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Dissertation

Autor(en): Katja Wagenführ
Titel: Die Typ III Restriktionsendonuklease EcoP15I – eine Struktur- und Funktions-Analyse
Gutachter: Detlev H. Krüger; Christian Schmitz-Linnewerber; Peter Friedhoff
Erscheinungsdatum: 13.03.2009
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-10097610)
Fachgebiet(e): Biowissenschaften, Biologie
Schlagwörter (ger): DNA-Protein-Interaktion, EcoP15I Restriktionsendonuklease, DNA Restriktion, Domänenstruktur, photochemische Vernetzung
Schlagwörter (eng): DNA-protein interaction, EcoP15I restriction endonuclease, DNA restriction, structural domains, photochemical crosslinking
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Zitationshinweis: Wagenführ, Katja: Die Typ III Restriktionsendonuklease EcoP15I – eine Struktur- und Funktions-Analyse; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 13.03.2009, urn:nbn:de:kobv:11-10097610
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Abstract (ger):
EcoP15I gehört zu den heterooligomeren Typ III Restriktionsendonukleasen. Der multifunktionale Enzymkomplex ist aus zwei Modifikations- und zwei Restriktions-Untereinheiten aufgebaut und katalysiert sowohl die Spaltung als auch die Methylierung der DNA. Für die effektive Spaltung der doppelsträngigen DNA benötigt EcoP15I zwei invers orientierte Erkennungsorte mit der DNA-Sequenz 5’-CAGCAG. Die Spaltung erfolgt im oberen Strang 24 bis 26 Basen in 3’-Richtung nach dem Erkennungsort und im unteren Strang 26 bis 28 Basen in 5’-Richtung nach dem Erkennungsort. Aufgrund des bislang größten definierten Abstandes zwischen Erkennungs- und Spaltort ist EcoP15I ein wichtiges Werkzeug in der funktionellen Genomanalyse. Die Aufklärung der Domänenstruktur beider EcoP15I-Untereinheiten durch limitierte Proteolyse zeigte, dass die Restriktions-Untereinheit modular aufgebaut ist. Sie besteht aus zwei stabil gefalteten Domänen, der N-terminalen Translokase- und der C-terminalen Endo-Domäne. Beide Domänen sind durch einen flexiblen Linker verbunden. In der Modifikations-Untereinheit dagegen wurden keine Domänen identifiziert. Durch Insertion von Aminosäuren in und um den Linkerbereich konnten Enzymmutanten hergestellt werden, die bevorzugt die Positionen mit größten Abstand zum Erkennungsort spalteten. Wurden dagegen in dieser Region Aminosäuren deletiert, verloren die Enzymmutanten ihre DNA-Spaltaktivität. Die photochemische Vernetzung von EcoP15I mit spezifischer DNA ergab, dass EcoP15I drei Kontakte zum Phosphatrückgrat des ersten Adenins im Erkennungsort ausbildet. Ein Kontakt wird dabei über die Aminosäure S635 im C-terminalen Teil der Modifikations-Untereinheit hergestellt, zwei weitere entstehen durch die Aminosäuren Y248 und K421 der Restriktions-Untereinheit. Die transmissionselektronenmikroskopische Abbildung des negativ kontrastierten EcoP15I-Enzym zeigte einen symmetrischen Aufbau und stellt somit eine Grundlage für die Entwicklung eines dreidimensionalen Modells dar.
Abstract (eng):
EcoP15I belongs to the hetero-oligemeric type III restriction endonucleases. The multifunctional enzyme complex consists of two modification and two restriction subunits and catalyses both the cleavage and methylation of the DNA. For effective cleavage of the double stranded DNA EcoP15I needs two inversely oriented recognition sites with the DNA sequence 5’-CAGCAG. The cleavage occurs 24 to 25 bases in 3’-direction from the recognition sequence in the top strand and 26 to 28 bases in 5’-direction from the recognition sequence in the bottom strand. Because of the largest known distance between recognition and cleavage site so far EcoP15I is an important tool in functional genomics. The elucidation of the domain structure of EcoP15I restriction as well as the modification subunit by limited proteolysis showed that the restriction subunit has a modular structure. It consists of two stable folded domains, the N-terminal translocase domain and the C-terminal endonuclease domain. Both domains are connected by a flexible linker. In contrast to the restriction subunit no domains could be detected in the modification subunit. Enzyme mutants that were constructed by insertion of amino acids in and around the linker region cleaved preferentially the position with the largest distance between recognition and cleavage site. The enzyme mutants lost their DNA cleavage activity when the amino acids in this region were deleted. The photochemical crosslinking of EcoP15I with specific DNA showed that EcoP15I forms three contacts to the phosphate backbone of the first adenine of the recognition site. One contact is made by amino acid S635 in the C-terminal part of the modification subunit. Two others are made by amino acids Y248 and K421 of the restriction subunit. The transmission electron microscope picture of the negatively stained EcoP15I enzyme showed a symmetric form and therefore it constitutes a basis for the development of a three dimensional model.
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Generiert am 25.10.2014, 10:45:39