edoc-Server der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Autor(en): Gabriele Schreiber
Titel: Aufreinigung und funktionelle Charakterisierung der peroxisomalen ABC-Transporter Pxa1p-Pxa2p aus Saccharomyces cerevisiae
Gutachter: Thomas Pomorski; Andreas Herrmann; Markus Aebi
Erscheinungsdatum: 19.12.2007
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10084936)
Fachgebiet(e): Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter (ger): ABC-Transporter, Peroxisomen, Fettsäuretransport, ATPase Aktivität, SL-Oleoyl-CoA, Flippase, Rekonstitution
Schlagwörter (eng): ABC-transporter, peroxisomes, fatty acid transport, ATPase activity, SL-Oleoyl-CoA, flippase, reconstitution
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Zitationshinweis: Schreiber, Gabriele: Aufreinigung und funktionelle Charakterisierung der peroxisomalen ABC-Transporter Pxa1p-Pxa2p aus Saccharomyces cerevisiae; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 19.12.2007, urn:nbn:de:kobv:11-10084936
Metadatenexport: Um den gesamten Metadatensatz im Endnote- oder Bibtex-Format zu speichern, klicken Sie bitte auf den entsprechenden Link. Endnote   Bibtex  
print on demand: Wenn Sie auf dieses Icon klicken, können Sie ein Druckexemplar dieser Publikation bestellen.
Diese Seite taggen: Diese Icons führen auf so genannte Social-Bookmark-Systeme, auf denen Sie Lesezeichen anlegen, persönliche Tags vergeben und Lesezeichen anderer Nutzer ansehen können.
  • connotea
  • del.icio.us
  • Furl
  • RawSugar

Abstract (ger):
Die peroxisomalen ABC-Transporter Pxa1p und Pxa2p sind Halbtransporter. Genetische Studien ergaben Hinweise, dass sie zur Bildung aktiver Transporter heterodimerisieren und am Import von langkettigen Fettsäuren in die Peroxisomen von S. cerevisiae beteiligt sind. Es wurden epitopmarkierte Varianten der Proteine als Komplex isoliert. Damit wurde gezeigt, dass Pxa1p und Pxa2p ein stabiles Heterodimer bilden. Zur Charakterisierung der ATP Bindeeigenschaften wurden die Transporter mit 8-azido-[alpha-32P]-ATP inkubiert und kovalent verknüpft. Dabei konnte gezeigt werden, dass Pxa1p und Pxa2p eine unsymmetrische Bindung des ATP Analogons aufweisen. Pxa2p bindet deutlich mehr azido-ATP als Pxa1p, bei sehr ähnlichen Dissoziationskonstanten. Die reduzierte ATP Bindung von Pxa1p spiegelt sich durch degenerierte Sequenzmotive der an der ATP Bindung beteiligten Sequenzen wieder. Die isolierten ABC-Transporter wurden für ATPase Messungen eingesetzt. Sie zeigten eine basale ATPase Aktivität, die durch Zugabe langkettiger Coenzym A aktivierter Fettsäuren, wie Oleoyl-CoA und Palmitoyl-CoA stimulierbar war. Eine Lysin Mutation im Walker A Motiv von Pxa1p hatte keine Funktionalitätseinbuße zur Folge. Dieselbe Mutation bei Pxa2p führte im Wachstumstest auf Festmedium mit Ölsäure als Kohlenstoffquelle zu einem deutlich verlangsamten Wachstum. Diese Ergebnisse korrespondieren mit der beobachteten unsymmetrischen ATP Bindung von Pxa1p und Pxa2p, da bei dem schwächer bindenden Pxa1p die Mutation wirkungslos blieb. Keine Übereinstimmung war bei den ATPase Aktivitätsmessungen der aufgereinigten Mutanten zu verzeichnen. Beide Mutanten zeigten eine unbeeinträchtigte ATPase Aktivität. Die ABC-Transporter wurden in Proteoliposomen eingebaut und für Transportmessungen mit einem Spin-Label markierten Oleoyl-CoA verwendet. Die Transportmessungen zeigten einen ATP abhängigen Transport, woraus geschlossen wurde, dass Pxa1p-Pxa2p tatsächlich Coenzym A Ester langkettiger Fettsäuren transportiert.
Abstract (eng):
The peroxisomal ABC-transporters Pxa1p and Pxa2p are half transporters. Previous genetic investigations have demonstrated that Pxa1p and Pxa2p have to dimerise in order to build a functional transporter, which is very likely involved in the import of long chain fatty acids into peroxisomes of S. cerevisiae. In this work, tagged versions of the proteins were purified as a complex. This proved for the building of a stable hetero dimer. For characterisation of the ATP binding properties, the transporters were incubated and cross linked with 8-azido-[alpha-32P]-ATP. This revealed an asymmetric binding of the ATP analogue. Pxa2p binds much more azido-ATP, than Pxa1p, while the dissociation constants are rather similar. The poorer ATP binding of Pxa1p is reflected by degenerated sequence motifs in the nucleotide binding fold. The purified ABC-transporters have been used for ATPase assays. They showed a basal ATPase activity, which could be stimulated by addition of long chain fatty acid CoAs, like oleoyl-CoA and palmitoyl-CoA. Mutants with a lysine mutation in the walker A motive of Pxa1p led to no functional impairment, while the corresponding lysine mutation in Pxa2p led to reduced growth on agar plates with oleic acid as sole carbon source. The result corresponds with the ATP binding properties of Pxa1p. Because of the poorer ATP binding, even in the wild type protein, the mutation was not supposed to have a big influence. No accordance was found in respect to the ATPase measurements of the isolated mutant proteins. Both mutants revealed unaffected ATPase activity. The purified ABC-transporters were reconstituted in proteoliposomes and used for translocation assays of a spin-labelled oleoyl-CoA derivative. The measurements revealed an ATP dependent transport of the oleoyl-CoA analogue. This led to the conclusion, that Pxa1p-Pxa2p is indeed the transporter of long chain acetyl CoA esters, which were transported in an ATP dependent manner.
Zugriffsstatistik: Die Daten für die Zugriffsstatistik der einzelnen Dokumente wurden aus den durch AWStats aggregierten Webserver-Logs erstellt. Sie beziehen sich auf den monatlichen Zugriff auf den Volltext sowie auf die Startseite. Die Zugriffsstatistik wird nicht standardisiert erfasst und kann maschinelle Zugriffe enthalten.
 
Bei Formatversionen eines Dokuments, die aus mehreren Dateien bestehen (insbesondere HTML), wird jeweils der monatlich höchste Zugriffswert auf eine der Dateien (Kapitel) des Dokuments angezeigt.
 
Um die detaillierten Zugriffszahlen zu sehen, fahren Sie bitte mit dem Mauszeiger über die einzelnen Balken des Diagramms.
Startseite: 6 Zugriffe PDF: 11 Zugriffe PDF: 11 Zugriffe Startseite: 4 Zugriffe PDF: 13 Zugriffe PDF: 10 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe PDF: 15 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe PDF: 14 Zugriffe PDF: 17 Zugriffe PDF: 11 Zugriffe PDF: 17 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe PDF: 13 Zugriffe Startseite: 5 Zugriffe PDF: 23 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe PDF: 23 Zugriffe PDF: 14 Zugriffe PDF: 25 Zugriffe PDF: 25 Zugriffe PDF: 19 Zugriffe Startseite: 4 Zugriffe PDF: 26 Zugriffe PDF: 16 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe PDF: 18 Zugriffe Startseite: 9 Zugriffe PDF: 19 Zugriffe Startseite: 10 Zugriffe PDF: 28 Zugriffe Startseite: 2 Zugriffe PDF: 29 Zugriffe Startseite: 3 Zugriffe PDF: 50 Zugriffe Startseite: 4 Zugriffe PDF: 29 Zugriffe PDF: 15 Zugriffe Startseite: 3 Zugriffe PDF: 28 Zugriffe Startseite: 7 Zugriffe PDF: 40 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe PDF: 53 Zugriffe Startseite: 5 Zugriffe PDF: 31 Zugriffe Startseite: 1 Zugriffe PDF: 42 Zugriffe Startseite: 3 Zugriffe PDF: 33 Zugriffe
Jul
11
Aug
11
Sep
11
Oct
11
Nov
11
Dec
11
Feb
12
Apr
12
May
12
Jun
12
Jul
12
Aug
12
Sep
12
Oct
12
Nov
12
Dec
12
Jan
13
Feb
13
Mar
13
Apr
13
May
13
Jun
13
Jul
13
Aug
13
Sep
13
Oct
13
Nov
13
Dec
13
Jan
14
Feb
14
Mar
14
Monat Jul
11
Aug
11
Sep
11
Oct
11
Nov
11
Dec
11
Feb
12
Apr
12
May
12
Jun
12
Jul
12
Aug
12
Sep
12
Oct
12
Nov
12
Dec
12
Jan
13
Feb
13
Mar
13
Apr
13
May
13
Jun
13
Jul
13
Aug
13
Sep
13
Oct
13
Nov
13
Dec
13
Jan
14
Feb
14
Mar
14
Startseite 6   4   2 1       1 5 2         4   1 9 10 2 3 4   3 7 1 5 1 3
PDF 11 11 13 10 15 14 17 11 17 13 23 23 14 25 25 19 26 16 18 19 28 29 50 29 15 28 40 53 31 42 33

Gesamtzahl der Zugriffe seit Jul 2011:

  • Startseite – 74 (2.39 pro Monat)
  • PDF – 718 (23.16 pro Monat)
 
 
Generiert am 19.04.2014, 09:47:00