edoc-Server der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Autor(en): Oliver Heyers
Titel: Studien zur Transfektion von Schistosoma mansoni (Digenea)
Gutachter: Frank Seeber; Richard Lucius; Wolfgang Uckert
Erscheinungsdatum: 18.05.2004
Volltext: html (urn:nbn:de:kobv:11-10033494)
pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10033481)
Fachgebiet(e): Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter (ger): GFP, Schistosoma mansoni, transgene Parasiten, Gene Gun, Transfektion, Retrotransposon, LTR, Boudicca
Schlagwörter (eng): transformation, GFP, Schistosoma mansoni, transgenic parasite, particle bombardment, retrotransposon, long terminal repeat, Boudicca
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Zitationshinweis: Heyers, Oliver: Studien zur Transfektion von Schistosoma mansoni (Digenea); Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 18.05.2004, urn:nbn:de:kobv:11-10033481
Metadatenexport: Um den gesamten Metadatensatz im Endnote- oder Bibtex-Format zu speichern, klicken Sie bitte auf den entsprechenden Link. Endnote   Bibtex  
print on demand: Wenn Sie auf dieses Icon klicken, können Sie ein Druckexemplar dieser Publikation bestellen.
Diese Seite taggen: Diese Icons führen auf so genannte Social-Bookmark-Systeme, auf denen Sie Lesezeichen anlegen, persönliche Tags vergeben und Lesezeichen anderer Nutzer ansehen können.
  • connotea
  • del.icio.us
  • Furl
  • RawSugar

Abstract (ger):
Schistosomen verursachen die Tropenparasitose Schistosomiasis mit 250-300 Millionen infizierten Menschen weltweit. Zur Analyse von Genfunktionen, durch die wirksame Medikamente entwickelt werden könnten, wird ein System zur Herstellung transgener Schistosomen benötigt. In dieser Arbeit wurde daher versucht, ein System zur Transfektion von Schistosoma mansoni von der transienten Expression von Reportergenen ausgehend zu entwickeln. Die Funktionalität der hergestellten Plasmide zur transienten Transfektion wurde durch die Expression der Reporter Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) und beta-Galatosidase unter der Kontrolle der schistosomalen Promotoren für das Calreticulin, die 28 kDa-Glutathion-S-Transferase und das 70 kDa-Hitzeschockprotein in cos7-Zellen nachgewiesen. Für den Gentransfer in S. mansoni wurden Mikroinjektion, Elektroporation und Mikroprojektilbeschuss eingesetzt. Der Mikroprojektilbeschuss erwies sich als geeignete Methode, Plasmid-DNA zur transienten Expression von EGFP und beta-Galaktosidase in adulte und larvale Stadien zu transferieren. Da die beobachtete Reportergenexpression schwach war, wurde durch den Einsatz von Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) als Reportergen versucht, das Transfektionsssytem zu optimieren. Außerdem wurden die potentiellen Promotoren für das Cathepsin D und für ein Aktin durch inverse PCR aus genomischer DNA isoliert. Die Funktionalität dieser Promotoren wurde in cos7- bzw. HeLa-Zellen nachgewiesen, eine verbesserte Expression in S. mansoni dagegen wurde mit diesen zwei Promotoren und unter Einsatz von DsRed nicht erreicht. Da S. mansoni sich in vitro nicht kultivieren lässt, muss für die Etablierung eines Transfektionssystems ein in seinen Keimzellen transgenes Stadium in den Lebenszyklus eingeschleust werden. Durch Mikroprojektilbeschuss transfizierte Mirazidien (freilebende Stadien des Parasiten) infizierten Zwischenwirtsschnecken und entwickelten sich zu transgenen Sporozysten, was durch die Transkription von EGFP nachgewiesen wurde. Für eine stabile Integration in das Genom werden unter anderem mobile genetische Elemente eingesetzt. Boudicca ist ein endogenes long terminal repeat (LTR) Retroelement. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es in adulten Würmern, Sporozysten und Zerkarien transkribiert wird. Das LTR kann in vitro als Promotor zur Expression von EGFP eingesetzt werden. Außerdem wurde eine transkribierte Kopie kloniert und analysiert. Die in dieser Arbeit gewonnen Ergebnisse weisen darauf hin, dass Boudicca als Vektor zur stabilen Transfektion von S. mansoni eingesetzt werden kann.
Abstract (eng):
Schistosomiasis caused by schistosomes affects about 250-300 million people world wide. The establishment of a transgenesis system for schistosomes is a pre-requisite to the identification of new drug targets and to the analysis of gene regulation and will add to our knowledge of parasite physiology and development. In this study, plasmids expressing Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) and beta-galactosidase driven by the schistosomal promoters of the calreticulin, the 28kDa-glutathione-S-transferase and the 70kDa-heatshock protein were cloned and successfully tested in cos7-cells. Microinjection, electroporation and particle bombardment were used to introduce plasmid DNA into Schistosoma mansoni. Adult and larval stages of S. mansoni subjected to particle bombardment transiently expressed the reporter genes, although the observed transfection rates were very low. To optimize the transfection system Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) was used as a reporter gene. Furthermore, the schistosomal promoters of the aspartic protease cathepsin D and a cytoplasmatic actin gene were isolated from genomic DNA using inverse PCR. The isolated promoters were able to drive EGFP and DsRed expression in cos7- or HeLa-cells, but improved expression could not be observed in S. mansoni. Due to the complexity of the life cycle S. mansoni cannot be cultured in vitro. In order to develop a transgenesis system for schistosomes, the life cycle must consequently be completed by genetically modified parasites. In this study it was shown that the free-living and mobile miracidium that infects the intermediate host snail could be transformed by particle bombardment and reintroduced in the life cycle using the natural path of infection. Development into transgenic sporocysts was shown through the isolation of EGFP transcripts from intermediate host snails. Mobile genetic elements are used as molecular tools to achieve stable integration of a foreign gene into a genome. Boudicca is an endogeneous long-terminal repeat (LTR) transposon in the schistosomal genome. In this study it was shown that it is transcribed in adult worms, sporocysts and cercariae. The LTR drives EGFP expression in cell cultures. Furthermore, a Boudicca transcript was cloned and analyzed by sequencing. The results suggest that Boudicca can be used as a molecular tool for stable integration of transgenes into the schistosomal genome.
Zugriffsstatistik: Die Daten für die Zugriffsstatistik der einzelnen Dokumente wurden aus den durch AWStats aggregierten Webserver-Logs erstellt. Sie beziehen sich auf den monatlichen Zugriff auf den Volltext sowie auf die Startseite. Die Zugriffsstatistik wird nicht standardisiert erfasst und kann maschinelle Zugriffe enthalten.
 
Bei Formatversionen eines Dokuments, die aus mehreren Dateien bestehen (insbesondere HTML), wird jeweils der monatlich höchste Zugriffswert auf eine der Dateien (Kapitel) des Dokuments angezeigt.
 
Um die detaillierten Zugriffszahlen zu sehen, fahren Sie bitte mit dem Mauszeiger über die einzelnen Balken des Diagramms.
Startseite: 3 Zugriffe HTML: 10 Zugriffe PDF: 6 Zugriffe HTML: 11 Zugriffe PDF: 3 Zugriffe Startseite: 4 Zugriffe HTML: 13 Zugriffe PDF: 13 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe HTML: 13 Zugriffe PDF: 8 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 18 Zugriffe PDF: 6 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe HTML: 16 Zugriffe PDF: 5 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe HTML: 16 Zugriffe PDF: 7 Zugriffe Startseite: 10 Zugriffe HTML: 15 Zugriffe PDF: 8 Zugriffe HTML: 12 Zugriffe PDF: 11 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 16 Zugriffe PDF: 14 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 16 Zugriffe PDF: 12 Zugriffe HTML: 12 Zugriffe PDF: 17 Zugriffe HTML: 15 Zugriffe PDF: 11 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 18 Zugriffe PDF: 26 Zugriffe Startseite: 6 Zugriffe HTML: 20 Zugriffe PDF: 23 Zugriffe HTML: 17 Zugriffe PDF: 20 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 17 Zugriffe PDF: 31 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe HTML: 16 Zugriffe PDF: 18 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 14 Zugriffe PDF: 35 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe HTML: 14 Zugriffe PDF: 23 Zugriffe HTML: 18 Zugriffe PDF: 31 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe HTML: 13 Zugriffe PDF: 24 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 10 Zugriffe PDF: 34 Zugriffe HTML: 12 Zugriffe PDF: 25 Zugriffe HTML: 10 Zugriffe PDF: 21 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 15 Zugriffe PDF: 20 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 18 Zugriffe PDF: 29 Zugriffe HTML: 25 Zugriffe PDF: 44 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe HTML: 18 Zugriffe PDF: 32 Zugriffe HTML: 26 Zugriffe PDF: 52 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 33 Zugriffe PDF: 36 Zugriffe HTML: 19 Zugriffe PDF: 50 Zugriffe HTML: 21 Zugriffe PDF: 74 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe HTML: 17 Zugriffe PDF: 41 Zugriffe
Jul
11
Aug
11
Sep
11
Oct
11
Nov
11
Dec
11
Feb
12
Apr
12
May
12
Jun
12
Jul
12
Aug
12
Sep
12
Oct
12
Nov
12
Dec
12
Jan
13
Feb
13
Mar
13
Apr
13
May
13
Jun
13
Jul
13
Aug
13
Sep
13
Oct
13
Nov
13
Dec
13
Jan
14
Feb
14
Mar
14
Apr
14
May
14
Jun
14
Monat Jul
11
Aug
11
Sep
11
Oct
11
Nov
11
Dec
11
Feb
12
Apr
12
May
12
Jun
12
Jul
12
Aug
12
Sep
12
Oct
12
Nov
12
Dec
12
Jan
13
Feb
13
Mar
13
Apr
13
May
13
Jun
13
Jul
13
Aug
13
Sep
13
Oct
13
Nov
13
Dec
13
Jan
14
Feb
14
Mar
14
Apr
14
May
14
Jun
14
Startseite 3   4 1 2 1 1 10   2 2     2 6   2 1 2 1   1 2     2 2   1   2     2
HTML 10 11 13 13 18 16 16 15 12 16 16 12 15 18 20 17 17 16 14 14 18 13 10 12 10 15 18 25 18 26 33 19 21 17
PDF 6 3 13 8 6 5 7 8 11 14 12 17 11 26 23 20 31 18 35 23 31 24 34 25 21 20 29 44 32 52 36 50 74 41

Gesamtzahl der Zugriffe seit Jul 2011:

  • Startseite – 52 (1.53 pro Monat)
  • HTML – 554 (16.29 pro Monat)
  • PDF – 810 (23.82 pro Monat)
 
 
Generiert am 24.07.2014, 02:22:22