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Dissertation

Autor(en): André Dallmann
Titel: Structure and dynamics of fluorophore-labelled DNA helices probed by NMR-spectroscopy
Gutachter: Nikolaus P. Ernsting; Christian Griesinger; Clemens Mügge
Erscheinungsdatum: 11.02.2010
Volltext: pdf (urn:nbn:de:kobv:11-100106129)
Fachgebiet(e): Chemie
Schlagwörter (ger): fluorophor-modifizierte DNA, NMR, Strukturbestimmung, Basenpaardynamik
Schlagwörter (eng): fluorophore-modified DNA, NMR, structure determination, base pair dynamics
Einrichtung: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Lizenz: Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung (CC BY NC ND)
Zitationshinweis: Dallmann, André: Structure and dynamics of fluorophore-labelled DNA helices probed by NMR-spectroscopy; Dissertation, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I , publiziert am 11.02.2010, urn:nbn:de:kobv:11-100106129
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Abstract (ger):
Mittels NMR-Spektroskopie werden Störungen in Struktur und Dynamik von DNA untersucht, die durch den Einbau jeweils eines der beiden Fluorophore 2- Aminopurin (2AP) und 2-Hydroxy-7-nitrofluoren (HNF) hervorgerufen werden. Zu diesem Zweck werden die NMR-Strukturen der modifizierten Duplexe mit der Sequenz 5’-GCTGCAXACGTCG-3’ berechnet. Im Fall X=2AP (13mer2AP) ist die Partnerbase im Komplementärstrang ein T, während gegenüber X=HNF (13mer- HNF) eine abasische Stelle eingeführt wird. Durch den Vergleich der Ergebnisse zum 13mer2AP mit denjenigen des entsprechenden unmodifizierten DNA Doppelstranges (13merRef, X=A) konnte jegliche Änderung eindeutig dem Einbau von 2AP zugordnet werden. Für die NMR-Strukturen von 13merRef und 13mer2AP können kleine aber signifikante, über die gesamte Helix verteilte Strukturstörungen nachgewiesen werden. Experimente zum Iminoprotonenaustausch mit Wasser ergeben, daß der Einbau von 2AP die Basenpaarlebensdauern der 7 zentralen Basenpaare erniedrigt. Die kürzere Lebensdauer des 2AP:T Basenpaares kann jedoch nicht den schnellen Wasseraustausch im Sättigungstransfer- Experiment ohne Zugabe von Basenkatalysator erklären. Als Erklärung für diese Diskrepanz wird eine effizientere intrinsische Katalyse vermutet. Als mögliche, katalytisch aktive Stelle wird das T O4 Atom diskutiert, welches über die große Furche leicht zugänglich ist und das keine Wasserstoffbrückenbindung innerhalb des Basenpaares ausbilden kann. Die übergeordnete Struktur des 13merHNF ist eine B-Form DNA Helix. Die NOE Kreuzpeaks zu den Protonen im HNF können jedoch nur durch zwei verschiedene Orientierungen des HNFs in der helikalen Anordnung beschrieben werden. Das Verhältnis der beiden Orientierungen untereinander wird als 1:1 abgeschätzt. Störungen in der Basenpaardynamik werden durch die höhere Linienbreite und die starke Hochfeldverschiebung des T auf der 5’-Seite ausgehend von der abasischen Stelle angedeutet.
Abstract (eng):
Structural and dynamic perturbations in DNA upon incorporation of either fluorophore, 2-Aminopurine (2AP) or 2-Hydroxy-7-nitrofluorene (HNF), are characterized by NMR spectroscopy. For this purpose the NMR solution structures of the modified DNA duplexes with the sequence 5’-GCTGCAXACGTCG-3’ are solved. For X=2AP (13mer2AP) the partner base in the complementary strand is T, while for X=HNF (13merHNF) an abasic site is introduced to avoid steric strain. By comparing results on 13mer2AP with the corresponding unmodified DNA duplex (13merRef, X=A), any perturbation can be unambiguously assigned to 2AP incorporation. For the NMR solution structure of 13merRef and 13mer2AP small but significant changes in helical parameters are found throughout the helix. Imino proton exchange measurements reveal an extended, distributed effect of 2AP incorporation on the lifetimes of the central seven base pair. However, the reduced base pair lifetime of 2AP:T cannot fully account for the rapid water exchange observed with saturation transfer experiments in the absence of base catalyst. This indicates enhanced intrinsic catalysis. As a possible catalytic site the T O4 atom opposite 2AP is discussed, which is easily accessible through the major groove and lacks a hydrogen bonding partner within the base pair. The overall NMR solution structure is found to be B-DNA. However the NOE cross-peaks involving the HNF residue can only be accounted for by two different orientations of the HNF inside the DNA helical stack. Their population ratio is estimated to be 1:1. Dynamical perturbation is indicated by the increased linewidth and strong upfield shift of the T residue to the 5’-side of the abasic site.
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Generiert am 21.10.2014, 05:16:49