung von Angiogenin und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) erwies sich Angiogenin zur Stimulation der indirekten Revaskularisation 2,5-mal potenter. 10 ng Angiogenin stimulierten signifikant die Angiogenese 07 Tage nach Applikation. 250 ng bFGF und 100 ng Angiogenin stimulierten jeweils hoch signifikant die Gefäßneubildung. Der initiale angiogenetische Effekt von bFGF und Angiogenin beruht auf der Neubildung haupt-sächlich von Kapillaren. In der Sektion II wird eine Methode zur Beschichtung kleinkalibriger Gefäßprothesen mit Wachstumsfaktoren beschrieben und ein Tiermodell in White New Zealand Kaninchen zur Testung der Offenheitsrate der Gefäßprothesen in vivo vorgestellt. Die "patency rate" der im-plantierten 5 cm langen und im Durchmesser 2 mm messenden PTFE-Prothesen war auch mit angiogenetischer Beschichtung für klinische Zwecke nicht ausreichend. Offenheitsraten von 24 Stunden wurden mit der kombinierten angiogenetischen Beschichtung der Prothesen mit 1 µg bFGF und 285 µg Angiogenin erreicht. Alle anderen Beschichtungen zeigten eine wesentlich kürzere Offenheitsrate. Prothesen mit alleiniger Angiogeninbeschichtung (285 µg) blieben 8 Stunden offen. Prothesen mit alleiniger Beschichtung mit bFGF (1 µg) waren bereits nach 6 Stunden verschlossen. Die schlechteste Offenheitsrate mit nur 2 Stunden bzw. nur 1 Stunde wiesen die nur mit Heparin (100 E) bzw. nur mit Gelatine beschichteten Prothesen auf. Die Verwendung des Matrixfaktors Gelatine als Träger der Angiogenesefaktoren zur Beschichtung der Prothesen war aufgrund seiner hohen Thrombogenität hauptsächlich für die schlechte Offenheitsrate verantwortlich. In der Sektion III wird eine Methode zur Herstellung modifizierten Angiogenins vorgestellt. Durch Phosphorylierung der Aminosäure Serin im Angiogeninmolekül durch Proteinkinase C, ließ sich ein weniger kationisches Angiogenin in vitro herstellen, daß im alkalischen Milieu (bei pH 8) instabil war. Mit der Phosphorylierung durch Proteinkinase C ließen sich Phosphorylie-rungsraten für Angiogenin von bis zu 49 % erzielen. Höhere Phosphorylierungs-raten wurden mit der Proteinkinase C bei der Phosphorylierung von Histon V S mit über 50 % und von bFGF mit 84 % erzielt. Die spezifische Aktivität der Proteinkinase C betrug 2,7 µmol/min/mg bei Histon V S als Substrat. Die Michaelis-Konstanten wurden für Angiogenin mit km = 50 µM, für bFGF mit km = 3,3 µM und für Histon V S mit km = 10,0 µM be-stimmt. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit lag dabei für die Phosphorylierung von Angiogenin bei vmax = 120 pmol/min/mg, von bFGF bei vmax = 100 pmol/min/mg und von Histon V S bei vmax = 66,7 nmol/min/mg. Die im Abschnitt 3 formulierten Fragen 1–12 lassen sich zusammenfassend wie folgt beantworten: 1. Ist die Wirkung angiogenetischer Faktoren in einem standardisierten Tiermodell quantifizierbar? Ja. Das an männlichen Lewis Inzuchtratten standardisierte Tiermodell erlaubt die quantitative Untersuchung der angiogenetischen Potenz von Wachstumsfaktoren zur indirekten Revaskularisierung ischämischer Gewebe in vivo. 2. Welche Langzeitwirkung hat Angiogenin in vivo bei der Revaskularisierung ischämischer Gewebe im standardisierten Tiermodell? Die initiale Stimulation der Angiogenese 07–14 Tage nach Applikation von Angiogenin besteht in der Neubildung von Kapillaren. Im weiteren Verlauf tritt die Zunahme der Prä-kapillaren in den Vordergrund. 3. Über welchen Zeitraum lassen sich im standardisierten Tiermodell in vivo angiogenetische Effekte von lokal appliziertem Angiogenin nachweisen? 1,9 ng Angiogenin stimulierten die Angiogenese 07 Tage nach Applikation signifikant (p £ 0,05). Bis 70 Tage nach der Gabe von Angiogenin war im Vergleich zu den Kontrollen eine Stimulation der Angiogenese erkennbar. 4. Gibt es für die angiogenetische Wirkung von Angiogenin und bFGF in vivo eine Dosis-Wirkungsbeziehung? Ja. Im vorliegenden Tiermodell betrug die optimale Dosis zur Stimulation der Angiogenese für bFGF 250 ng. Für Angiogenin lag die optimale Dosis zwischen 10 und 100 ng. 5. Sind Angiogenin und bFGF in ihrer angiogenetischen Potenz gleich? Wenn nicht, worin unterscheiden sie sich? Angiogenin erwies sich als 2,5-mal stärker gefäßneubildend als bFGF im vorliegenden Tiermodell. Beide Wachstumsfaktoren stimulierten in optimaler Dosis die Angiogenese 07 Tage nach Ischämieinduktion hoch signifikant (P < 0,002). Der initiale Effekt beider Wachstumsfaktoren bestand in einer Stimulierung der Neubildung von Kapillaren. 6. Lassen sich die angiogenetische Wirkung von bFGF und Angiogenin zur indirekten Vaskularisierung nutzen? Die Anwendung von rekombinantem humanem Angiogenin und bFGF wies für beide Wachstumsfaktoren eine ausgeprägte Stimulation der indirekten Revaskularisation im verwendeten Tiermodell nach. Eine gleichartige, jedoch möglicherweise nicht gleich starke Reaktion ist bei der Anwendung dieser humanen Wachstumsfaktoren am Menschen zu er-warten. Ein Ausnutzen der angiogenetischen Potenz dieser Faktoren zur gezielten therapeutischen Stimulation der indirekten Revaskularisation beim Menschen, z. B. bei Durchblutungsstörungen des Herzens oder anderer Körperregionen erscheint sinnvoll und vielversprechend. 7. Sind angiogenetische Faktoren, insbesondere Angiogenin und bFGF allein oder in Kombination zur Verbesserung der Biokompatibilität schmallumiger synthetischer, nicht biologischer Gefäßprothesen geeignet? Bei insgesamt für klinische Zwecke noch unbefriedigender Offenheitsrate der angiogenetisch beschichteten PTFE-Prothesen mit einem Durchmesser von 2 mm war eindeutig zu erkennen, daß die Kombination von Angiogenin und bFGF der alleinigen Beschichtung mit nur einem Wachstumsfaktor oder nur mit Heparin überlegen ist. 8. Ist mit angiogenetisch beschichteten Gefäßprothesen eine Endothelialisierung der Prothese in vivo und in situ möglich? Die erzielten Resultate mit angiogenetisch beschichteten Gefäßprothesen ließen keine in vivo/in situ Endothelialisierung an den implantierten Prothesen aufgrund der schlechten Offenheitsrate von maximal 24 Stunden nachweisen. Weitere Untersuchungen mit weniger thrombogenen Matrixfaktoren in der Kombination auch mit anderen Wachstumsfaktoren werden sicher neue Erkenntnisse bringen. 9. Ist die Modifizierung des Angiogeninmoleküls durch Phosphorylierung mit Proteinkinase C in vitro möglich? Ja. Proteinkinase C war in einem optimierten Phosphorylierungsansatz unter Verwendung ihrer Stimulatoren Ca 2+ , Phosphatidylserin und Diolein in der Lage Angiogenin mit einer Effektivität von bis zu 50 % in vitro zu phosphorylieren. 10. Mit welchen Methoden läßt sich phosphoryliertes Angiogenin nachweisen? Mit der SDS-PAGE ist bei Verwendung von (g-32 P)ATP als Phosphatdonator der Phos-phorylierungsreaktion phosphoryliertes Angiogenin als 32 P-Angiogenin qualitativ und quantitativ nachweisbar. 11. Welche Methoden sind geeignet phosphoryliertes Angiogenin zu isolieren und zu reinigen? Zur Separation von niedermolekularen Verunreinigungen und von überschüssigem Phosphor sind für präparative Zwecke die SEPHADEX G25 Molekularsiebsäulenzentrifugation und die CENTRICON 10 Membranfilterzentrifugation geeignet. Mit der sauren Proteinfällung ließ sich am einfachsten die quantitative Bestimmung phosphorylierten Angiogenins durchführen. 12. Stellt die Phosphorylierung von Angiogenin durch PKC möglicherweise eine physiologische Reaktion in der Wirkungskette von Angiogenin dar? Zur Beantwortung dieser Frage sind weitere Versuche in vivo und in vitro erforderlich. Bisherige Hinweise auf die zentrale Funktion der Proteinkinase C in vielen intra/extra-zellulären Informationsübertragungsprozessen ("second messenger" Reaktionen und "signalling" Prozesse) führen aufgrund der guten Phosphorylierbarkeit von Angiogenin durch PKC zu der Vermutung, daß die Phosphorylierung von Angiogenin durch PKC auch in vivo eine Rolle spielt. Möglicherweise stellt die Phosphorylierung von Angiogenin im molekularen Wirkungsmechanismus von Angiogenin auf der zellulären Ebene z. B. bei der extra/intrazellulären Informationsübertragung, oder bei der Modifizierung der biologischen Aktivität, evtl. auch bei der Inaktivierung von Angiogenin eine zentrale Schlüsselreaktion dar. Die präsentierten Ergebnisse zeigen, daß Angiogenin ein potenter Stimulator der indirekten Revaskularisierung in vivo ist und die Wirkung im standardisierten Tiermodell an der Ratte quantitativ untersucht werden kann. Die Offenheitsrate kleinkalibriger (Æ 2 mm) PTFE-Gefäßprothesen läßt sich im entwickelten Tiermodell an White New Zealand Kaninchen in vivo testen. Die angiogenetische Beschichtung der Prothesen mit dem Matrixfaktor Gelatine als Trägersubstanz der Angiogenesefaktoren und mit Heparin, Angiogenin und bFGF als Mitogenen zeigte keine für klinische Fragestellungen akzeptable Offenheitsrate. Mit der Phosphorylierung von Angiogenin durch Proteinkinase C in vitro unter Verwendung ihrer Stimulatoren Ca 2+ , Phospholipid und Diolein konnten Phosphorylierungsraten von bis zu 50 % erzielt werden. Mit phosphoryliertem Angiogenin steht nun ein weiterer molekular veränderter Wachstumsfaktor für Untersuchungen seiner biologischen Eigenschaften und der angiogenetischen Potenz in vivo und in vitro zur Verfügung.
Abstract (eng):
The growth of new vessels is called angiogenesis. Special growth factors e.g. basic fibroblast growth factor (bFGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) are potent stimulators of angiogenesis in vivo and in vitro. Angiogenin another angiogenic protein was isolated first by Fett et al. 1985 from human carcinoma cells. Part I: The effect of angiogenin to stimulate angiogenesis in ischemic hind legs of inbred male Lewis rats is described. In this new animal model ischemia was induced by the ligature of the femoral artery. To stimulate angiogenesis angiogenic proteins (bFGF, angiogenin) were locally applied and compared to untreated ischemic animals. Already 1.9 ng locally applied angiogenin significantly stimulated the growth of collaterals in ischemic rat hind legs which could be demonstrated already 7 days after the application of angiogenin. The best stimulation of angiogenesis was achieved by the local application of 100 ng angiogenin which was 2.5-fold more angiogenic than 250 ng bFGF in the ischemic rat legs. The angiogenic effect of angiogenin as well as of bFGF was dependent on the applied dose reaching an optimum concerning angiogenin between 10 and 100 ng and for bFGF at 250 ng. Part II: The patency of PTFE vascular grafts with different angiogenic luminal coatings was tested in an animal model. In White New Zealand rabbits the abdominal aorta was replaced by a 5 cm long PTFE vascular graft 2 mm in diameter. Angiogenin and bFGF luminal coated PTFE grafts were 24 hours patent. Angiogenin coated grafts were after 8 hours occluded by a small distal thrombus. bFGF coated grafts were occluded after 6 hours. Heparine coated grafts were totally occluded by a thrombus after only 2 hours and gelatine coated grafts were already occluded after 1 hour. Part III: Protein Kinase C (PKC) isolated from rat brain was able to phosphorylat angiogenin with an effiency reaching 49% using Ca2+, Phospholipids and Dioleins as stimulators of the reaction. Histone V S was phosphorylated to 50% and bFGF to 84% by the same PKC. The determined Michaelis-Menten- Factor was concerning angiogenin km = 50 µM, bFGF km = 3.3 µM and Histone V S km = 10 µM. The separation of phosphorylated angiogenin was possible with the method of Sephadex G25 molecular sieve centrifugation as well as with the Centricon 10 membran centrifugation. The presented results demonstrate that angiogenin is a potent angiogenic protein stimulating the formation of new collaterals which was quantitatively evaluated in a new standardized rat animal model. The stimulation of indirect revascularization by angiogenin may be of therapeutical value in the treatment of ischemic cardio-vascular diseases. The patency of PTFE vascular prostheses 2 mm in diameter can successfully be tested in an animal model in White New Zealand rabbits by replacing the abdominal aorta by a 5 cm long PTFE vascular graft. Testing variant angiogenic luminal coatings of these PTFE grafts showed that a combination of bFGF/angiogenin had the best patency. Phosphorylation of angiogenin with PKC in vitro was possible reaching an effiency of 49% by using the stimulators Ca2+, Phospholipids and Dioleins for the reaction. Phosphorylated angiogenin may be a valuable modified angiogenic protein to study its biological and angiogenic activity in vivo and in vitro and could be helpful in the evaluation of its cellular pathways and receptors. © Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
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